Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Эта работа была поддержана Центром по сворачиванию заболеваний (CMD). АВС поддерживается старший стипендия исследований Альцгеймера общества, Великобритания (Грант номер 317, AS-SF-16-003). Штаммы C. elegans были получены из Caenorhabditis elegans генетического центра (CGC).

Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов.

Из-за быстрого расширения методов в области оптических наук стало возможным удовлетворить требование для автоматизированных методов в C. elegans исследований существенно новыми способами. В результате были разработаны и доступны через ряд цифровых отслеживания платформы20,41,42,,4344,45,46 за последние несколько лет для того, чтобы заменить ручной подсчет параметров, таких как скорость движения, изгиб частоты, паралич курс, а также более сложных форм поведения, таких как Омега повороты и измерения жизни. Самые последние автоматизированные платформы значительно улучшили воспроизводимость и чувствительность C. elegans учится41 и высокое качество данных на малых групп или даже отдельных животных. Мы решили продлить автоматизации анализа червя поведение, чтобы сделать его также можно оценить фенотипов когорты тысяч животных параллельно. Главное преимущество подхода изучения когорты червь является, что она позволяет для учета высокая внутренняя изменчивость червь поведение24 и тот факт, что исследования наркотиков лечения часто приводят к тонкие фенотипические изменения, которые сложно определить с достаточной статистической значимости, когда с помощью небольшой группы животных. Высокая мощность обнаружения (POD) действительно необходимо обнаружить с уверенностью значительных изменений в поведении и ограничить25ложных положительных результатов.
Здесь мы описали ряд протоколов, основанных на методе недавно сообщили автоматизированной проверки для C. elegans, широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)36. Протокол, описанные здесь делится на 5 частей. Части 1 и 2 описывают подготовку населения больших червя. Важнейшие шаги являются стерильности условий работы и подготовка реагентов и пластин, необходимых для выполнения экспериментов. Мы отмечаем, что, за счет увеличения пропускной способности, предоставленные настоящим Протоколом, по сравнению с другими отбора методологий36, она также требует увеличения количества реагентов; Этот фактор необходимо тщательно рассматривать в экспериментальный дизайн. Мы также отмечаем, что отбеливание шаг имеет решающее значение и должна испытываться заранее как большое количество яиц, и здоровых личинки необходимы для запуска этих экспериментов. Часть 3 настоящего Протокола сведения для доставки препаратов в твердых носителей и экран червь населения. Мы отмечаем, что эта часть протокола сильно зависит количество наркотиков и концентрации препарата быть проверен пользователем параллельно. Полная автоматизация процедуры проверки и быстрого сбора сдвиг ограничивающим шаг от поведенческие наблюдения Подготовка реагента и роста и синхронизации больших червь населения. Основные шаги в ходе скрининг являются тайминги записи и любой червь, обработка шагов (например, передача червей от NGM пластины для отслеживания платформы). Протокол, описанные здесь приведен пример предназначен для экрана червей до 9 дней в течение взрослой жизни; Однако этот протокол может быть легко адаптированы для экрана как много времени, как желания пользователя, например, 18 дней подряд36. Часть 4 затем иллюстрирует применение протокола доставить белковых молекул (например, антител и молекулярных сопровождающих) в C. elegansи показывает, как протокол, показано в части 1-3 можно легко настроить, в зависимости от желаемого приложения. Мы демонстрируем, как эта процедура может быть расширена, не только для доставки наркотиков как молекул, но и для отправления молекулярной сопровождающим или антител37. Первые четыре шага (части) проводятся в стерильных условиях, если не указано иное. Все жидкие компоненты должны быть газобетона до использования и инкубации шаги должны выполняться на 70% относительной влажности. В части 5 мы опишем, как использовать пакет программного обеспечения, в сочетании с этапа отслеживания. Это программное обеспечение было пользовательских предназначен для анализа данных WF-NTP, связанные с поведением населения больших червя. Мы предлагаем, что пользователь соответствует рекомендации, представленные в части 5 для анализа данных; Однако эти параметры зависят от конкретных особенностей записанные видео (то есть, fps, поле зрения, разрешение видео, количество приобретенных кадров). Следующий пример функции в графический интерфейс был разработан для облегчения оценки правильные параметры до анализа.
