Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז עבור Misfolding מחלות (CMD). רשות התעופה הפדרלית נתמכת על ידי פרס מלגת מחקר בכיר מן החברה, בריטניה של האלצהיימר (גרנט מספר 317, AS-SF-16-003). זנים C. elegans , התקבלו את Caenorhabditis elegans מרכז גנטי (CGC).

1. הכנה של חומרים עבור C. elegans פרוטוקולים
<ol><li>
כדי להכין פתרון מאגר x M9 10, להוסיף 30 גרם של אשלגן monobasic פוספט, 60 גר' dibasic סודיום פוספט ו 50 גר' נתרן כלורי בקבוק autoclavable 1 ליטר.
	<ol>
<li>להוסיף 1 ליטר של מים מטוהרים אוטוקלב- ca. 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>לדלל פי 10 מים מטוהרים, אוטוקלב- ca. 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>כאשר מקורר, להוסיף 1 מ"ל של פתרון של 1 מ' מגנזיום סולפט. הערה: רק 1 x M9 (M9) אמור לשמש תולעת טיפול בשלבים הבאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי להכין את מדיום הגידול נמטודות (עשיר-NGM), מערבבים 2.7 גרם נתרן כלורי, 15.75 גר' אגר, 5.75 גר' קזאין, 900 מל מים מטוהרים, ואת אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
	<ol>
<li>להעביר את המדיום עשיר-NGM תנור חימום (ca. 70 מעלות צלזיוס) אם לא נעשה שימוש באופן מיידי; העשיר-NGM נשמרות מותכת ב ca. 70 מעלות צלזיוס במשך עד 12 שעות לפני שהפך לבלתי שמיש.</li>
		<li>העשיר-NGM לערבב, להוסיף µL 900 של פתרון של סידן כלורי 1 מ', µL 900 של פתרון של 1 מ' מגנזיום סולפט ו 900 µL של פתרון של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל אתנול מוחלטת. הערה: כולסטרול לא דורשת autoclaving לפני השימוש.</li>
		<li>כדי להכין את הפלטות ניסיוני שיש לשמור על אוכלוסיית סינכרונית של גיל, להוסיף µL 92 של 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUDR) 812 מיקרומטר עד 900 מ"ל של עשירים-NGM. הערה: FUDR הוא רעילים ומסרטנים, כך זה חיוני כדי ללבוש nitrile כפפות בנוסף חלוקי מעבדה בטיחות משקפיים. אל תאפשר פסולת כדי להזין כללי פסולת זרם ותיפטר מאת מהשריפה עם מבער אחורי.</li>
		<li>שופכים 20 מיליליטר בלוק העשיר-NGM לתוך צלחת פיטרי סטרילי 9 ס מ כדי ליצור צלחת צמיחה (עשיר-NGM צלחת). שופכים-15 מיליליטר בלוק העשיר-NGM לתוך 9 ס מ עקר פטרי להכין צלחת תנועתיות (מות צלחת). יוצקים 20 מ של עשירים-NGM עם FUDR לתוך צלחת פיטרי סטרילי 9 ס מ כדי ליצור צלחת FUDR. הערה: נפח נמוך אגר הצלחת מות מקלה על המצלמה להתמקד והתולעת מעקב (ראה שלב 3.2.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין את המתח OP50 Escherichia coli , על ידי autoclaving 1 ליטר מרק LB ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולא לחסן עם התרבות starter כשהוא מקורר.
	<ol>
<li>מאפשר התרבות חיידקים לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס לעקר את הצינור שישמש עבור צנטריפוגה.</li>
		<li>העברת החיידק צינורות סטרילי, צנטריפוגה ב 4,600 x g למשך 15 דקות.</li>
		<li>Decant את תגובת שיקוע, שימוש במים סטריליים, להשעות ב 10% של אמצעי האחסון המקורי כדי ליצור 10 מניות OP50 x (מרוכז פי 10).</li>
		<li>לדלל 15 מ"ל של המניה x OP50 10 עד 150 מ"ל ליצירת 1 x OP50, שימוש במים סטריליים, לפני שימוש כדי להפיץ עשיר-NGM צלחות. שימוש ה-x 10 הנותרים לפתרון צלחות FUDR זרע. הערה: הלוחות מות יישאר unseeded, ייעשה שימוש רק בשלב רכישת התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ללוחות זרע עם חיידקים, הפרדת העשיר-NGM, צלחות FUDR.
	<ol>
<li>תחת תנאים סטריליים, להוסיף 350 µL של x 1 OP50 כדי עשיר-NGM צלחות, נמרח בקלות. הערה: אינם מתפשטים עד לקצה הצלחת כמו תולעים יזחל את הצדדים של צלחת, למות.</li>
		<li>תחת תנאים סטריליים, להוסיף 350 µL של 10 x OP50 כדי FUDR לוחות, נמרח בקלות.</li>
		<li>לאפשר את הצלחות יבש, דגירה ב- 20 ° C עבור 2 d לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה של C. elegans לשימוש ב- WF-NTP
<ol><li>לשמור על C. elegans על צלחות עשיר-NGM או על ידי העברת כמות קטנה של אגר המכיל תולעים עם הפנים כלפי מטה על גבי שכבת חיידקי טריים. לשמור על הזנים של C. elegans באופן זה לפני ייזום הפרוטוקולים ניסיוני.</li>
	<li>בטכניקה המעביר (ראה שלב 2.1), צלחות 20 זרעים של כל המתח באמצעות תולעים מוזן היטב, מעורבות הבמה ולאפשר להם לגדול עבור d 2-20 º C.</li>
	<li>לשטוף צלחות 5 המכיל תולעים באמצעות 15 מ"ל של M9 ובריכה בצינור אחד 15 מ"ל. חזור על כל 20 הצלחות של כל זן.</li>
	<li>Centrifuge התולעים ב x 2,000 g למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, וכן להשעות ב 2 מ"ל של פתרון M9.</li>
