Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av senter for Misfolding sykdommer (CMD). FAA støttes av en Senior Research Fellowship award fra Alzheimers samfunnet, Storbritannia (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammer ble innhentet fra Caenorhabditis elegans genetisk sentrum (CGC).

1. forberedelse av materialer for C. elegans protokoller
<ol><li>
For å forberede en 10 x M9 buffer løsning, legge til 30 g monobasic kalium fosfat, 60 g dibasic natrium fosfat og 50 g av natriumklorid en 1 L autoclavable flaske.
	<ol>
<li>Legg 1 L renset vann og autoklav ca 121 ° C i 15 min.</li>
		<li>Fortynne 10 ganger renset vann og autoklav ca 121 ° C i 15 min.</li>
		<li>Når avkjølt, Legg 1 mL av en løsning av 1 M magnesium sulfat. Merk: Bare 1 x M9 (M9) skal brukes for ormen håndtering i fremgangsmåten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For å forberede Rundormer vekstmediet (Rich-NGM), bland 2,7 g natriumklorid, 15.75 g agar, 5.75 g kasein, 900 mL renset vann og autoklav 121 ° c i 15 min.
	<ol>
<li>Overføre rik-NGM mediet til en oppvarming ovn (ca. 70 ° C) hvis den ikke brukes umiddelbart. Rich-NGM kan holdes smeltet på ca. 70 ° C i opptil 12 h før de blir ubrukelig.</li>
		<li>Rich-NGM blande, Legg 900 µL i en løsning av 1 M veisalt 900 µL i en løsning av 1 M magnesium sulfat og 900 µL i en løsning av 5 mg/mL kolesterol i absolutt etanol. Merk: Kolesterol krever ikke autoklavering før bruk.</li>
		<li>For å forberede eksperimentelle platene som opprettholder en alder synkron befolkning, legge til 92 µL av 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) på 812 µM 900 mL av rik-NGM. Merk: FUDR er både giftige og kreftfremkallende, så det er viktig å ha nitrilhansker i tillegg labfrakker og vernebriller. Tillater ikke avfall inn generelle avfall strømmen og kast av forbrenning med en etterbrenner.</li>
		<li>Hell 20 mL autoklaveres rik-NGM i en 9 cm sterilt Petriskål generere en vekst plate (Rich-NGM plate). Hell 15 mL autoklaveres rik-NGM i en 9 cm sterilt Petriskål å gjøre en motilitet plate (Mot plate). Hell 20 mL av rik-NGM med FUDR i en 9 cm sterilt Petriskål å generere en FUDR plate. Merk: Lav agar volumet på Mot tallerkenen forenkler kameraet fokus og ormen sporing (se trinn 3.2.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Forberede OP50 Escherichia coli belastningen, ved autoklavering 1 L av LB kjøttkraft 121 ° c i 15 min og vaksinere med startkulturer når avkjølt.
	<ol>
<li>Tillate bakteriell kultur å vokse over natten på 37 ° C og sterilisere røret skal brukes for sentrifugering.</li>
		<li>Overføre bakterier til sterilt rør og sentrifuger 4600 x g i 15 min.</li>
		<li>Dekanter nedbryting og bruker sterilt vann, suspendere i 10% av det opprinnelige volumet for å opprette 10 x (10 ganger konsentrert) OP50 lager.</li>
		<li>Fortynne 15 mL 10 x OP50 aksjen til 150 mL generere 1 x OP50, bruke sterilt vann, før den brukes å frø rik-NGM plater. Bruk de resterende 10 x løsning til frø FUDR plater. Merk: Mot platene blir unseeded og brukes bare i bilde oppkjøpet trinn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Til frø plater med bakterier, skille rik-NGM og FUDR plater.
	<ol>
<li>Under sterile forhold, legger du til 350 µL av 1 x OP50 til rik-NGM plater og jevnt. Merk: Ikke spre til kanten av tallerkenen som ormer vil gjennomgå opp sidene av platen og dø.</li>
		<li>Under sterile forhold, legger du til 350 µL av 10 x OP50 å FUDR plater og jevnt.</li>
		<li>La platene tørke og ruge ved 20 ° C i 2 d før bruk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. forberedelse C. elegans for bruk med WF-NTP
<ol><li>Opprettholde C. elegans rik-NGM plater eller ved å overføre litt agar inneholder ormer forsiden ned på en fersk bakteriell lag. Opprettholde C. elegans påkjenninger på denne måten før starte eksperimentelle protokollene.</li>
	<li>Ved hjelp av overføring teknikk (se trinn 2.1), frø 20 plater av hver stamme med velfødde, blandet scenen ormer og tillate dem å vokse for 2 d på 20 ° C.</li>
	<li>Vask av 5 plater som inneholder ormer bruke 15 mL av M9 og basseng i en 15 mL tube. Gjenta for alle 20 plater hver stamme.</li>
	<li>Sentrifuge ormer 2000 x g i 2 minutter, fjerne nedbryting og avbryte 2 mL av M9 løsning.</li>
	<li>Forberede 10 mL av bleking løsning ved å blande 13% natriumhypokloritt og 4 M natriumhydroksid i forholdet 3:2 vol./vol. Merk: Denne løsningen krever ikke autoklavering. Både komponenter og den resulterende løsningen er korrosiv og bør behandles med forsiktighet ved hjelp av nitrilhansker. Natriumhydroksid er mildt skadelig for glass og skal lagres i plastbeholdere.</li>