Эти серии протоколов позволяют анализировать фенотипов больших популяций C. elegans (в настоящее время до 5000 отдельных червей параллельно) эффективно, уменьшения артефактов вследствие внутренней изменчивости поведения животных , по согласованию с предварительные исследования по мощности обнаружения, необходимых для достижения статистической значимости для исследования C. elegans25. Платформа использует систему камер высокого разрешения, способна записывать изображения большого числа животных на высокой скорости, при записи одновременно несколько большие когорты. Высокая производительность и высокая пропускная способность протокола WF NTP делает его возможным определить очень небольшие изменения в поведение червя в очень точным образом. Таким образом эта методика позволяет новые подходы могут считаться не только для изучения биологии C. elegans, но дополнительно для медицинских и фармакологических исследований, например высокопроизводительного скрининга генетической модификации и наркотиков лечение. Эта процедура также имеет то преимущество, позволяя паралич исследования выполняться параллельно с другими поведенческие измерения, ключевой особенностью в молекулярной скрининговых исследований.
Результаты, достигнутые до настоящего времени в программах обнаружения наркотиков AD15,,3435 и PD18 продемонстрировать важность сбора данных широкого поля зрения в существенного увеличения количество животных, которые могут контролироваться в одном эксперименте, тем самым значительно уменьшается экспериментальной ошибки и значительно улучшение статистической достоверности исследований. Хотя нынешний подход, описанный в этом протоколе была сосредоточена на решении проблем в области лекарственных препаратов, мы надеемся, что методология будет широко принят в сообществе, и что его применение будет продлен до сложных генетических и поведенческие исследования и расширить количество фенотипов, которые в настоящее время обнаружено.

Примерно полвека назад, Сидней Бреннер представил Caenorhabditis elegans (C. elegans) как модель системы для изучения развития и нейробиология, как этот маленький (1 мм в длину), прозрачный червя нематоды легко манипулировать генетически и поддерживать в лаборатории1. Сегодня C. elegans используется для изучения широкий спектр биологических процессов, включая апоптоза, сигнализации ячейки, характер клеточного цикла, регулирование гена, метаболизм и старения2. Кроме того клеточные и тканевые сложности, шаблоны выражение протеина и сохранению болезни пути между C. elegans и высших организмов (80% червь генов у человека orthologue), связанный с простотой и рентабельность выращивания, сделать его эффективным в естественных условиях организм модель поддаются высок объём генетических3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 и наркотиков14,,1516 фильмов. По всем этим причинам C. elegans был нанят для характеристики нормального и связанных с болезнью молекулярные пути; в поле нейродегенеративные например, это позволило изучение последствий старения белка агрегации3,4,7,15,17, 18и квалификация промоутеров и ингибиторы протеин агрегации3,4,5,6,7,14, 18.
Общая фитнес червей, который является важным параметром поведенческих должен быть определен в этот тип исследования, может быть измерен вручную в различных способов, таких как подсчитывать количество изгибов тела в минуту (BPM)4,6, 19, или путем измерения скорости движения20,21,22, а также путем измерения средняя продолжительность жизни и уровень паралич. Хотя ручного измерения изгибы тела и скорость движения привели к многие важные идеи в различных молекулярных пути и механизмы3,4,14,19, 20,23, ручной анализов остаются в настоящее время низкая пропускная способность, весьма трудоемким и длительным, находясь склонны к ошибкам и человеческого предубеждения. Эти вопросы представляют значительные трудности в сборе данных с достаточной статистической мощностью, чтобы различать тонкие поведенческие изменения. Это ограничение является особенно актуально для наркотиков скрининг как лечение с потенциальными наркотиков, что молекулы часто приводят к небольшой фенотипические изменения24, поэтому требующих изучения большого числа животных для того чтобы получить воспроизводимые результаты. Чтобы проиллюстрировать это, недавние исследования показали, что большой мощности обнаружения (POD) необходимо определить с уверенностью любые значительные изменения в поведении и ограничить25ложных положительных результатов. Это привело к сильной мотивации в C. elegans сообщество заменить ручной подсчет с измерений воспроизводимы, автоматизированный, время - и экономичным. Для удовлетворения этого спроса, несколько лабораторий недавно разработали методы для высокой чувствительности измерения и отслеживания точных червь большего числа червей22,26,27,28 ,,2930,,3132,33.
С целью дальнейшего расширения процесса автоматизации в большой когорты животных, необходимых для статистически значимых измерения, мы недавно разработали широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)15,34 ,35,36, который позволяет одновременное исследование несколько фенотипических отсчетов на очень больших червь населения, является ключевым фактором в статистически значимым фенотипические обнаружения25. Не только может WF-NTP в настоящее время контролировать до 5000 животных параллельно, но фенотипические индикацию также включают в себя несколько параметров, включая скорость и амплитуду изгибы тела, скорость движения, доля населения, парализована, и Размер животных. Поэтому легко можно экран тысячи червей параллельно и объединить различные индикацию в поведенческих карту для создания многомерных отпечатков пальцев36. Связанные открытым исходным кодом программного обеспечения написана на Python, который также необходим для работы и полностью настраиваемый. Графический интерфейс пользователя (GUI) также предоставляет возможность пользователям принять эту технологию.