	<li>להכין 10 מ"ל של פתרון הלבנת על ידי ערבוב 13% נתרן תת-כלורי ו 4 מטר נתרן הידרוקסידי ביחס של 3:2 vol/כרך הערה: פתרון זה אינו דורש autoclaving. רכיבים והן הפתרון שיתקבל הם מאכל, צריך להיות מטופל עם טיפול באמצעות nitrile כפפות. נתרן הידרוקסידי במתינות שמשחית זכוכית ויש לאחסנו בקופסאות פלסטיק.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של פתרון הלבנת כל שפופרת צנטריפוגה ומנערים נמרצות במשך כ 3.5 דקות או עד הקוטיקולה להתמוססות מלאה.</li>
	<li>תחת תנאים סטריליים, לדלל את הדגימות ועד 15 מ"ל M9 צנטריפוגה ב 2,000 x g 2 דק. להסיר את תגובת שיקוע, להשעות ב-15 מיליליטר M9 פתרון.</li>
	<li>חזור על שלב 2.7 6 פעמים, עד רק תולעת הביצים נשארות, הפתרון כבר לא יש ריח של כלור.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות ב x 2,000 g למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, וכן להשעות ב 2 מ"ל של פתרון M9.</li>
	<li>בתנאים סטריליים, להשתמש פיפטה זכוכית סטריליים כדי להעביר 2 מיליליטר M9 המכילים ביצים לתוך כל טוב של צלחת תרביות רקמה 12-ובכן, דגירה ב 20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 16 h. הערה: השתמש צלחות נפרדות עבור כל מאמץ כדי למנוע זיהום לחצות. הצעד המעביר מן הצינורות צנטריפוגה מסייע בארות מרובה כדי למנוע חנק תולעת.</li>
	<li>להעביר את התולעים בקעו בן לילה מן הלוחות 12-ובכן לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל. 3 טיפות של µL 5 של תולעת פתרון ואין לספור את מספר תולעים נוכחים בשלב הזחל הראשונה (L1).</li>
	<li>לחשב את מספר תולעים לכל µL של פתרון.</li>
	<li>זרע L1 תולעים על גבי לוחות עשיר-NGM ב 3,000 תולעים לכל צלחת ולאפשר להם לגדול 2 ימים ב- 20 ° C, עד שיגיעו השלב האחרון של הפרפרים והעשים (L4).</li>
</ol>3. פרוטוקול WF-NTP גנרל
<ol><li>
להוסיף 2.2 מ של כל תרופה המורכבת הריכוז המתאים (כגון 25 או 10 מ"מ עבור תרופות כמו squalamine18 ו bexarotene15, בהתאמה) כדי 6 FUDR צלחות ולאפשר להתייבש בתנאים סטריליים עבור כל הרצוי תולעת זן. הערה: שלב זה חוזר על עצמו עבור כל המתחם תחת בדיקה, ועבור כל הריכוז ממס בכל פעם.<ol>
<li>לשטוף את התולעים מחוץ 5 צלחות עשיר-NGM מוכן בשלב 2.13 באמצעות 15 מ"ל M9 מאגר ולהעביר את התולעים שפופרת צנטרפוגה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 2,000 g למשך 2 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, וכן להשעות ב- 3 מ"ל של M9. קח 3 טיפות של µL 5 של הפתרון M9 המכיל תולעים, לספור את מספר תולעים נוכחים בשלב הזחל האחרון L4.</li>
		<li>לחשב את מספר תולעים לכל µL M9 המאגר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הזחלים L4 זרע 700 על גבי 6 של הלוחות FUDR יבש המכיל תרכובת נתונה, חזור על כל ריכוז של כל מתחם ולאפשר להתייבש בתנאים סטריליים.
	<ol>
<li>דגירה התולעים ב 24 ° C מ- L4 עבור אלה זנים איפה השיתוק תולעת הנגרמת רק על ידי העלאת הטמפרטורה, כגון זן המודעה38. לספור למחרת הזחל L4 כמו D0 של בגרות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הפעל את אורות הבמה עבור המעקב.
	<ol>
<li>לנקות את הבמה זכוכית עם 70% אתנול ולהבטיח כי לא נשאר שאריות גלויות, מכן הסר את מכסה העדשה. לנקות את העדשה הדמיה באמצעות מאבק של אוויר. לוודא כי המצלמה מחובר כהלכה ושהוא מותקן ולהתחיל הקלטה עם התוכנה לכידת התמונה.</li>
		<li>התאם את הגדרות המצלמה כדי להקליט 20 מסגרות/s, עם 16 מונו הקלטת פרמטרים ההתקנה; שיא 1,200 מסגרות, שמירת בתבנית MJPEG בשיעור 95% דחיסה. השתמש ריקה 9 ס"מ פטרי כדי להבטיח כי השלב מוגדר בגובה הנכון ולהתאים אותו במידת הצורך. הערה: להבטיח כי הקצוות של הצלחת אינם גלויים בהקלטה כמו זה יאפשר האלגוריתם 'שמור-מת' לפעול כראוי (איור 1 א').</li>
		<li>תחת תנאים סטריליים, לקחת שתי צלחות שהוכנו בעבר-שלב 3.2 באותם התנאים ועל מות 1 הקרנת צלחת מוכנה בשלב 1.2.4. להוסיף 3 מ"ל של הפתרון M9 לצלחת מות. שימוש אחרים מ 2 ל M9 כדי לשטוף את 1/3 של שטח הפנים של שתי צלחות מוכן בשלב 3.2 לצלחת מות.</li>
		<li>מקם את הצלחת מות המכיל כ- 5 מ של הפתרון M9 ותולעים כ 600 לבמה המעקב. למקד את המצלמה באמצעות כל תולעת ולהתחיל הקלטה.</li>
		<li>עם השלמת ההקלטה, למחוק את הצלחת מות עם התולעים; לסמן את הצלחות FUDR כמו בשימוש פעם אחת ולהחזיר את החממה.</li>
		<li>חזור על הצעדים 3.3.3 ל 3.3.5 כל תנאי הניסוי.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.3.3 כדי 3.3.6 עבור כל נקודת זמן בתוחלת החיים הבוגרים. הערה: ההליכים ההקרנה יכול להתבצע בכל רגע הבוגרת תוחלת החיים של התולעת (ca. 3 שבועות). פרוטוקולים אלה להקל על הקרנת עד 9 נקודות זמן; המחברים ממליצים הקרנת כל יומיים החל מיום א' של בגרות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. אופטימיזציה ללימודי מנה בדידה
<ol><li>
הכן תולעים על ידי וחזור על שלבים 3.1.1 ל 3.1.3.