	<li>Legge 1 mL av bleking løsningen til hver sentrifuge rør og rist kraftig i ca 3,5 min eller til cuticle er fullstendig oppløst.</li>
	<li>Under sterile forhold, fortynne prøvene 15 mL M9 og sentrifuger 2000 x g 2 min. fjerne nedbryting og avbryte 15 mL av M9 løsning.</li>
	<li>Gjenta steg 2,7 6 ganger, til bare ormen eggene blir værende, og løsningen ikke lenger har en lukt av klor.</li>
	<li>Sentrifuge prøvene 2000 x g i 2 minutter, fjerne nedbryting og avbryte 2 mL av M9 løsning.</li>
	<li>Sterile forhold, bruk en steril glass pipette å overføre 2 mL av M9 som inneholder egg i hver brønn av en 12-vel vev kultur plate og ruge ved 20 ° C i minst 16 timer. Merk: Bruke separate plater hver stamme for å forhindre. Overføre trinnet fra sentrifuge rørene flere brønner hjelper å unngå ormen kvelning.</li>
	<li>Overføre ormer klekket over natten fra 12-vel platene i 15 mL sentrifuge rør. Ta 3 dråper 5 µL av ormen løsning og antall ormer i første larvestadiet (L1).</li>
	<li>Beregne antall ormer per µL av løsning.</li>
	<li>Frø L1 ormer på Rich-NGM plater på 3000 ormer per plate, og tillate dem å vokse i 2 dager ved 20 ° C, før de når siste larvestadiet (L4) scenen.</li>
</ol>3. generelle WF-NTP-protokollen
<ol><li>
Legge til 2,2 mL av hvert legemiddel sammensatt på riktig konsentrasjonen (slik som 25 eller 10 mM for stoffer som squalamine18 og bexarotene15, henholdsvis) til 6 FUDR plater og la tørke under sterile forhold for hver ønsket ormen belastning. Merk: Dette trinnet gjentas for hver sammensatte under eksamen, for hver konsentrasjon og hver løsemiddelet brukes.<ol>
<li>Vask ormer av 5 rik-NGM plater forberedt på trinn 2.13 med 15 mL M9 bufferen og overføre ormer slik sentrifuge.</li>
		<li>Sentrifuge 2000 x g i 2 minutter, fjerne nedbryting og suspendere i 3 mL M9. Ta 3 dråper 5 µL av M9 løsningen inneholder ormer og antall ormer i siste larvestadiet L4.</li>
		<li>Beregne antall ormer per µL av M9 buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frø 700 L4 larver på 6 av tørre FUDR platene som inneholder en gitt sammensatte, Gjenta for hver konsentrasjon av hver sammensatte og la tørke under sterile forhold.
	<ol>
<li>Inkuber ormer på 24 ° C fra L4 for disse stammer der ormen lammelser indusert bare ved å heve temperaturen, for eksempel AD belastning38. Telle dagen etter L4 larvestadiet som D0 voksen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slå på scenen lysene for sporing.
	<ol>
<li>Rengjør glasset scenen med 70% etanol og sikre at det rester ingen synlige, deretter fjerne Linsehette. Rense bildebehandling ved hjelp av en luft støvkost. Kontroller at kameraet er riktig plugget inn og installert og start opptak med image fange programvare.</li>
		<li>Justere kameraet for å registrere 20 rammer/s, med mono 16 opptak oppsett av parametere for; registrere 1200 rammer, lagre i MJPEG-format på en 95% kompresjonsforhold. Bruk en tom 9 cm Petriskål slik at scenen er satt til riktig høyde og justere den om nødvendig. Merk: Sikre at kantene på platen er synlig i opptaket som dette vil tillate "holde døde" algoritmen skal fungere (figur 1a).</li>
		<li>Under sterile forhold, ta 2 plater tidligere utarbeidet på trinn 3.2 med samme vilkår og 1 Mot screening plate i trinn 1.2.4. Legge til 3 mL M9 løsningen Mot platen. Bruk andre 2 mL M9 å vaske 1/3 av arealet av 2 plater forberedt på trinn 3.2 på Mot tallerkenen.</li>
		<li>Plass Mot platen inneholder ca 5 mL av M9 løsningen og omtrent 600 ormer på bane scenen. Fokuser kameraet bruker en personlige orm og begynne innspillingen.</li>
		<li>Når registreringen er fullført, forkaste Mot platen med ormer; Merk FUDR platene som brukes når og gå tilbake til inkubator.</li>
		<li>Gjenta trinn 3.3.3 til 3.3.5 for hver eksperimentelle tilstand.</li>
		<li>Gjenta trinn 3.3.3 til 3.3.6 for hvert punkt i voksen levetiden. Merk: Screening prosedyrene kan utføres når som helst ormen voksen levetid (ca 3 uker). Disse protokollene lette screening opp til 9 tidspunkt; forfatterne anbefaler screening hver 2 dager fra dag 1 voksen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. optimalisering for diskret Dose studier
<ol><li>
Forberede ormer ved å gjenta trinn 3.1.1 til 3.1.3.
	<ol>
<li>Frø ca. 1000 L4 ormer på 5 FUDR plater. Inkuber platene på 24 ° C til D3 voksen, for eksperimenter med AD38 ormer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bruker en steril glass pipette, overføring ormer utarbeidet under sterile forhold fra platen slik 15 mL sentrifuge sentrifuge 2000 x g i 2 minutter og fjern nedbryting.
