Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
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इस कार्य के लिए केंद्र द्वारा रोगों का खुलासा (सीएमडी) का समर्थन किया गया । FAA अल्जाइमर सोसायटी, ब्रिटेन (अनुदान संख्या ३१७, के रूप में-एस एफ-16-003) से एक वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित है । सी. एलिगेंस उपभेदों को Caenorhabditis एलिगेंस जेनेटिक सेंटर (CGC) से प्राप्त किया गया.

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं हैं.

क्योंकि ऑप्टिकल विज्ञान के क्षेत्र में तकनीक के तेजी से विस्तार के कारण, यह अब संभव है एलिगेंस अध्ययन में स्वचालित तरीकों के लिए काफी नए तरीके से पते की आवश्यकता है । नतीजतन, डिजिटल ट्रैकिंग प्लेटफार्मों की एक संख्या20,४१,४२,४३,४४,४५,४६ पर डिजाइन किया गया है और उपलब्ध कराया इस तरह के आंदोलन की गति के रूप में मानकों के मैनुअल गिनती की जगह के लिए पिछले कुछ वर्षों में, आवृत्ति झुकने, पक्षाघात दर, और साथ ही व्यवहार के अधिक जटिल रूपों जैसे ओमेगा बदल जाता है, और उम्र माप. सबसे हाल ही में स्वचालित प्लेटफार्मों बहुत reproducibility और सी एलिगेंस अध्ययन के संवेदनशीलता में सुधार हुआ है४१ और छोटे साथियों या यहां तक कि व्यक्तिगत जानवरों पर उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान की है । हम कृमि व्यवहार के विश्लेषण के स्वचालन का विस्तार करने के लिए यह भी समानांतर में पशुओं के हजारों के साथियों के phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाने का फैसला किया । कीड़ा साथियों के अध्ययन के दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह कृमि24 व्यवहार के उच्च आंतरिक परिवर्तनशीलता के लिए लेखांकन के लिए अनुमति देता है और तथ्य यह है कि दवा उपचार के अध्ययन अक्सर सूक्ष्म phenotypic रूपांतरों के लिए नेतृत्व के लिए, जो कर रहे है मुश्किल पर्याप्त सांख्यिकीय महत्व के साथ पता लगाने के लिए जब पशुओं के एक छोटे समूह का उपयोग कर । पता लगाने की एक उच्च शक्ति (फली) वास्तव में विश्वास के साथ व्यवहार में किसी भी महत्वपूर्ण भिंनता का पता लगाने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणाम25सीमा आवश्यक है ।
यहां, हमने C. एलिगेंसके लिए हाल ही में रिपोर्ट की गई स्वचालित स्क्रीनिंग पद्धति के आधार पर प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला बताई है, जो वाइड फील्ड-ऑफ-व्यू निमेटोड ट्रैकिंग प्लेटफ़ॉर्म (WF-NTP)३६है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 5 भागों में विभाजित किया गया है । 1 भागों और 2 बड़े कीड़ा आबादी की तैयारी का वर्णन । महत्वपूर्ण कदम काम की स्थिति और रिएजेंट और आवश्यक प्लेटों की तैयारी के बांझपन के लिए प्रयोग चलाने के लिए कर रहे हैं । हम ध्यान दें कि, वृद्धि हुई अन्य स्क्रीनिंग के तरीके की तुलना में इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की प्रवाह के कारण३६, यह भी रिएजेंट की मात्रा में वृद्धि की आवश्यकता है; इस पहलू को प्रायोगिक डिजाइन में सावधानीपूर्वक विचार करने की जरूरत है । हम यह भी ध्यान दें कि ब्लीचिंग कदम महत्वपूर्ण है और पहले से परीक्षण की जरूरत है के रूप में अंडे की एक बड़ी संख्या और स्वस्थ लार्वा इन प्रयोगों को चलाने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल विवरण के भाग 3 कैसे ठोस मीडिया और स्क्रीन कीड़ा आबादी में ड्रग्स देने के लिए । हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल के इस भाग के समानांतर में उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण किया जा करने के लिए दवाओं और दवा सांद्रता की संख्या पर दृढ़ता से निर्भर है । स्क्रीनिंग प्रक्रिया का पूरा स्वचालन और तेजी से डेटा अधिग्रहण व्यवहार अवलोकन से सीमित कदम को रिएजेंट तैयारी और विकास और बड़े कीड़ा आबादी के तुल्यकालन बदलाव । व्यवहार स्क्रीनिंग के दौरान महत्वपूर्ण कदम रिकॉर्डिंग के समय और किसी भी कृमि हैंडलिंग कदम (जैसे, NGM प्लेटों से ट्रैकिंग मंच के लिए कीड़े के हस्तांतरण) कर रहे हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक वयस्क उंर के दौरान 9 दिनों तक के लिए कीड़े स्क्रीन डिजाइन उदाहरण है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से उपयोगकर्ता इच्छाओं के रूप में कई समय अंक के रूप में स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, 18 लगातार दिन३६। भाग 4 तो प्रोटोकॉल के आवेदन को दिखाता है प्रोटीन अणुओं (जैसे, एंटीबॉडी और आणविक chaperones) सी. एलिगेंसमें उद्धार, और पता चलता है कि कैसे प्रोटोकॉल 1-3 भागों में सचित्र आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, वांछित पर निरभर है अनुप्रयोग. हम प्रदर्शन कैसे इस प्रक्रिया को न केवल दवा की डिलीवरी के अणुओं की तरह है लेकिन यह भी आणविक chaperones या एंटीबॉडी३७के प्रशासन के लिए बढ़ाया जा सकता है । पहले चार कदम (भागों) बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है, जब तक अंयथा उल्लेख किया । सभी तरल घटकों का उपयोग करने से पहले autoclaved होना चाहिए और गर्मी कदम ७०% सापेक्ष आर्द्रता पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । 5 भाग में, हम कैसे सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग मंच के साथ संयोजन में प्रदान की पैकेज का उपयोग करने का वर्णन । यह सॉफ्टवेयर WF-NTP बड़े कीड़ा आबादी के व्यवहार से संबंधित आंकड़ों के विश्लेषण के लिए बनाया गया रिवाज है । हमारा सुझाव है कि उपयोगकर्ता डेटा विश्लेषण के लिए भाग 5 में दिए गए दिशानिर्देशों का पालन करता है; हालांकि, इन मापदंडों रिकॉर्ड वीडियो की विशिष्ट सुविधाओं पर निर्भर कर रहे हैं (यानी, एफपीएस, देखने के क्षेत्र, वीडियो संकल्प, अधिग्रहीत फ्रेम की संख्या). GUI में दिए गए उदाहरण फ़ंक्शन को विश्लेषण से पहले सही मापदंडों के मूल्यांकन की सुविधा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है.
प्रोटोकॉल की ये श्रृंखला सी. एलिगेंस की बड़ी आबादी के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाने के लिए (वर्तमान में ५,००० व्यक्तिगत कीड़े समानांतर में) प्रभावी ढंग से, कलाकृतियों जानवरों के व्यवहार की आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण को कम करने , एलिगेंस25के अध्ययन के लिए सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक पता लगाने की शक्ति पर प्रारंभिक अध्ययन के साथ समझौते में. मंच उच्च संकल्प कैमरों की एक प्रणाली का उपयोग करता है, एक उच्च गति से पशुओं की बड़ी संख्या की छवियों की रिकॉर्डिंग में सक्षम है, जबकि एक साथ कई बड़े साथियों की रिकॉर्डिंग । उच्च प्रदर्शन और WF-NTP प्रोटोकॉल का उच्च प्रवाह यह एक बहुत ही सटीक तरीके से कृमि व्यवहार में बहुत छोटे परिवर्तन निर्धारित करने के लिए संभव बनाता है । इसलिए, इस पद्धति के नए दृष्टिकोण न केवल एलिगेंस के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए माना जाता है, लेकिन इसके अलावा औषधीय और चिकित्सा अनुसंधान के लिए, आनुवंशिक संशोधनों और नशीली दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के रूप में सक्षम बनाता है उपचार. इस प्रक्रिया को भी पक्षाघात के अध्ययन की अनुमति के अंय व्यवहार मापन, आणविक स्क्रीनिंग अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता के साथ समानांतर में प्रदर्शन करने का लाभ है ।
विज्ञापन15,३४,३५ और पीडी18 की दवा खोज कार्यक्रमों में अब तक हासिल किया गया है कि परिणाम काफी हद तक बढ़ाने में व्यापक क्षेत्र के दृश्य डेटा अधिग्रहण के महत्व का प्रदर्शन जानवरों की संख्या है कि एक ही प्रयोग में नजर रखी जा सकता है, जिससे काफी प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम करने और बहुत अध्ययन के सांख्यिकीय वैधता में सुधार । जबकि वर्तमान दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित दवा की खोज के क्षेत्र में चुनौतियों को संबोधित करने पर ध्यान केंद्रित किया है, हमें उंमीद है कि इस पद्धति को व्यापक रूप से समुदाय में अपनाया जाएगा, और है कि अपने आवेदन जटिल आनुवंशिक करने के लिए बढ़ाया जाएगा और व्यवहार अध्ययन और वर्तमान में जासूसी कर रहे हैं कि phenotypes की संख्या का विस्तार.