	<ol>
<li>זרעי ca. 1000 L4 תולעים על גבי לוחות FUDR 5. דגירה הלוחות ב 24 ° C עד D3 של בגרות, לניסויים הקשורים לספירה38 תולעים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
באמצעות פיפטה של זכוכית סטריליים, העברת התולעים מוכן בתנאים סטריליים מהצלחת אל שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 2,000 x g למשך 2 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
	<ol>
<li>להשעות את הפתרון של תולעים ב 1 מ"ל M9 המאגר. להעביר את התולעים צינור microcentrifuge, צנטריפוגה ב x 300 גרם למשך 2 דקות, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
עבור התמרה חושית חלבון, להוסיף µL 40 מהתרכובת משלוח תרביות תאים, µL 20 של חלבון מקורי-הריכוז הרצויה (בדרך כלל 40 מיקרומטר), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
	<ol>
<li>תחת תנאים סטריליים, להשתמש פיפטה זכוכית סטריליים כדי להעביר תולעים מהשלב 4.2.1 לתוך צינור microcentrifuge המכיל חלבונים שעברו אנקפסולציה לתת הנפח הכולל של 1060 µL. המקום צינורות אופקית וללחוץ על סל ד 60 ב 24 ° C רועד חממה במשך 8 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תחת תנאים סטריליים, להוסיף 4 מ"ל של פתרון M9 צלחת מות ולהעביר שפופרת אחת microcentrifuge של תולעים ועוד סמים לצלחת מות.
	<ol>
<li>להגדיר את המעקב על-ידי וחזור על שלבים 3.3 כדי 3.3.2.</li>
		<li>תחת תנאים סטריליים, להוסיף 4 מ"ל של פתרון M9 צלחת מות ולהעביר שפופרת אחת microcentrifuge של תולעים ועוד סמים לצלחת מות.</li>
		<li>מקם את הצלחת מות לבמה המעקב, להתמקד המצלמה כל תולעת, ולהתחיל הקלטה. כשהפעולה תסתיים, לתייג את הצלחת מות ולהגדיר לצד אחד.</li>
		<li>חזור על הצעדים 4.4.1 ו 4.4.3 כל הדגימות.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של זכוכית, להעביר תולעים בתנאים סטריליים מהצלחת מות שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, centrifuge ב 2,000 x g עבור 2 דק העברה supernatant, הסר את צניפה על גבי צלחת FUDR ו אפשר להתייבש בתנאים סטריליים.</li>
		<li>חזור על צעד 4.4.5 כל הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התולעים ב 24 ° C עד D6 של בגרות. הערה: מספר נוגדנים incubations הינן גם אפשריות.</li>
	<li>
להוסיף 3 מ"ל של המאגר M9 לצלחת מות ולהשתמש 2 מיליליטר M9 פתרון לרחוץ את כל התולעים מן צלחת FUDR לצלחת מות.
	<ol>
<li>להגדיר את המעקב על-ידי וחזור על שלבים 3.3 כדי 3.3.2.</li>
		<li>מקם את הצלחת מות לבמה tracker, למקד את המצלמה לפי הצורך, ולהתחיל הקלטה. עם השלמת ההקלטה, למחוק את הצלחת מות או לשחזר אותה לסינון נוסף במידת הצורך.</li>
		<li>חזור על הצעדים 4.6 ל 4.6.2 כל הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ניתוח הנתונים וידאו
<ol><li>
לאחר שרכשה את קטעי וידאו, בחר את הפרמטרים המתאימים התוכנה GUI (איור 2) עבור ניתוח נתונים.
	<ol>
<li>לטעון יחיד או קטעי וידאו מרובים באמצעות הפונקציה גלישה . בחר תיקיית יעד פלט. ודא כי 600 עד 1,200 מסגרות משמשים עבור ניתוח s 30. הערה: בכל טווח של מסגרות ניתן לנתח.</li>
		<li>הכנס פיקסל לגורם ההמרה מ מ, אשר יהיה 0.029 הדמיה של 9 ס מ פטרי ברזולוציה מלאה. בחר 'שמור מת' האלגוריתם מעקב. הערה: הגורם ההמרה יהיה תלוי שדה הראייה בשימוש. התמרת Z האלגוריתם יכול לשמש גם בתור חלופה.</li>
		<li>למלא את הפרמטרים בסעיף Locating (איור 2): Z להשתמש בתמונות = 100, ריפוד Z = 3, Std פיקסלים = 54, סף = 9, פתיחה = 1, סגירת = 2. כוונן את הפרמטרים סינון לגודל מינימום = 20, גודל מרבי = 180, תולעת = 0.94.</li>
		<li>כוונן את הפרמטרים Forming מסלולים : מקסימום מרחק להזיז = 10; אורך מינימום = 150, זיכרון = 10.</li>
		<li>להגדיר פרמטרים כפיפות והמהירות . השתמש 1.8 עבור עיקול הסף, 0 עבור מינימום מתכופף, 150 עבור מסגרות לאמוד מהירות.</li>
		<li>לכוון את התולעת מתה סטטיסטיקה. השתמש 5.0 עבור מקסימום לנצח בדקה ו- 1.0 עבור מהירות מקסימלית.</li>
		<li>בחר את תיקיית הפלט. הגדר את מספר המסגרות של פלט ל- 50. הגדר גודל הגופן 10. הערה: באופן אופציונלי, בחר אחד או יותר אזורים מעניינים (ROIs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדוק את הפרמטרים באמצעות הפונקציה בדוגמה . פלט התמונות לדוגמה וסמנו התולעים גלויים לאורך כל השלבים סף 8 (איור 1).</li>
	<li>השתמש בפונקציה להתחיל את העבודה .</li>
	<li>
לנתח את הקבצים תוצאה של טקסט על-ידי שילוב התוצאות בודדים עבור כל הנתונים (dataset). השתמש ייצוא tsv פונקציה ב- GUI. הערה: באופן אופציונלי, מדדים בודדים של התולעים יכולה להיחשב גם ללימודי אוכלוסייה.<ol>
<li>ניתוח נתונים עם חבילת תוכנה סטטיסטית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי ישנם שאין ניגודי אינטרסים.