	<ol>
<li>Avbryte løsning av ormer 1 mL av M9 buffer. Overføre ormer slik microcentrifuge sentrifuge på 300 x g i 2 minutter, og fjerne nedbryting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein transduction, legge 40 µL av transfection levering reagensen og 20 µL av innfødte protein på ønsket konsentrasjon (vanligvis 40 µM) og ruge ved romtemperatur for 30 min.
	<ol>
<li>Sterile forhold, bruk en steril glass pipette overføre ormer fra trinn 4.2.1 inn i et microcentrifuge rør som inneholder innkapslede protein for å gi et samlet volum på 1060 µL. sted rør horisontalt og riste på 60 rpm i en 24 ° C risting inkubator 8 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Under sterile forhold, legge 4 mL av M9 løsning til en Mot plate og overføre en microcentrifuge tube ormer pluss stoffet på Mot tallerkenen.
	<ol>
<li>Angi sporing ved å gjenta trinn 3.3 til 3.3.2.</li>
		<li>Under sterile forhold, legge 4 mL av M9 løsning til en Mot plate og overføre en microcentrifuge tube ormer pluss stoffet på Mot tallerkenen.</li>
		<li>Plasser Mot platen på bane scenen, fokuserer kameraet på en individuell orm, og starte innspillingen. Når fullført, etiketten Mot platen og satt til side.</li>
		<li>Gjenta trinn 4.4.1 og 4.4.3 for alle utvalg.</li>
		<li>Bruker en glass pipette, overføre ormer under sterile forhold fra Mot platen slik 15 mL sentrifuge sentrifuge 2000 x g for 2 min. Fjern supernatant, overføring pellet på en FUDR plate og la tørke under sterile forhold.</li>
		<li>Gjenta trinn 4.4.5 for alle prøvene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber ormer på 24 ° C til D6 voksen. Merk: Flere antistoffet incubations er også mulig.</li>
	<li>
Legger til 3 mL bufferen som M9 Mot platen og bruker 2 mL av M9 løsning for å vaske alle ormer fra en FUDR plate på Mot tallerkenen.
	<ol>
<li>Angi sporing ved å gjenta trinn 3.3 til 3.3.2.</li>
		<li>Plasser Mot platen på bane scenen, fokuserer kameraet som nødvendig, og starte innspillingen. Når registreringen er fullført, forkaste Mot platen eller gjenopprette det for ytterligere screening hvis ønskelig.</li>
		<li>Gjenta trinn 4.6 til 4.6.2 for alle prøvene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analysere det Video Data
<ol><li>
Etter ervervelsen videoer, Velg de riktige parameterne i programvaren GUI (figur 2) for dataanalyse.
	<ol>
<li>Laste inn én eller flere videoer via funksjonen småleser . Velg en utdatamappe for målet. Sikre at 600 til 1200 rammer brukes for en 30 s analyse. Merk: En rekke rammer kan analyseres.</li>
		<li>Sett inn en pixel å mm Omregningsfaktor, som vil være 0.029 for imaging en 9 cm Petri retter ved full oppløsning. Velg sporing algoritmen "holde død". Merk: Omregningsfaktoren avhenger synsfelt brukes. Z-transform algoritmen kan også brukes som et alternativ.</li>
		<li>Fyll ut parameterne i delen Locating (figur 2): Z bruke bilder = 100, Z polstring = 3, Std piksler = 54, terskel = 9, åpning = 1, lukke = 2. Justere filtrering parametre til minimumsstørrelse = 20, maksimal størrelse = 180, ormen som = 0.94.</li>
		<li>Justere parameterne Forming baner : maksimal avstand flytte = 10; Minimum lengde = 150, minne = 10.</li>
		<li>Angi parametere for svinger og hastighet . Bruke 1.8 for Bend terskel, 0 for Minimum bøyerog 150 rammer å beregne hastighet.</li>
		<li>Stille død ormen statistikk. Bruk 5.0 for maksimal slå per minutt og 1.0 for maksimal hastighet.</li>
		<li>Velg output-mappen. Angi antall rammer som utdata til 50. Angi skriftstørrelsen til 10. Merk: Eventuelt velge ett eller flere områder av interesse (ROIs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste parameterne ved hjelp av funksjonen eksempel . Utgang eksempel bildene og kontroller at ormer er synlig gjennom 8 terskelverdi trinnene (figur 1).</li>
	<li>Bruk funksjonen startjobb .</li>
	<li>
Analysere resultatet tekstfiler ved å kombinere individuelle resultatene for hele datasettet. Bruke eksportveiviseren tsv-funksjonen i GUI. Merk: Eventuelt kan individuelle beregninger av ormer også bli vurdert for befolkningsstudier.<ol>
<li>Analysere data med en statistisk programvarepakke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

På grunn av den raske ekspansjonen av teknikker innen optiske fag er det nå mulig å ta behovet for automatiserte metoder i C. elegans studier i vesentlig nye måter. Som et resultat, en rekke digitale sporing plattformer20,41,42,43,44,45,46 er utviklet og gjort tilgjengelig over de siste årene for å erstatte manuell telling av parametere som hastigheten på bevegelsen, bøying frekvens, lammelser hastigheten, i tillegg til mer komplekse former for atferd som omega svinger og levetid målinger. Nyeste automatiserte plattformer har forbedret reproduserbarhet og følsomhet C. elegans studier41 og gitt høy kvalitet på små kohorter eller selv enkelte dyr. Vi besluttet å utvide automatisering av analyse av ormen funksjonalitet gjør det også mulig å evaluere av fenotyper i kohorter av tusenvis av dyr i parallell. Den største fordelen med tilnærming av studere ormen kohorter er at det tillater for regnskap for høy iboende variasjon av ormen atferd24 og det faktum at stoffet behandlingsstudier ofte føre til subtile fenotypiske variasjoner, som er vanskelig å oppdage med tilstrekkelig statistisk betydning når du bruker en liten gruppe av dyr. Høy effekt for påvisning (POD) er faktisk nødvendig å oppdage med tillit noen betydelig variasjon i atferd og å begrense falske positive resultater25.