लगभग आधी सदी पहले, सिडनी ब्रेनर एक मॉडल प्रणाली के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) की शुरुआत के विकास और तंत्रिका जीव विज्ञान अध्ययन, इस छोटे (लंबाई में 1 मिमी) के रूप में, पारदर्शी निमेटोड कीड़ा हेरफेर करने के लिए आसान है आनुवंशिक रूप से और1प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए । आज, सी एलिगेंस apoptosis, सेल सिग्नलिंग, कोशिका चक्र की प्रकृति, जीन विनियमन, चयापचय, और उंर बढ़ने सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है2। इसके अलावा, सेलुलर और ऊतक जटिलता, प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न और सी एलिगेंस और उच्च जीवों के बीच रोग रास्ते के संरक्षण (कृमि जीन का ८०% एक मानव orthologue है), सादगी के साथ जुड़ा हुआ है और खेती की लागत प्रभावशीलता, यह एक में प्रभावी बनाने के लिए vivo मॉडल जीव उच्च प्रवाह आनुवंशिक3,4,5,6,7के लिए उत्तरदायी, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , १३ आणि औषध१४,१५,१६ स्क्रिनिंग. इन सभी कारणों के लिए, सी एलिगेंस सामांय और रोग से संबंधित आणविक रास्ते के लक्षण वर्णन के लिए नियोजित किया गया है; neurodegeneration के क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, यह प्रोटीन एकत्रीकरण3,4,7,15,17पर वृद्धावस्था के प्रभाव की खोज को सक्षम किया गया है, 18, और प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रवर्तकों और अवरोधकों के लक्षण वर्णन3,4,5,6,7,14, 18.
कीड़े के समग्र स्वास्थ्य, जो एक महत्वपूर्ण व्यवहार के लिए अध्ययन के इस प्रकार में परिभाषित किया जा पैरामीटर है, मैंयुअल रूप से विभिंन तरीकों से मापा जा सकता है, जैसे शरीर की संख्या की गिनती द्वारा प्रति मिनट झुकता (BPM)4,6, 19, या आंदोलन की गति को मापने20,21,22, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औसत उंर और पक्षाघात की दर को मापने के द्वारा । हालांकि शरीर झुकता है और आंदोलन की गति के मैनुअल माप आणविक रास्ते और तंत्र की एक किस्म में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया है3,4,14,19, 20,23, मैनुअल परख वर्तमान में कम प्रवाह, उच्च श्रम गहन, और समय लेने whilst त्रुटियों के लिए प्रवण और मानव पूर्वाग्रहों जा रहा है । इन मुद्दों को पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ डेटा के संग्रह में काफी चुनौतियों वर्तमान सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन भेद । यह सीमा विशेष रूप से संभावित दवा अणुओं के साथ उपचार के रूप में दवा स्क्रीनिंग के लिए प्रासंगिक है अक्सर छोटे phenotypic परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व24, इसलिए पशुओं की बड़ी संख्या के अध्ययन की आवश्यकता के क्रम में reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए. इस बिंदु को समझाने के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक उच्च शक्ति का पता लगाने (POD) विश्वास के साथ व्यवहार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन को परिभाषित करने के लिए और झूठी सकारात्मक परिणामों को सीमित करने के लिए आवश्यक है25। यह सी एलिगेंस समुदाय में एक मजबूत प्रेरणा के परिणामस्वरूप reproducible, स्वचालित, समय और लागत प्रभावी माप के साथ मैनुअल गिनती की जगह है । इस मांग को पूरा करने के लिए, कई प्रयोगशालाओं हाल ही में उच्च संवेदनशीलता माप और कीड़े की बड़ी संख्या के सटीक कीड़ा ट्रैकिंग के लिए तरीके विकसित किया है22,26,27,28 ,29,30,31,३२,३३.