בגלל ההתרחבות המהירה של טכניקות, בתחום של מדעי אופטי, עכשיו זה אפשרי לפנות את הדרישה בשיטות אוטומטיות במחקרים C. elegans בדרכים חדשות באופן משמעותי. כתוצאה מכך, מספר דיגיטלי למעקב אחר פלטפורמות20,41,42,43,44,45,46 יש כבר מתוכנן ועשה זמין. בשנים האחרונות על מנת להחליף ספירה ידנית פרמטרים כגון מהירות התנועה, כיפוף תדר, שיתוק קצב, וכן צורות מורכבות יותר של התנהגויות כגון אומגה פונה, ומדידות תוחלת החיים. פלטפורמות אוטומטיות האחרונה שיפרנו בגדול את הפארמצבטית, רגישות של C. elegans מחקרים41 , סיפק נתונים באיכות גבוהה על גדודים קטנים או בעלי חיים אפילו בודדים. החלטנו להאריך האוטומציה של הניתוח של אופן פעולה של תולעת כדי שזה גם אפשרי להעריך על הפנוטיפים של גדודים של אלפי בעלי חיים במקביל. היתרון העיקרי של הגישה של הלומדים התולעת המפחידה היא שהוא מאפשר חשבונאות מהותי ההשתנות הגבוהה של תולעת התנהגות24 ועל העובדה כי לימודי טיפול סמים לעיתים קרובות להוביל סטיות פנוטיפי דקות, אשר קשה לזהות עם מובהקות סטטיסטית מספקת בעת שימוש קבוצה קטנה של בעלי חיים. כוח גבוהה של זיהוי (POD) הוא אכן נחוץ כדי לזהות עם ביטחון כל וריאציה משמעותי בהתנהגות וכדי להגביל את תוצאות חיוביות שגויות25.
. הנה, תארנו סדרה של פרוטוקולים המבוסס על שיטה דיווחו לאחרונה הסינון האוטומטי עבור C. elegans, תולעים נימיות רחב שדה-of-view מעקב רציף (WF-NTP)36. הפרוטוקול המתואר כאן מחולק 5 חלקים. חלקים 1 ו-2 מתארים את הכנת אוכלוסיות גדולות תולעת. שלבים קריטיים הן העקרות של תנאי העבודה והכנה של ריאגנטים, לוחות הדרושים להפעיל את הניסויים. נציין כי, בשל התפוקה מוגברת שסופקו על-ידי פרוטוקול זה בהשוואה לשני הקרנת מתודולוגיות36, הוא גם דורש כמויות גדלות של ריאגנטים; גורם זה צריך להיחשב בקפידה בעיצוב ניסיוני. נציין גם כי הצעד הלבנה היא קריטית צריך להיבדק מראש מספר רב של ביצים, הזחלים בריא נחוצים להפעלת ניסויים אלה. חלק 3 של פרוטוקול זה פרטים כיצד לספק תרופות תולעת מדיה ומסך מלא אוכלוסיות. נציין כי חלק זה של הפרוטוקול תלויה בחריפות המספר של סמים, סמים ריכוזים להיבדק על-ידי המשתמש במקביל. אוטומציה מלאה של תהליך ההקרנה, קירור והקפאה מהירה משמרת את הצעד המגביל התנהגותית תוך התבוננות ריאגנט הכנה, צמיחה, סינכרון של אוכלוסיות גדולות תולעת. השלבים המפתח במהלך ההקרנה התנהגותיות הן התזמונים של ההקלטה ואת כל תולעת הטיפול (למשל, ההעברה של תולעים מן הלוחות NGM פלטפורמת מעקב). פרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה שנועדה לסנן את התולעים עד 9 ימים במהלך חיי הבוגרים; עם זאת, פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים למסך נקודות זמן רבות ככל שהמשתמש רצונות, למשל, ימים רצופים 1836. חלק 4 ואז מדגים את היישום של הפרוטוקול להעברת מולקולות חלבון (למשל, נוגדנים, מלווים מולקולרי) לתוך C. elegans, ומראה איך פרוטוקול מאויר חלקים 1-3 ניתן בקלות להתאמה אישית, בהתאם הרצוי יישום. נדגים איך ניתן להרחיב הליך זה לא רק משלוח של מולקולות כמו סמים, אלא גם עבור המינהל מלווים או נוגדנים מולקולרית37. תחילה ארבעת השלבים (חלקים) מתבצעות תחת תנאים סטריליים, אלא אם כן צוין אחרת. כל הרכיבים נוזלי צריך להיות בלוק לפני השימוש, השלבים הדגירה צריכה להתבצע ב- 70% לחות יחסית. חלק 5, אנו נתאר כיצד להשתמש בחבילת תוכנה הניתנים במשולב עם השלב מעקב. תוכנה זו כבר מותאמים אישית עבור הניתוח של הנתונים WF-NTP הקשורים להתנהגות של אוכלוסיות גדולות תולעת. אנו ממליצים כי המשתמש עוקב אחר ההנחיות קלח ב ניתוח נתונים; עם זאת, פרמטרים אלה תלויות התכונות הספציפיות של קטעי וידאו מוקלט (קרי, fps, שדה ראייה, רזולוציית וידאו, מספר המסגרות רכשה). הפונקציה דוגמה הניתנים GUI תוכנן כדי להקל על ההערכה של הפרמטרים הנכונים לפני הניתוח.
אלה סדרה של הפרוטוקולים מאפשרים לנתח על הפנוטיפים של אוכלוסיות גדולות של C. elegans (כיום עד 5,000 תולעים בודדים במקביל) ביעילות, הפחתת חפצי אמנות לאור ההשתנות מהותי של ההתנהגות של בעלי החיים , מסכים עם מחקרים ראשוניים על כוחו של זיהוי צורך להשיג מובהקות סטטיסטית ללימודים של C. elegans25. פלטפורמת משתמש במערכת מצלמות ברזולוציה גבוהה, מסוגל להקליט תמונות של מספרים גדולים של בעלי חיים במהירות גבוהה, בזמן הקלטת קוהורטות גדולות מרובות בו-זמנית. ביצועים גבוהים של תפוקה גבוהה של פרוטוקול WF-NTP מאפשר לקבוע שינויים קטנים מאוד בהתנהגות תולעת באופן מדויק מאוד. לכן, מתודולוגיה זו מאפשרת גישות חדשות להיחשב חקר הביולוגיה של C. elegans, אלא בנוסף למחקר תרופתי וטיפול רפואי, כגון תפוקה גבוהה הקרנת התרופות, שינויים גנטיים טיפולים. הליך זה יש גם יתרון המאפשר לימודי שיתוק שיבוצע במקביל עם מדידות התנהגותיות אחרות, תכונה מרכזית במחקרים מולקולרי ההקרנה.