Her har vi beskrev en rekke protokoller basert på en nylig rapportert automatisert screening metode for C. elegans, bredt felt-of-view Rundormer sporing plattform (WF-NTP)36. Protokollen beskrevet her er delt inn i 5 deler. Del 1 og 2 beskriver utarbeidelse av store ormen populasjoner. Avgjørende skritt er sterilitet av arbeidsforholdene og forberedelse av reagenser og plater nødvendig å kjøre eksperimenter. Vi oppmerksom på at på grunn av den økte gjennomstrømningen av denne protokollen sammenlignet med andre screening metoder36, det krever også økt mengder reagenser; denne faktoren må vurderes nøye i eksperimentell design. Vi har også oppmerksom på at bleking trinnet er kritisk, og må testes på forhånd som et stort antall egg og sunn Larvene er nødvendig å kjøre disse eksperimentene. Del 3 av denne protokollen detaljer hvordan du kan levere narkotika i solid media og skjermen ormen populasjoner. Vi oppmerksom på at denne delen av protokollen er sterkt avhengig av narkotika og narkotika konsentrasjoner skal testes av brukeren i parallell. Full automatisering av screening prosedyre og rask datainnsamling skifte begrensende trinnet fra atferdsmessige observasjon forberedelse av reagenser, vekst og synkronisering av store ormen populasjoner. De viktigste trinnene under atferdsmessige screening er tidsberegningen for opptak og noen ormen håndtering trinn (f.eks, overføring av ormer fra NGM platene til sporing plattform). Protokollen beskrevet her er et eksempel for skjermen ormer for opptil 9 dager under voksen levetid; men kan denne protokollen lett tilpasses skjermen så mange tid poeng som brukeren ønsker, f.eks 18 dager36. Del 4 deretter illustrerer bruk av protokollen for å levere protein molekyler (f.eks antistoffer og molekylære chaperones) i C. elegans, og viser hvordan protokollen illustrert i deler 1-3 kan lett tilpasses avhengig av ønsket program. Viser vi hvordan denne prosedyren kan utvides ikke bare til levering av narkotika-lignende molekyler, men også for administrasjon av molekylære chaperones eller antistoffer37. De første fire trinnene (deler) utføres under sterile forhold, Hvis ingenting annet. Alle flytende komponenter skal autoklaveres før bruk og inkubasjon trinnene bør utføres på 70% relativ fuktighet. I del 5 beskriver vi hvordan du bruker programvarepakken i kombinasjon med sporing scenen. Denne programvaren er tilpasset designet for analyse av WF-NTP data relatert til atferden til store ormen populasjoner. Vi foreslår at du følger retningslinjene gitt i del 5 for dataanalyse; disse parameterne er imidlertid avhengig av bestemte funksjoner i innspilte videoer (dvs. fps, synsfelt, skjermoppløsning, antall ervervet rammer). Funksjonen eksempel i GUI er utviklet for å lette evalueringen av riktig parameter før analysen.
Rekken av protokollene gjør det mulig å analysere av fenotyper i store befolkningsgrupper C. elegans (for tiden opp til 5000 personlige ormer parallelt) effektivt, redusere gjenstander på grunn av iboende variasjon av oppførselen til dyrene , med forstudier på kraften i gjenkjenning nødvendig for å oppnå statistiske betydning for studier av C. elegans25. Plattformen bruker et system av høyoppløselige kameraer, dugelig av innspillingen bilder av mange dyr med høy hastighet, mens den samtidig tar flere store kohorter. Høy ytelse og høy gjennomstrømning av WF-NTP-protokollen gjør det mulig å finne veldig små endringer i ormen atferd i en svært nøyaktig måte. Derfor kan denne metodikken nye tilnærminger vurderes ikke bare for studiet av biologi C.elegans, men i tillegg for farmakologiske og medisinsk forskning, som høy gjennomstrømming screening av genetiske modifikasjoner og narkotika behandlinger. Denne prosedyren har også fordelen at lammelse studier utføres i parallell med andre opptreden mål, en viktig funksjon i molekylær screening undersøkelser.
Resultatene som er oppnådd hittil i stoffet funnet programmer AD15,34,35 og PD18 demonstrere viktigheten av bredt felt-of-view datainnsamling vesentlig øke den antall dyr som kan måles i et enkelt eksperiment, og dermed betydelig redusere eksperimentelle feilene og sterkt forbedre statistiske gyldigheten av studiene. Mens den nåværende tilnærmingen som beskrevet i denne protokollen har fokusert på å møte utfordringene innen medisiner, vi håper at metodikken vil bli allment vedtatt i samfunnet, og at programmet vil bli utvidet til komplekse genetiske og atferdsmessige studier og utvide antall fenotyper som er nå synlig.