इसके अलावा सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माप के लिए आवश्यक पशुओं के बड़े साथियों को स्वचालन की प्रक्रिया का विस्तार करने के लिए, हम हाल ही में एक विस्तृत क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP)15,३४ विकसित किया है ,३५,३६, जो बहुत बड़ी कीड़ा आबादी पर एकाधिक phenotypic readouts की एक साथ जांच सक्षम बनाता है, सांख्यिकीय प्रासंगिक phenotypical पता लगाने में एक महत्वपूर्ण कारक25। न केवल WF-NTP वर्तमान में समानांतर में ५,००० पशुओं के लिए निगरानी कर सकते हैं, लेकिन phenotypic readouts भी कई मापदंडों की दर और शरीर झुकता के आयाम सहित, शामिल हैं, आंदोलन की गति, आबादी है कि झोले के अंश, और जानवरों के आकार । इसलिए यह समानांतर में कीड़े के हजारों स्क्रीन करने के लिए आसानी से संभव है और एक बहुआयामी फिंगरप्रिंट३६बनाने के लिए एक व्यवहार नक्शे में अलग readouts गठबंधन करने के लिए । एसोसिएटेड ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर पायथन में लिखा है, जो भी इसे संचालित करने के लिए आवश्यक है और पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है । इस तकनीक को अपनाने के लिए यूजर्स को सक्षम बनाने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) भी दिया गया है ।
यहां, हम प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है कि WF-NTP के संभावित अनुप्रयोगों के कुछ वर्णन प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, हम यौगिकों के प्रशासन पर चर्चा, छोटे अणुओं से प्रोटीन चिकित्सकीय को लेकर, और वर्णन कैसे कीड़े की बड़ी आबादी पर सीधे उनके प्रभाव स्क्रीन करने के लिए, इस प्रकार प्रभावी रूप से छोटे नमूने की जरूरत को दूर उप आबादी । इस प्रयोजन के लिए WF-NTP का उपयोग पहले से ही अल्जाइमर रोग (AD)15,३४,३५ और पार्किंसंस रोग (पीडी) के ड्रग डिस्कवरी प्रोग्राम डिजाइन करने के उद्देश्य से प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण लाभ लाया है18 चिकित्सकीय उंमीदवारों३५,३७के आकलन के लिए vivo डेटा में प्रयोग ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis एलिगेंस जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल है, व्यापक रूप कार्यात्मक जीनोमिक्स और उंर बढ़ने के अध्ययन में कार्यरत । अध्ययन के तहत जानवरों के स्वास्थ्य और फिटनेस का आकलन करने के लिए, एक आम तौर पर शरीर झुकता की संख्या या आंदोलन की गति की माप के रूप में गतिशीलता readouts, पर निर्भर करता है । ये माप आमतौर पर मैनुअल गिनती शामिल है, यह अच्छा सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना रही है, समय और श्रम की कमी के रूप में अक्सर 25 या उससे कम के लिए प्रत्येक प्रयोग में पशुओं की संख्या सीमित । उच्च सांख्यिकीय शक्ति के बाद से reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम सीमा जब कमजोर phenotypic प्रभाव की जांच कर रहे हैं, प्रयास हाल ही में स्वचालित प्रोटोकॉल को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित विकसित किया गया है गतिशीलता का पता लगाने और बहु-पैरामीट्रिक व्यवहार profiling की संवेदनशीलता। आदेश में छोटे phenotypic परिवर्तन है कि अक्सर आनुवंशिक अध्ययन और दवा की खोज में महत्वपूर्ण है पर कब्जा करने की जरूरत स्तर को पता लगाने की सीमा का विस्तार करने के लिए, हम यहां एक तकनीकी विकास का वर्णन है कि अप करने के लिए ५,००० व्यक्तिगत पशुओं के अध्ययन में सक्षम बनाता है इसके साथ ही, के बारे में १,००० से माप की सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि-मैनुअल परख की तुलना में गुना और के बारे में १०० अंय उपलब्ध स्वचालित तरीकों की तुलना में गुना ।