התוצאות הושגו עד כה בתוכניות גילוי סמים של המודעה15,34,35 ו- PD18 להדגים את חשיבותה של רכישת נתונים רחב שדה-of-view להגדיל באופן משמעותי המספרים של חיות שניתן לפקח עליהם בניסוי יחיד, בצורה משמעותית ובכך להקטין את השגיאות ניסיוני, מיעיל תוקף סטטיסטי של מחקרים. בעוד הגישה הנוכחי שמתואר פרוטוקול זה התמקדה מיעון אתגרים בתחום גילוי תרופות, אנו מקווים כי המתודולוגיה יאומצו נרחב בקהילה, כי היישום שלה יורחב מתחם גנטי, מחקרים התנהגותיים ולהרחיב את המספר של פנוטיפים שנמצאים כיום לזיהוי.

בערך לפני חצי מאה, סידני ברנר הציג Caenorhabditis elegans (C. elegans) מערכת מודל ללמוד פיתוח ו נוירוביולוגיה, כמו כך קטן (אורך ממ ב 1), תולעים נמטודות שקוף קל לתמרן גנטית וכדי לשמור על מעבדה1. היום, C. elegans משמש ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כולל אפופטוזיס, איתות התא, הטבע של מחזור התא, הכונה, חילוף החומרים, הזדקנות2. יתר על כן, המורכבות הסלולר ורקמות, דפוסי ביטוי חלבון, השימור של המחלה מסלולים בין C. elegans עילאיים (80% של תולעת גנים יש orthologue של האדם), מקושרים עם הפשטות, עלות-תועלת של טיפוח-תרגול, לעשות את זה אורגניזם מודל יעיל ויוו נוטה גנטי תפוקה גבוהה3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , התרופות 13 ,14,15,16 הקרנות. מכל הסיבות האלה, C. elegans כבר מועסקים עבור אפיון נורמלי, הקשורים למחלות מסלולים מולקולריים; בתחום הקשורים ניוון מוחיים, לדוגמה, זה איפשר חקר השפעות ההזדקנות על חלבון צבירת3,4,7,15,17, 18, אפיון היזמים מעכבי של חלבון צבירת3,4,5,6,7,14, 18.
הכושר הכללי של התולעים, המהווה פרמטר התנהגותי חשוב יוגדר בסוג זה של המחקר, ניתן למדוד באופן ידני במגוון דרכים, כגון על-ידי ספירת מספר הגוף מתכופף לכל דקה (BPM)4,6, 19, או על ידי מדידת המהירות של התנועה20,21,22, וכן על ידי מדידת את תוחלת החיים ואת המחירים של שיתוק. למרות המידות ידנית של הגוף מתכופף ומהירות התנועה הובילו תובנות חשובות רבות מגוון של מסלולים מולקולריים, מנגנוני3,4,14,19, 20,23, מבחני ידני נשארים כעת בתפוקה נמוכה מאוד עתירי עבודה, זמן רב בזמן להיות מועדים שגיאות, הטיות אנושי. בעיות אלה מציגים אתגרים ניכרים באוסף של נתונים עם מתח סטטיסטי מספיק כדי להבחין בין שינויים התנהגותיים עדינים. מגבלה זו רלוונטי במיוחד סמים ההקרנה כמו טיפולים עם תרופה פוטנציאליות מולקולות לעיתים קרובות להוביל שינויים פנוטיפי קטן24, לכן דרישה המחקר של מספרים גדולים של בעלי חיים על מנת להשיג תוצאות לשחזור. כדי להמחיש נקודה זו, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי כוח גבוהה של זיהוי (POD) הכרחי כדי להגדיר עם ביטחון שינויים משמעותיים בהתנהגות וכדי להגביל את תוצאות חיוביות שגויות25. כתוצאה מכך מניע חזק בקהילה C. elegans להחליף ספירה ידנית עם מדידות לשחזור, אוטומטית, זמן - ו cost - effective. כדי לענות על דרישה זו, מספר מעבדות לאחרונה פיתחו שיטות רגישות גבוהה מדידות ומעקב תולעת מדויק של מספר גדול של תולעים22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
כדי להרחיב עוד יותר את התהליך של אוטומציה קוהורטות גדולות של בעלי חיים לצורך מדידות סטטיסטית, פיתחנו לאחרונה של תולעים נימיות רחב שדה-of-view מעקב רציף (WF-NTP)15,34 ,35,36, המאפשרת את החקירה בו זמנית של מספר הקריאות הבאות פנוטיפי על אוכלוסיות גדולות מאוד תולעת, גורם מפתח רלוונטיים סטטיסטית זיהוי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר25. לא רק יכול WF-NTP כעת לפקח עד 5,000 בעלי חיים במקביל, אבל הקריאות פנוטיפי כוללים גם פרמטרים מרובים, כולל את קצב משרעת של הגוף מתכופף, את מהירות התנועה, השבר של האוכלוסייה, משותקת ו גודל של בעלי החיים. לכן ניתן בקלות מסך אלפים של תולעים במקביל וכדי לשלב הקריאות שונים לתוך מפת התנהגותית כדי ליצור טביעות אצבע רב-ממדי36. תוכנת קוד פתוח המשויך כתוב פיתון, אשר נדרש גם לתפעל אותו היא לחלוטין להתאמה אישית. ממשק משתמש גרפי (GUI) מסופק גם כדי לאפשר למשתמשים לאמץ טכנולוגיה זו.
כאן, אנו מציגים סדרת פרוטוקולים להמחיש כמה יישומים פוטנציאליים של WF-NTP. בפרט, אנו לדון הממשל של תרכובות, ועד חלבון הרפוי, מולקולות קטנות, מתארים כיצד מסך ההשפעות שלהם ישירות על אוכלוסיות גדולות של תולעים, ובכך להסיר ביעילות את הצורך מדגם קטן תת אוכלוסיות. השימוש WF-NTP למטרה כזו כבר הביא יתרונות משמעותיים בהליכים שמטרתם לעצב תוכניות גילוי סמים של מחלת אלצהיימר (AD)15,34,35 , מחלת פרקינסון (PD)18 שימוש בנתונים ויוו להערכה של מועמדים טיפולית35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans הוא מודל חיות ומבוססת במחקר ביו-רפואי, המועסקים נרחב גנומיקה תפקודית ולימודים הזדקנות. כדי להעריך בריאות וכושר החיות שנבחנה, אחד בדרך כלל מסתמך על המפרט תנועתיות, כגון מדידת מספר גוף עיקולים או את מהירות התנועה. מדידות אלה בדרך כלל כרוכים ספירה ידנית, שהופך אותו מאתגר כדי להשיג טוב מובהקות סטטיסטית, כמו פעם ואת העבודה אילוצים לעיתים קרובות להגביל את המספר של חיות ניסוי 25 או פחות. מאז עוצמה סטטיסטית גבוהה יש צורך להשיג תוצאות לשחזור ולהגביל תוצאות false חיוביות ושליליות כאשר ההשפעות פנוטיפי חלש נחקרות, לאחרונה נעשו מאמצים לפתח פרוטוקולים אוטומטיים התמקד בהגדלת הרגישות של תנועתיות זיהוי והגדרת פרופיל התנהגותי רב פרמטרית. על מנת להרחיב את הגבול של זיהוי לשלב הדרושים כדי ללכוד את השינויים פנוטיפי קטנים כי הם לעיתים קרובות מכריע מחקרים גנטיים, גילוי תרופות, נתאר כאן התפתחות טכנולוגית המאפשרת המחקר של חיות בודדות עד 5,000 בו זמנית, מגביר את עוצמת המידות על-ידי סטטיסטי לגבי 1,000-fold לעומת מבחני ידנית, כ 100-fold לעומת אחרים בשיטות אוטומטיות הזמינות.