Omtrent et halvt århundre siden, Sydney Brenner introdusert Caenorhabditis elegans (C. elegans) som et modellsystem utvikling og nevrobiologi, som denne lille (1 mm i lengde), gjennomsiktig Rundormer orm er lett å manipulere genetisk og opprettholde i laboratoriet1. I dag, brukes C. elegans til å studere en rekke biologiske prosesser inkludert apoptose, celle signalisering, innholdet i cellen syklus, gene regulering, metabolisme og aldring2. Videre cellular og vev kompleksiteten, protein uttrykk mønstre og bevaring av sykdom veier mellom C. elegans og høyere organismer (80% av ormen gener har en menneskelig orthologue), koblet med enkelhet og kostnadseffektivitet dyrking, gjør det en effektiv i vivo modell organisme mottakelig for høy gjennomstrømming genetisk3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 og narkotika14,15,16 screenings. For alle disse grunner, har C. elegans vært ansatt karakterisering av normal og sykdom-relaterte molekylær baner; innen neurodegeneration, for eksempel aktivert det utforskningen av effektene av aldring på protein aggregering3,4,7,15,17, 18, og karakterisering av arrangører og hemmere av protein aggregering3,4,5,6,7,14, 18.
Generelle egnethet av ormer, som er en viktig atferdsmessige parameter defineres i denne studien, kan måles manuelt i en rekke måter, som ved å telle antall kroppen svinger per minutt (BPM)4,6, 19, eller måle hastigheten på bevegelsen20,21,22og måle gjennomsnittlig levetid og utbredelsen av lammelse. Selv om manuelle målinger av kroppen bøyer og hastigheten på bevegelsen har ført til mange viktige innsikter til en rekke molekylær stier og mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuelle analyser fortsatt er lav-gjennomstrømming svært arbeidskrevende og tidkrevende mens blir utsatt for feil og menneskelige fordommer. Disse problemene presenterer betydelige utfordringer i innsamling av data med tilstrekkelig statistisk styrke å skille subtile atferdsendringer. Denne begrensningen er spesielt relevant for narkotika screening som behandlinger med potensielle stoffet molekyler ofte fører til små fenotypiske endringer24, som krever studiet av store antall dyr for å erverve reproduserbar resultater. For å illustrere dette punktet, har nyere studier vist at en høy makt gjenkjenning (POD) er nødvendig å definere med tillit noen vesentlige endringer i atferd og å begrense falske positive resultater25. Dette har resultert i en sterk motivasjon i C. elegans samfunnet å erstatte manuelle telle med reproduserbare, automatiserte tid - og kostnadseffektive målinger. For å møte denne etterspørselen, har flere laboratorier nylig utviklet metoder for høy følsomhet målinger og nøyaktig ormen sporing av større antall ormer22,26,27,28 ,,29,,30,,31,,32,,33.
For å utvide videre prosessen med automatisering til store kohortene dyr nødvendig for statistisk signifikant målinger, har vi nylig utviklet et bredt felt-of-view Rundormer sporing plattform (WF-NTP)15,34 ,35,36, som gjør samtidige etterforskningen av flere fenotypiske readouts på svært store ormen befolkninger, en nøkkelfaktor i statistisk relevante phenotypical gjenkjenning25. Ikke bare kan WF-NTP nå overvåke opptil 5000 dyr parallelt, men fenotypiske readouts også inkludere flere parametere, inkludert frekvens og amplitude kroppen svinger, hastigheten på bevegelsen, brøkdel av befolkningen som er lammet, og størrelsen på dyrene. Det er derfor lett kan skjermen tusenvis av worms parallelt og kombinere ulike readouts i kart opptreden å opprette en flerdimensjonal fingeravtrykk36. Den tilknyttede åpen kildekode-programvaren er skrevet i Python, som er også nødvendig å operere det og er helt passelig. Et grafisk brukergrensesnitt (GUI) finnes også at brukerne å vedta denne teknologien.
Her presenterer vi en rekke protokoller som illustrerer noen av de mulige anvendelser av WF-NTP. Spesielt vi diskutere av forbindelser mellom små molekyler protein therapeutics, og beskriver hvordan du skjermen deres effekter rett over store bestander av ormer, dermed effektivt fjerne behovet å prøve små Sub-populasjoner. Bruk av WF-NTP for slikt formål har allerede brakt betydelige fordeler i å utforme narkotika oppdagelsen programmene i Alzheimers sykdom (AD)15,34,35 og Parkinsons sykdom (PD)18-prosedyrer bruker i vivo data til vurdering av terapeutiske kandidater35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans er en veletablert dyr modell i biomedisinsk forskning, viden ansatt i funksjonell genomforskning og aldring studier. For å vurdere helse og fitness av dyr under studien, avhengig en typisk motilitet readouts, for eksempel måling av antall kroppen Bend eller hastigheten på bevegelsen. Disse målingene innebærer vanligvis manuell teller, gjør det utfordrende å få god statistisk betydning, som tid og arbeid begrensninger ofte begrense antall dyr i hvert eksperiment 25 eller mindre. Siden høy statistiske makt er nødvendig for å oppnå reproduserbar resultater og begrense falske positive og negative resultater når svake fenotypiske effekter er undersøkt, innsats har nylig blitt gjort å utvikle automatisert fokusert på å øke den Følsomheten av motilitet deteksjon og flere parametrisk atferdsmessige profilering. For å utvide grensen for påvisning til nivået som er nødvendig for å fange liten fenotypiske endringer er ofte avgjørende genetiske studier og medisiner, beskriver vi her en teknologisk utvikling som muliggjør studiet av opp til 5000 enkelte dyr samtidig, statistiske makt målinger av 1000 ganger sammenlignet ca manuelle analyser og 100-fold forhold om til andre tilgjengelige automatiserte metoder.