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Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

एक व्यापक क्षेत्र के दृश्य ट्रैकिंग मंच का उपयोग कर बड़ी सी एलिगेंस आबादी का स्वचालित व्यवहार विश्लेषण

हम व्यापक क्षेत्र के दृश्य निमेटोड ट्रैकिंग मंच (WF-NTP), जो Caenorhabditis एलिगेंसकी बड़ी आबादी के उच्च प्रवाह phenotypic लक्षण वर्णन करता है सक्षम बनाता है का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । इन प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती उपभेदों में या एक उच्च स्केलेबल फैशन में औषधीय उपचार के जवाब में सूक्ष्म व्यवहार परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

तो यह विधि एक दवा खोज प्रक्रिया में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है कि एक विशिष्ट दवा जीवित जीव में कैसे व्यवहार करती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह बड़े नमूना आकारों को जल्दी और कुशलता से जांच करने की अनुमति देता है। इस तकनीक को पहले से ही दवा उंमीदवारों के प्रभाव का एक अत्यधिक quanititative मूल्यांकन को सक्षम करने के द्वारा दवा की खोज में एक बड़ा प्रभाव पड़ रहा है ।यह विधि गलत गुना रोगों की शुरुआत और प्रगति में उपन्यास मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। इसके अलावा, इस विधि को अन्य प्रणालियों जैसे उम्र बढ़ने और आनुवंशिक स्क्रीनिंग पर भी लागू किया जा सकता है। हम दवा की खोज के अंतरिक्ष में नए भौतिक तरीकों को लागू करने के इस अवसर से बहुत उत्साहित हैं।इस विधि के ये राक्षसी महत्वपूर्ण है क्योंकि स्क्रीनिंग चरणों को इस नोवो स्वचालित तकनीक के साथ उच्च परिचित की आवश्यकता होती है। प्रक्रिया का प्रदर्शन सैम Casford, हमारी प्रयोगशाला से एक खोज सहायक होगा । प्रक्रिया शुरू करने से पहले, प्लेट की पूरी सतह पर यौगिक को ध्यान से फैलाकर, और बाँझ परिस्थितियों में प्लेटों को सूखकर, 6 5-फ्लोरोडॉक्सीयूरिडीन या फ्यूडीआर प्लेटों प्रति कृमि तनाव के लिए उपयुक्त एकाग्रता पर प्रत्येक दवा यौगिक के 2.2 मिलीलीटर जोड़ें।जबकि प्लेटें सूख रही हैं, पांच समृद्ध सूत्रकृमि विकास कारक प्लेटों से कीड़े को धोने के लिए M9 बफर के 15 मिलीलीटर का उपयोग करें, और अपकेंद्रित्र के लिए मुक्त कीड़े को शंकुदाता में स्थानांतरित करें। एल 4 लार्वा चरण में कीड़े की संख्या की मात्रा के निर्धारण के लिए ताजा M9 बफर के तीन मिलीलीटर में नेमाटोड को फिर से निलंबित करें, और बीज 700 एल 4 लार्वा प्रति कृमि तनाव, प्रति कीड़ा तनाव, प्रति कृमि तनाव में से प्रत्येक पर। जब सभी सूत्रकृमि को वरीयता दी गई हो, तो उन प्लेटों को रखें जिनमें उपभेदों को शामिल किया जाता है जिसके लिए पैरालिसिस को 24 घंटे के लिए तापमान को 24 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाकर प्रेरित किया जाता है।अगले दिन, समानांतर कृमि ट्रैकर के मंच रोशनी चालू करें, और 70 प्रतिशत इथेनॉल के साथ ट्रैकर के ग्लास चरण को साफ करें। यदि कोई दिखाई देने वाला अवशेष नहीं रहता है, तो लेंस कैप को हटा दें और इमेजिंग लेंस को साफ करने के लिए एयर डस्टर का उपयोग करें। पुष्टि करें कि कैमरे को सही ढंग से प्लग इन किया गया है और इंस्टॉल किया गया है, और इमेज कैप्चर सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करें।