הקלות של הפועלים, ניתוח multiparametric, תפוקה גבוהה של פרוטוקול WF-NTP מאוירים (מספרים 1 ו- 2) מאפשר לקבוע שינויים קטנים מאוד בהתנהגות תולעת באופן מדויק מאוד. פלטפורמת ההדמיה מבוססת על באופטו-מכניקה בהזמנה אישית, ניתן להרכיב בעזרת 6 MP בשחור-לבן מצלמה בשילוב עם 16 מ מ אורך מוקד העדשה ברזולוציה גבוהה עבור 1'' חיישן, מואר עם 8'' על ידי תאורה אחורית 8 לבן '' (ראה טבלה של חומרים וצור הפניה גם36 לפרטים נוספים). התוכנה WF-NTP המשויך נכתב ב- Python, פותחה כדי להפעיל על הפלטפורמות של Windows. היא פועלת על מחשב שהורכב מותאם אישית עם מעבד ליבה octa 3.00 ג'יגה-הרץ, 64 ג'יגה-בתים של זיכרון גישה אקראית (RAM). התוכנה נועדה גם parallelize ' עבודה ' ניתוח וידאו המבוסס על ה-RAM של ה-CPU של המחשב; דהיינו, מכונה עם כוח חישוב התחתון וכתוצאה מכך פחות קטעי וידאו לפעול במקביל. ההתקנה שאנו כיום משתמשים ממוטבת כדי לעלות סרטונים ca. 16 במקביל והוא יכול להשלים את ניתוח קטעי 100 סי. אי.. בין לילה. יתר על כן, רמה גבוהה של פירוט של התאמה אישית מסופקים ב- GUI של WF-NTP מאפשר שליטה מעולה של האיכות של ניתוח ההדמיה. ניתן להשתמש GUI להעלות ישירות אלגוריתמית בסרטי מקבילית או בודדים; ניתן גם לבחור מסגרות ספציפיות לניתוח נתונים היסטוריים משנה, יחד עם מקדם ההמרה פיקסל, בו ניתן להשתמש כדי להעריך מדדים התנהגותיים. ניתן לבחור באחת האלגוריתמים מעקב אחר שני (שמור מת, התמרת Z) בהתאם אם המשתמש רוצה לשקול חיות משותק בניתוח. הפרמטר סף יכול להיות מכוון בהתאם עם הווידאו ואיכות ניסיוני. הפתיחה והפרמטרים הסגירה מאפשרים למשתמש להסיר את הרעש וליישם עוד יותר את הפונקציונליות סף. האלגוריתם skeletonizing מציע שיטה חלופית של ניתוח. האובייקט גודל החתך-offs (סינון) לספק מסנן נוסף עבור רעש רקע, הפרמטר תולעת מאפשרת למשתמש באופן שקול תולעים אובייקטים רק עם צורת אליפסואידי, ומכאן הבחנה מאובייקטים אחרים ייתכן שיהיה באותו גודל פיקסל של התולעים. לאחר פעולות אלה סף, כל האזורים עם תוויות ברורות וכתוצאה מכך יכול להיות מזוהה תולעים בודדים, העמדות של אזורים אלה מאוחסנים אז לכל אחת מהמסגרות לאחר מכן ניתוח ומעקב. האקסצנטריות של כל תולעת מסומנים משמש להערכת מדדים תולעת כגון מידת תולעת כיפוף (BPM) כפונקציה של הזמן. המשתמשים רשאים גם לבחור מספר המסגרות נהגה לשמור תולעת לזכרו של התוכנה בעקבות התנגשויות, ניתן גם לכוונן את מספר הפיקסלים תולעת יכול לנוע בין מסגרות כדי להבחין בין בעלי החיים מן הרעש. האפשרות אורך המסלול מינימום מאפשר למשתמש למחוק תולעים שסומנו עבור רק כמה מסגרות. פרמטרים מרכזיים אחרים, כמו כפיפות והמהירות, מאפשרים למשתמש לבחור את מידת כיפוף צורך לספור עיקול הגוף ואת מספר מסגרות נחשב להיות נחוץ כדי להעריך את המהירות של בעלי החיים. ניתוק פרמטרים ניתן לכוונן הלאה להשתלבותם של חיות משותק. הפלט מוצג באופן אוטומטי הקבצים תוצאה. ערכים אלה נחשבים מהגבולות העליונים על ההערכה של השבר של חיות משותק. המשתמש יכול גם לבחור אזורים אחד או יותר עניין. תכונה זו שימושית במיוחד לנתח subpopulations של התולעים, הפלט ממוינת באופן אוטומטי את הקבצים תוצאות. האפשרות פלט מאפשרת למשתמש לבחור את תיקיית הפלט ואת מספר מעקב מסגרות שיופקו על זה. סטי כלי שונים יכול לשמש גם עבור ניתוח נתונים נוספים, כגון הכלי נתיב עלילה המציג תולעת רצועות והכלי טביעות אצבע המאפשר למשתמש ליצור טביעות אצבע מפות.