Enkel drift, multiparametric analyse og høy gjennomstrømning av illustrert WF-NTP-protokollen (tall 1 og 2) gjør det mulig å finne veldig små endringer i ormen atferd i en svært nøyaktig måte. Tenkelig plattformen er basert på skreddersydde opto-mekanikk, og det kan settes sammen med en 6 MP monokrom kamera kombinert med 16 mm brennvidde høyoppløselig linse for 1'' sensor, opplyst med 8'' 8'' hvit backlight (se Tabell for materiale og også referanse36 for flere detaljer). Den tilknyttede WF-NTP-programvaren er skrevet i Python og ble utviklet for å kjøres på Windows-plattformer. Det kjører på en egendefinert montert datamaskin 3.00 GHz octa prosessorer og 64 GB random access memory (RAM). Programmet ble designet for å parallelize arbeidet og video analyse basert på RAM og CPU av datamaskinen. dvs, en maskin med en lavere beregning vil resultere i mindre videoer kjøre parallelt. Oppsettet vi bruker er optimalisert for å kjøre opp til ca. 16 videoer parallelt og kan fullføre en analyse av ca. 100 videoer over natten. Videre kan høye detaljnivået tilpasning i grafiske av WF-NTP stor kontroll av kvaliteten på tenkelig analysen. GUI kan brukes til å direkte laste opp store datasett i parallell eller personlige videoer; bestemte rammer kan også velges for detaljert sub analyse, samt en piksel Omregningsfaktor, som kan brukes til å beregne atferdsmessige beregninger. En av de to ulike sporingsprogrammer algoritmene (holde død og Z-transform) kan velges avhengig av hvorvidt brukeren ønsker å vurdere lammet dyr i analysen. Parameteren terskelverdi kan være innstilt tilsvarende med video og eksperimentelle. Åpning og lukking parametere lar brukeren å fjerne støy og implementere ytterligere terskelverdi funksjoner. Skeletonizing algoritmen tilbyr en alternativ metode for analyse. De objekt størrelse avskjær (filtrering) gir en ekstra filter for bakgrunnsstøy og parameteren ormen som tillater brukeren å vurdere ormer bare objekter med en ellipsoidisk form, dermed skille fra andre objekter som har samme pixel størrelse på ormer. Etter disse terskelverdi operasjoner, alle resulterende merket regioner kan identifiseres som individuelle ormer og plasseringen av disse regionene lagres for hver ramme for påfølgende analyse og sporing. Eksentrisitet hver sporede ormen brukes til å beregne de orm beregningene som omfanget av ormen bøying (BPM) som en funksjon av tid. Brukerne kan også velge antall rammer å holde en orm i minnet av programvaren etter kollisjoner og antall piksler som en orm kan flytte mellom rammer kan også stilles inn for å skille dyrene fra støy. Alternativet minste spor lengde tillater brukeren å forkaste ormer som ble sporet i bare noen få frames. Andre viktige parametre, som svinger og hastighet, kan brukeren velge graden av bøying nødvendig å bli regnet som en kropp sving og antall rammer anses å være nødvendig for å beregne hastigheten på dyrene. Cut-off parametere kan være ytterligere innstilt for inkludering av lammet dyr. Resultatet vises automatisk i resultat-filene. Disse verdiene blir betraktet som øvre grensene for vurdering av brøkdelen av lammet dyr. Brukeren kan også velge ett eller flere områder av interesse. Denne funksjonen er spesielt nyttig for å analysere subpopulasjoner av ormer og utdataene sorteres automatisk i resultatfiler. Alternativet utdata lar brukeren velge arbeidsytelsen brosjyre og antall sporing rammer som produseres for det. Forskjellige verktøysett kan også brukes for ytterligere dataanalyse, som handlingen banen verktøyet som viser personlige ormen spor og fingeravtrykk verktøyet som lar brukeren opprette fingeravtrykk kart.
Denne metoden gjør det mulig for nye tilnærminger til vedtas, ikke bare for biologiske studier av C. elegans , men også for farmakologiske og medisinsk forskningsformål, for eksempel høy gjennomstrømming screening av genetiske modifikasjoner og medikamentelle behandlinger. Vi har illustrert dette potensialet ved å beskrive karakterisering av fenotyper for store befolkningsstudier (N > 1000) av ulike ORM-modeller av nevrodegenerative sykdommer (frontotemporal demens (FTD)39, Parkinsons sykdom (PD)7 , Alzheimers sykdom (AD)16,40, og amyotrofisk lateral sklerose (ALS)19 (figur 3a) og karakterisere effekten av potensielle terapeutiske molekyler med ORM-modeller PD18 og AD 15,12 (figur 3b). To små molekyler, squalamine18 og bexarotene15, var administrert konsentrasjoner opptil 25 µM PD (figur 3b) og 10 µM til AD38 (figur 3b) ormer, henholdsvis. Begge forbindelser viste klart doseavhengig effekt over en rekke konsentrasjoner testet. Vi har vist at dette høy nøyaktighet av målene er oppnådd ved å øke antall ormer som kan analyseres sammenlignet med tradisjonelle metoder (Figur 3 c). Vi illustrert betydningen av utvalgsstørrelsen (Figur 3 c) i molekylær screening også som karakterisering av mutant stammer. Økningen i temperaturen fra 20 ° C fører til omtrent halvparten av ormene Annonsen bli lammet etter 3 dager for voksen. Ormen bestander ble vist under forskjellige forhold, f.eks, når ormer over uttrykke 42-rester form av amyloid-β peptid (Aβ1-42) (AD ormer) ble utsatt for subtile temperatursvingninger (Figur 3 c, venstre panel), når Aβ1-42 ble uttrykt i alle neurons (Figur 3 c, sentrale panelet), eller når Annonsen ormer ble utsatt for bexarotene (Figur 3 c, høyre panel). Ormer ble også analysert fra små ROIs tilfeldig valgt fra hele synsfeltet videoer kjøpt med WF-NTP (N < 50, gul barer) fremhever sammenligningen av motilitet i disse ormene med gjennomsnittlig motilitet i befolkningen hele Orm (N < 1000). I alle panelene, forskjellen målt på hele orm befolkningen synes å være statistisk signifikant med p ≤ 0,0001 (*).