उपयुक्त मोनो-16 रिकॉर्डिंग मापदंडों के साथ, प्रति सेकंड 20 फ्रेम रिकॉर्ड करने के लिए कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए एक खाली, नौ सेंटीमीटर पेट्री डिश का उपयोग करें कि चरण सही ऊंचाई पर सेट है, और यदि आवश्यक हो तो मंच को समायोजित करें। बाँझ परिस्थितियों में, एक गतिशीलता स्क्रीनिंग प्लेट के लिए M9 समाधान के तीन मिलीलीटर जोड़ें, और स्क्रीनिंग प्लेट में एक ही प्रयोगात्मक समूह से दो सूत्रकृमि भरी FUDR प्लेटों की सतह क्षेत्र के एक तिहाई धोने के लिए M9 समाधान के दो मिलीलीटर का उपयोग करें ।फिर, स्क्रीनिंग प्लेट को ट्रैकर स्टेज पर रखें। कैमरे को ध्यान केंद्रित करने के लिए एक ही कीड़े का उपयोग करें, और जानवरों की रिकॉर्डिंग शुरू करें। जब रिकॉर्डिंग पूरी हो जाती है, तो गतिशीलता प्लेट को त्याग दें, और फुडसी प्लेटों को इनक्यूबेटर में लौटने से पहले एक बार उपयोग किए जाने के रूप में चिह्नित करें।वीडियो डेटा का विश्लेषण करने के लिए, समानांतर वर्म ट्रैकर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर ग्राफिक यूजर इंटरफेस खोलें, और ब्याज के वीडियो को लोड करने के लिए ब्राउज़िंग फ़ंक्शन का उपयोग करें। आउटपुट डेस्टिनेशन फ़ोल्डर चुनें, और पुष्टि करें कि 30 सेकंड के विश्लेषण के लिए 600 से 1200 फ़्रेम सेट किए गए हैं। पूर्ण संकल्प पर नौ सेंटीमीटर पेट्री डिश की इमेजिंग के लिए मिलीमीटर रूपांतरण कारक के लिए 0.029 पिक्सेल डालें, और डेड ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म रखें चुनें।पता लगाने के मापदंडों टैब के तहत, जेड-उपयोग छवियों को 100, Z-पैडिंग को 3, मानक पिक्सेल को 54, सीमा को 9, उद्घाटन को 1 और समापन को 2 सेट करें। फ़िल्टरिंग मापदंडों को 20 के न्यूनतम आकार, अधिकतम आकार 180 और 0.94 की तरह कीड़ा समायोजित करें। 10 की अधिकतम दूरी की चाल, 150 की न्यूनतम लंबाई और 10 की स्मृति के लिए बनाने वाले प्रक्षेप पथ मापदंडों को सेट करें।झुकता और वेग मापदंडों को 1.8 की एक मोड़ सीमा सीमा, 0 की न्यूनतम झुकता है, और 150 के वेग का अनुमान लगाने के लिए एक फ्रेम सेट करें। मृत कृमि के आंकड़ों को 5 के प्रति मिनट एक मैक्समिम बीट और 1 की अधिकतम वेग में ट्यून करें। आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें, और आउटपुट फ्रेम की संख्या 50 और फ़ॉन्ट आकार को 10 तक चुनें।मापदंडों का परीक्षण करने और नमूना छवियों को आउटपुट करने के लिए उदाहरण फ़ंक्शन का उपयोग करें ताकि यह जांचा जा सके कि कीड़े आठ थ्रेसिंग चरणों में दिखाई दे रहे हैं या नहीं। फिर स्टार्ट जॉब "फ़ंक्शन शुरू करें, और परीक्षण परिणाम फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए पूरे डेटा सेट के लिए व्यक्तिगत परिणामों को जोड़ें, टीएसवी फ़ंक्शन में निर्यात के माध्यम से परिणामों को बचाएं। यह विधि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के विभिन्न कृमि मॉडलों के बड़ी जनसंख्या अध्ययनों के लिए नेमाटोड फेनोटाइप के लक्षण वर्णन की अनुमति देती है, जैसे फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया, पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, और अमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस।साथ ही संभावित चिकित्सीय अणुओं के प्रभाव के लक्षण वर्णन, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग के कीड़ा मॉडल का उपयोग कर । पारंपरिक तरीकों की तुलना में विश्लेषण किया जा सकता है कि कीड़े की संख्या में वृद्धि करके इन मापों की उच्च सटीकता हासिल की है। इस प्रक्रिया को करते समय, कीड़े के अलावा गतिशीलता और ट्रैकिंग की शुरुआत के बीच के समय को कम करने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया के बाद, परिणामों को पूरक बनाने और प्रोटीन एकत्रीकरण से जोड़ने के लिए अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने न्यूरोडीजेनेरेटिव और मिसवल्डिंग रोगों जैसे पार्किंसंस और अल्जाइमर के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए सही खोज अनुप्रयोगों का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया। यह न भूलें कि FUDR के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय निट्रील दस्ताने पहनने जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3 के एचआईवी -1 tropism के genotypic निष्कर्ष का प्रयोग जनसंख्या आधारित अनुक्रमण

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

फिडेलिटी और वायरस वायरस उत्परिवर्तन आवृत्ति के शाही सेना के विशेषता के वेरिएंट के अलगाव

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

एकल कक्ष का विश्लेषण बेसिलस subtilis प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो का उपयोग Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

मेजर multicenter चिकित्सीय परीक्षण के लिए परिधीय रक्त ल्युकोसैट आबादी एक पूरे रक्त phenotyping परख का उपयोग कर की गणना

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

स्वचालित पृथक्करण<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; अस्थायित्व से एक जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा उपनिवेश

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

एक डिजिटल बार कोडिंग मंच का उपयोग संक्रमण रोगाणुओं के जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

मानव परिधीय रक्त की Immunophenotypic विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

एक Cytometric मनका आधारित Immunoassay मंच का उपयोग कर उत्तेजित माउस Splenocytes के मल्टीप्लेक्स Cytokine profiling

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

आरएनए विश्लेषण के लिए बड़े जानवरों से लिम्फ नोड्स के संग्रह और प्रसंस्करण: बड़े पशु प्रजातियों के लिम्फ नोड Transcriptomic अध्ययन के लिए तैयारी

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

एक उच्च प्रवाह, उच्च सामग्री, तरल आधारित सी. एलिगेंस Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...