מתודולוגיה זו מאפשרת גישות חדשות יאומץ, לא רק על מחקרים ביולוגיים של C. elegans , אלא גם למטרות מחקר רפואי תרופתי, כגון תפוקה גבוהה ההקרנה של שינויים גנטיים וטיפולים סמים. לנו יש מאויר פוטנציאל זה על ידי המתארת אפיון הפנוטיפים ללימודי אוכלוסייה גדולה (N > 1000) של דגמים שונים תולעת של מחלות ניווניות (frontotemporal דמנציה (חדרתי)39, מחלת פרקינסון (PD)7 ,16,של מחלת אלצהיימר (AD)40, נוירודגנרטיביות (ALS)19 (איור 3 א), ואת אפיון השפעת פוטנציאל מולקולות טיפולית באמצעות מודלים תולעת של משטרת18 ו- AD 15,12 (איור 3b). שתי מולקולות קטנות, squalamine18 ו bexarotene15, נוהלו בריכוזים עד מיקרומטר 25 PD (איור 3b) ו- 10 מיקרומטר, כדי לספירה38 (איור 3b) תולעים, בהתאמה. שתי תרכובות הראה ברור למינון אפקטים מעל טווח ריכוזים נבדק. אנחנו הראו כי זה דיוק גבוהה של המדידות מושגת על ידי הגדלת מספר תולעים מסוגל לנתח לעומת שיטות מסורתיות (איור 3 c). אנחנו מאויר את חשיבות גודל המדגם (איור 3 c) במולקולרי ההקרנה גם כמו אפיון של זנים מוטציה. העלייה בטמפרטורה של 20 ° C מוביל כמחצית התולעים לספירה הופך משותק לאחר 3 ימים של בגרות. תולעת אוכלוסיות הוקרנו בתנאים שונים, למשל, כאשר תולעים יתר לבטא את הטופס 42-שאריות של פפטיד עמילואיד-β (Aβ1-42) (AD תולעים) נחשפו טמפרטורה עדין וריאציות (איור 3 c, שמאלה לוח), כאשר Aβ1-42 בא לידי ביטוי כל הנוירונים (איור 3 c, הפאנל המרכזי), או כאשר המודעה תולעים נחשפו bexarotene (איור 3 c, לוח נכון). תולעים נותחו גם מן ROIs קטן שנבחר באופן אקראי מתוך שדה הראייה המלאה של קטעי וידאו הנרכש של WF-NTP (N < 50, צהוב ברים) המדגיש את ההשוואה של תנועתיות תולעים אלה עם תנועתיות הממוצע של האוכלוסייה כל התולעת (N < 1,000). כל הפאנלים, ההבדל נמדד על כל האוכלוסייה התולעת נראה משמעותי סטטיסטית עם p ≤ 0.0001 (*).
פרוטוקול WF-NTP המתוארים כאן גם מאפשרת הקלטה בו זמנית של פרמטרים מרובים (איור 1b) כדי לתמוך, בצורה אופטימאלית, אימות פנימית והן פיתוח טביעת אצבע מקיפה של מגוון רחב של תנאים יחסית מדגם שליטה, המאפשר השוואות משמעותיים על פני מחקרים רבים. גישה רב פרמטרית זו כוללת ניתוח בו זמנית של מספר תכונות התנהגותיות, כולל כיפוף תדר, מהירות, קצב שיתוק, משרעת בנד בגודל בנד הזחה36. זה מאפשר אלפי בעלי חיים כדי להיות במעקב בפירוט רב, רגישות מאוד גבוהה, מובהקות סטטיסטית, ומספק הזדמנויות ללימודים אוכלוסיות גדולות. נוהל מעקב זה יש גם יתרון המאפשר לימודי שיתוק שיבוצע במקביל עם מדידות התנהגותיות אחרות, תכונה מרכזית במחקרים מולקולרי ההקרנה.
התוצאות הושגו עד כה המודעה15,34,35 , גילוי תרופות18 PD להדגים את חשיבותה של רכישת נתונים רחב שדה-of-view כדי להגדיל באופן משמעותי את המספרים של חיות זה יכול להיות פיקוח בניסוי יחיד, להקטין באופן משמעותי את השגיאות ניסיוני, מיעיל תוקף סטטיסטי של המחקרים. בהתבסס על תוצאות אלו, אנו צופים כי פרוטוקול WF-NTP, אשר עשינו זמינים עבור הקהילה36, תרחיב באופן משמעותי את השימוש C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> איור 1: צעדים analysis WF-NTP, דוגמה של טביעת אצבע. () 1. הווידיאו המקורי. 2. רקע תמונה. 3. רקע המופחת התמונה. 4-6. קביעת סף מדרגות. 7-9. labelling יחיד של תולעים. (b) פנוטיפים מרובים מדווחים עם טביעת אצבע לתולעים פראי-סוג והתולעת מודלים של PD ו- AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> איור 2: ממשק משתמש גרפי (GUI) של WF-NTP. המסגרות שנבחרו וסרטי ספציפי שניתן לבחור ב- GUI לניתוח, מקדם ההמרה פיקסל ניתן להוסיף, אחרי אשר הניתוח מתבצע באחת האלגוריתמים מעקב נתון שני. זה אפשרי לבחור את מידת כיפוף צורך נחשב עיקול הגוף, כמו גם מספר המסגרות צריך להעריך את המהירות של בעלי החיים. גוף עיקולים ספי מהירות יכול לקבוע את הסטטיסטיקה תולעת משותק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> איור 3: דוגמאות של יישומים התומכים בשיטת WF-NTP. () יישום של WF-NTP במחקרים אוכלוסייה גדולה (N > 1,000) של BPM מדידות עבור C. elegans מודלים של מגוון מחלות ניווניות כולל חדרתי, PD, לספירה, ומחלת ניוון שרירים. (b) יישום של WF-NTP גילוי סמים. (ג) חשיבות המחקרים האוכלוסייה ב רגישות טמפרטורה, יעילות התרופה, ואפיון מוטנטים זן. פנוטיפים של subpopulations N < 50 (ברים צהוב) לעומת אלו של האוכלוסייה כל התולעת (N < 1,000). קווי השגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