WF-NTP protokollen beskrevet her kan også samtidig opptak av flere parametere (figur 1b) å støtte optimalt, både interne validering og utvikling av et omfattende fingeravtrykk av en rekke forhold forhold til en kontroll prøven, slik at meningsfull sammenligninger over flere undersøkelser. Denne multi parametrisk tilnærmingen omfatter samtidige analyse av flere atferdsmessige funksjoner, inkludert bøying frekvens, hastighet, lammelse hastighet, størrelse, bøy amplitude og bøy forskyvning36. Dette gjør tusenvis av dyrene overvåkes i stor detalj og en meget høy følsomhet og statistisk betydning og gir muligheter for store befolkningsgrupper studier. Denne sporing prosedyren har også fordelen at lammelse studier utføres i parallell med andre opptreden mål, en viktig funksjon i molekylær screening undersøkelser.
Resultatene som er oppnådd hittil i AD15,34,35 og PD18 stoffet funnet viser betydningen av bredt felt-of-view datainnsamling øke antall dyr som kan overvåket i et enkelt eksperiment, betydelig redusere eksperimentelle feilene og sterkt forbedre statistiske gyldigheten av studiene. Basert på disse resultatene, forventer vi at den WF-NTP-protokollen, som vi gjort tilgjengelig for samfunnet36, vil merkbart øker bruken av C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Figur 1: WF-NTP analyse trinnene og eksempel på et fingeravtrykk. (et) 1. Opprinnelige videoen. 2. bakgrunnsbilde. 3. bakgrunn trekkes bildet. 4-6. trinn for terskelverdi. 7-9. enkelt merking av ormer. (b) flere fenotyper rapporteres med et fingeravtrykk for vill-type ormer og ormen modeller av PD og Annonsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Figur 2: grafisk bruker grenseflate (GUI) av WF-NTP. Bestemte videoer og valgte rammer kan velges i GUI for analyse, og en piksel konverteringsfaktor kan settes, hvoretter analyse er gjennomført med en av de to gitte sporing algoritmene. Det er mulig å velge graden av bøying nødvendig å telle som en kropp sving samt antall rammer for å beregne hastigheten på dyrene. Body svinger og hastighet terskler kan finne lammet ormen statistikken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Figur 3: eksempler på programmer som er aktivert av WF-NTP-metoden. (en) program av WF-NTP i store befolkningsstudier (N > 1000) av BPM målinger for C. elegans modeller av en rekke nevrodegenerative sykdommer inkludert FTD, PD, annonse, og ALS. (b) søknaden av WF-NTP i stoffet funnet. (c) betydningen av befolkningsstudier i temperatur følsomhet, narkotika effekt og mutert stamme karakterisering. Fenotyper subpopulasjoner N < 50 (gul barer) sammenlignes med de av befolkningen hele Orm (N < 1000). Feilfeltene angir standard feil av gjsnitt (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatisert atferdsdata analyse av store C. elegans bestander bruke et bredt felt-of-view sporing Platform

Vi beskriver protokoller for bruker bredt felt-of-view Rundormer sporing plattformen (WF-NTP), som gir høy gjennomstrømming fenotypiske karakteristikk av store bestander av Caenorhabditis elegans. Disse protokollene kan brukes til å beskrive subtile atferdsendringer i mutant stammer eller som svar på farmakologisk behandling i en skalerbar måte.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Så denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i en narkotikaoppdagelsesprosess om hvordan et bestemt stoff oppfører seg i en levende organisme. Den største fordelen med denne teknikken er at det tillater store prøvestørrelser å bli screenet raskt og effektivt. Denne teknikken har allerede en stor innvirkning i narkotikaoppdagelsen ved å muliggjøre en svært quanititativ vurdering av effekten av narkotikakandidater.Denne metoden gir ny mekanistisk innsikt i utbruddet og utviklingen av feilfolding sykdommer. Videre kan denne metoden også brukes på andre systemer, for eksempel aldring og genetiske screeninger. Vi er veldig glade for denne muligheten til å introdusere nye fysiske metoder i rommet for narkotikaoppdagelse.Disse demonstartionene av denne metoden er kritiske da screeningtrinnene krever høy kjennskap til denne automatiske teknikken. Å demonstrere prosedyren vil være Sam Casford, en søkeassistent fra laboratoriet vårt. Før du begynner prosedyren, tilsett 2,2 millileter av hver legemiddelforbindelse ved riktig konsentrasjon til seks 5-fluorodeoksyuridin- eller FUDR-plater per ormstamme, ved å forsiktig spre forbindelsen over hele overflaten av platen, og tørk platene under sterile forhold.Mens platene tørker, bruk 15 milliliter M9-buffer for å vaske ormene fra fem rike nematodevekstfaktorplater, og overfør de frigjorte ormene til et konisk rør for sentrifugering. Re-suspendere nematodene i tre milliliter frisk M9 buffer for kvantifisering av antall ormer i L4 larvalstadiet, og frø 700 L4 larver på hver av de seks tørre FUDR-platene per ormstamme, per forbindelse. Når alle nematodene er sådd, plasser platene som inneholder stammene som parlyse induseres for ved å øke temperaturen ved 24 grader celsius i 24 timer.Neste dag slår du på scenelysene til den parallelle ormtrackeren, og rengjør glassstadiet til trackeren med 70 prosent etanol. Hvis det ikke gjenstår synlige rester, fjerner du linsehetten og bruker en luftstøver til å rengjøre bildelinsen. Kontroller at kameraet er riktig koblet til og installert, og start opptaket med bildeopptaksprogramvaren.Juster kamerainnstillingene for å ta opp 20 bilder per sekund, med de riktige mono-16 opptaksparametrene. Bruk en tom, ni centimeter petriskål for å sikre at scenen er satt til riktig høyde, og juster scenen om nødvendig. Under sterile forhold, tilsett tre milliliter M9-løsning til en motilitetsscreeningsplate, og bruk to milliliter M9-løsning for å vaske en tredjedel av overflatearealet på to nematodelastede FUDR-plater fra samme eksperimentelle gruppe inn i screeningplaten.Plasser deretter screeningplaten på tracker-scenen. Bruk en enkelt orm til å fokusere kameraet, og begynn å registrere dyrene. Når opptaket er fullført, kast motilitetsplaten og merk FUDR-platene som brukes én gang før du returnerer dem til inkubatoren.For å analysere videodata, åpne parallell orm tracker dataanalyse programvare grafisk brukergrensesnitt, og bruke leserfunksjonen til å laste inn videoen av interesse. Velg en målmappe for utdata, og bekreft at 600 til 1200 bilder er angitt for en 30 sekunders analyse. Sett inn en 0,029 piksel til millimeterkonverteringsfaktor for avbildning av en ni centimeter petriskål med full oppløsning, og velg keep dead tracking algorithhm.Under kategorien lokaliseringsparametere setter du Z-bruksbildene til 100, Z-polstringen til 3, standardpisslene til 54, terskelen til 9, åpningen til 1 og avslutningen til 2. Juster filtreringsparametrene til en minimumsstørrelse på 20, en maksimal størrelse på 180 og en orm som 0,94. Sett parameterne for formingsbaner til et maksimalt avstandstrekk på 10, en minimumslengde på 150 og et minne på 10.Sett sving- og hastighetsparametrene til en terskelterskel for bøyer på 1,8, et minimumsbøy på 0 og en ramme for å estimere hastighet på 150. Tune den døde ormen statistikk til en maxmim beat per minutt på 5, og en maksimal hastighet på 1. Velg utdatamappen, og velg antall utdatarammer til 50, og skriftstørrelsen til 10.Bruk eksempelfunksjonen til å teste parameterne og sende ut eksempelbildene for å kontrollere om ormene er synlige gjennom de åtte terskeltrinnene. Start deretter Start jobb-funksjonen, og kombiner de individuelle resultatene for hele datasettet for å analysere testresultatfilene, og lagre resultatene via funksjonen eksport til TSV. Denne metoden tillater karakterisering av nematode fenotyper for store populasjonsstudier av ulike ormmodeller av nevrodegenerativ sykdom, som Frontotemporal Demens, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose.I tillegg til karakterisering av effekten av potensielle terapeutiske molekyler, ved hjelp av orm modeller av Parkinsons og Alzheimers sykdom. Den høye nøyaktigheten av disse målingene oppnås ved å øke antall ormer som kan analyseres sammenlignet med tradisjonelle metoder. Mens du utfører denne prosedyren, er det viktig å huske å minimere tiden mellom tilsetning av ormene til motiliteten og begynnelsen av sporingen.Etter denne prosedyren kan andre metoder utføres for å supplere resultatene og å koble til proteinaggregasjon. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen nevrodegenerative og feilfoldingssykdommer, som Parkinsons og Alzheimers, for å utforske de riktige oppdagelsesprogrammene. Ikke glem at det å arbeide med FUDR kan være ekstremt farlig, og forholdsreglene, for eksempel bruk av nitrilhansker, bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Telling av Store perifert blod leukocytter populasjoner multisenter kliniske studier med en Fullblod fenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatisert Separering av<em&gt; C. elegans</em&gt; Trinnløs kolonisert av en bakteriell Patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Gene Expression Profilering infisere Mikrober bruke et digitalt Bar-koding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En semi-automatisert tilnærming til Klar Antistoff Cocktails for Immunophenotypic analyse av perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Multipleks cytokin profilering av stimulert musen Splenocytes bruker en Cytometric Bead-baserte immunanalyse plattform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Innsamling og behandling av Lymph noder fra store dyr for RNA analyse: forbereder lymfeknute Transcriptomic studier av store dyrearter

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

En høy gjennomstrømning, høyt innhold og vannbasert C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...