אנו מתארים פרוטוקולים עבור באמצעות פלטפורמת מעקב נמטודות רחב שדה-of-view (WF-NTP), המאפשרת אפיון פנוטיפי תפוקה גבוהה של אוכלוסיות גדולות של Caenorhabditis elegans. פרוטוקולים אלה ניתן לאפיין שינויים התנהגותיים עדינים זנים מוטציה או בתגובה טיפול תרופתי באופן מדרגי במיוחד.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתהליך גילוי סמים על איך תרופה ספציפית מתנהגת באורגניזם חי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הגדלים מדגם גדול להיות מוקרן במהירות וביעילות. טכניקה זו כבר יש השפעה גדולה בגילוי סמים על ידי הפעלת הערכה quanititative מאוד של ההשפעות של מועמדים לסמים.שיטה זו מספקת תובנות מכניסטיות חדשניות על תחילתן והתקדמותן של מחלות לא דומות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות, כגון הזדקנות הקרנות גנטיות. אנחנו מאוד נרגשים מההזדמנות הזאת להכניס שיטות פיזיות חדשות למרחב של גילוי סמים.שדים אלה של שיטה זו היא קריטית כמו שלבי ההקרנה דורשים היכרות גבוהה עם טכניקה אוטומטית זו נובו. הדגמת ההליך יהיה סם Casford, עוזר חיפוש מהמעבדה שלנו. לפני תחילת ההליך, להוסיף 2.2 מיליליטר של כל תרכובת סמים בריכוז המתאים שישה 5-fluorodeoxyuridine או לוחות FUDR לכל זן תולעת, על ידי הפצה בזהירות את המתחם על פני כל פני השטח של הצלחת, ולייבש את הצלחות בתנאים סטריליים.בזמן שהצלחות מתייבשות, השתמשו ב-15 מיליליטר של חיץ M9 כדי לשטוף את התולעים מחמש צלחות עשירות של גורם גדילה נמטודה, ולהעביר את התולעים המשוחררות לצינור חרוטי לצנטריפוגה. להשעות מחדש את nematodes בשלושה מיליליטר של חיץ M9 טרי לכמת את מספר התולעים בשלב הזחל L4, וזרע 700 L4 זחלים על כל אחד מששת לוחות FUDR יבש לכל זן תולעת, לכל תרכובת. כאשר כל nematodes כבר זרעים, מניחים את הצלחות המכילות את הזנים שעבורם parlysis הוא המושרה על ידי העלאת הטמפרטורה ב 24 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.למחרת, להדליק את אורות הבמה של גשש התולעת המקביל, ולנקות את שלב הזכוכית של הגשש עם 70 אחוז אתנול. אם לא נשאר שאריות נראות לעין, הסר את מכסה העדשה ולהשתמש באבק אוויר כדי לנקות את עדשת ההדמיה. ודא שהמצלמה מחוברת ומותקן כראוי והתחל להקליט באמצעות תוכנת לכידת התמונה.כוונן את הגדרות המצלמה כדי להקליט 20 מסגרות לשנייה, עם הפרמטרים המתאימים להקלטת מונו-16. השתמש בצלחת פטרי ריקה באורך תשעה סנטימטרים כדי להבטיח שהבמה מוגדרת לגובה הנכון, ולהתאים את הבמה במידת הצורך. בתנאים סטריליים, להוסיף שלושה מיליליטר של פתרון M9 לצלחת הקרנה תנועתיות, ולהשתמש שני מיליליטר של פתרון M9 לשטוף שליש משטח הפנים של שתי לוחות FUDR טעון nematode מאותה קבוצת ניסוי לתוך צלחת ההקרנה.לאחר מכן, מניחים את לוחית ההקרנה על בימת הגשש. השתמש בתולעת אחת כדי למקד את המצלמה, ולהתחיל להקליט את בעלי החיים. כאשר ההקלטה הושלמה, להשליך את צלחת תנועתיות, ולסמן את לוחות FUDR כמו בשימוש פעם אחת לפני החזרתם לאנקובטור.כדי לנתח את נתוני הווידאו, פתח את ממשק המשתמש הגרפי של תוכנת ניתוח הנתונים של מעקב התולעת המקביל, ולהשתמש בפונקציית הגלישה כדי לטעון את הווידאו המעניין. בחר תיקיית יעד פלט ואשר כי 600 עד 1200 מסגרות מוגדרות לניתוח של 30 שניות. הכנס גורם המרה של 0.029 פיקסלים למילימטר להדמיה של צלחת פטרי ברזולוציה מלאה של תשעה סנטימטרים, ובחר את אלגוריתם המעקב המת.תחת הכרטיסיה פרמטרי איתור, הגדר את תמונות Z-use ל- 100, את מרווח Z ל- 3, את הפיקסלים הסטנדרטיים ל- 54, את הסף ל- 9, את הפתח ל- 1 ואת הסגירה ל- 2. התאם את פרמטרי הסינון לגודל מינימלי של 20, גודל מרבי של 180 ותולעת בגודל 0.94. הגדר את הפרמטרים של מסלולי ההתגבשות לתזוזת מרחק מרבית של 10, אורך מינימלי של 150 וזיכרון של 10.הגדר את פרמטרי הכיפוף והמהירות לסף סף כיפוף של 1.8, עיקול מינימלי של 0 ומסגרות להערכת מהירות של 150. כוונן את סטטיסטיקת התולעת המתה לקצב מרבי לדקה של 5, ומהירות מרבית של 1. בחר את תיקיית הפלט ובחר את מספר מסגרות הפלט ל- 50 ואת גודל הגופן ל- 10.השתמש בפונקציה לדוגמה כדי לבדוק את הפרמטרים ולהפיק פלט של התמונות לדוגמה כדי לבדוק אם התולעים גלויות לאורך שמונת שלבי הסף. לאחר מכן ליזום את הפונקציה התחל משימה", ולשלב את התוצאות הבודדות עבור ערכת הנתונים כולה כדי לנתח את קבצי תוצאות הבדיקה, שמירת התוצאות באמצעות הייצוא לפונקציה TSV. שיטה זו מאפשרת אפיון של פנוטיפים נמטודה למחקרי אוכלוסייה גדולים של מודלים תולעת שונים של מחלה נוירודגנרטיבית, כגון דמנציה פרונטוטמפוראלית, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה צידית Amyotrophic.כמו גם את האפיון של ההשפעות של מולקולות טיפוליות פוטנציאליות, באמצעות מודלים תולעת של פרקינסון ואלצהיימר. הדיוק הגבוה של מדידות אלה מושגת על ידי הגדלת מספר התולעים שניתן לנתח בהשוואה לשיטות מסורתיות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למזער את הזמן בין תוספת התולעים לתוהבות ותחילת המעקב.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות ניתן לבצע כדי להשלים את התוצאות כדי לקשר עם צבירת חלבון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות נוירודגנרטיביות ופלפול שגויות, כגון פרקינסון ואלצהיימר, כדי לחקור את יישומי הגילוי הנכונים. אל תשכח כי עבודה עם FUDR יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות, כגון לבישת כפפות ניטריל, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...