Здесь мы представляем ряда протоколов, которые иллюстрируют некоторые из возможных применений WF-NTP. В частности мы обсудим администрация соединений, начиная от маленьких молекул белка терапии и описывают, как экран их эффекты непосредственно над большим населением червей, таким образом, эффективно устраняя необходимость образец небольшой подгрупп населения. Использование WF-NTP для этой цели уже принесло значительные преимущества в процедурах, направленных для разработки программ обнаружения наркотиков болезни Альцгеймера (AD)15,,3435 и болезни Паркинсона (PD)18 с использованием в естественных условиях данных для оценки кандидатов-терапевтических35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans является устоявшейся животной модели в биомедицинских исследований, широко используемых в функциональной геномике и старения исследований. Для оценки здоровья и фитнеса животных под исследование, один обычно полагается на моторику отсчетов, такие как измерение количество изгибов тела или скорость движения. Эти измерения обычно включают ручной подсчет, что делает его трудно получить хорошее статистической значимости, как время и труд ограничения часто ограничивают количество животных в каждом эксперименте 25 или меньше. С высокой статистической мощности является необходимым для получения воспроизводимых результатов и ограничить ложные положительные и отрицательные результаты, когда слабый Фенотипическая воздействию исследованы, недавно были предприняты усилия для разработки автоматизированных протоколы, направлена на повышение чувствительность обнаружения моторики и несколькими параметрическими поведенческая Профайлинг. Для того чтобы расширить предел обнаружения до уровня, необходимого для захвата малых фенотипические изменения, которые часто играют решающую роль в генетических исследованиях и обнаружения наркотиков, мы опишем здесь технологического развития, который позволяет исследование до 5000 отдельных животных одновременно увеличивая статистической мощности измерения около Гарибова по сравнению с ручной анализов и около 100 раз по сравнению с других доступных автоматизированных методов.

Простота эксплуатации, многопараметрических анализа и высокую пропускную способность иллюстрированный WF-NTP протокол (рисунки 1 и 2) делает возможным определить очень небольшие изменения в поведение червя в очень точным образом. Платформа отображения информации основана на заказ опто механики, и он может быть собран с использованием 6 Монохромная камера MP, в сочетании с высоким разрешением объектив 16 мм фокусное расстояние для 1'' датчика, освещается с 8'' 8'' белая подсветка (см. Таблицу материалы и также ссылаться на36 для получения дополнительной информации). Соответствующее программное обеспечение WF-NTP написана на Python и был разработан для запуска на Windows платформах. Она работает на пользовательских собранный компьютер с 3,00 ГГц окта core процессоров и 64 ГБ оперативной памяти (ОЗУ). Программное обеспечение также была разработана для параллелизации работ и анализа видео, основанный в ОЗУ и процессор компьютера; т.е., машина с нижней расчет мощности приведет к менее видео параллельно. Настройки, которую мы используем в настоящее время оптимизирована для запуска ca. 16 видео параллельно и могут завершить анализ ca. 100 видео на ночь. Кроме того высокий уровень детализации в GUI WF-NTP настройки позволяет строже контролировать качество визуализации анализа. Графический интерфейс может использоваться напрямую загружать большие наборы данных в параллельных или отдельных видео; конкретные рамки также могут быть выбраны для детального анализа суб, вместе с пиксель коэффициент пересчета, который может быть использован для оценки поведенческих показателей. Один из двух различных отслеживания алгоритмов (держать мертвых и Z-преобразование) могут быть выбраны в зависимости от ли или не пользователь хотел бы рассмотреть парализованные животные в анализе. Параметр порог может быть соответственно настроенным с видео и экспериментальных качества. Открытие и закрытие параметры позволяют пользователю удалить шум и далее осуществлять Бинаризация функциональность. Skeletonizing алгоритм предлагает альтернативный метод анализа. Объект размер обрезков (фильтрация) обеспечивают дополнительный фильтр для фонового шума и червь как параметр позволяет пользователям рассматривать червей только объекты с эллипсоидальной формы, поэтому отличить от других объектов, которые могут иметь такой же размер пикселя черви. После этих операций Бинаризация все результирующие помечены регионы могут быть определены как отдельные червей и позиции этих регионов затем сохраняются для каждого кадра для последующего анализа и отслеживания. Эксцентриситет каждого отслеживаемого червя используется для оценки червь метрики, как степень червя, изгиб (BPM) как функцию от времени. Пользователи также могут выбрать количество кадров для держать червя в памяти программное обеспечение после столкновений, и количество пикселей, которые червь может перемещаться между кадрами также могут быть настроены различать животных от шума. Параметр длина минимум трек позволяет пользователю отменить червей, которые отслеживались для только несколько кадров. Других ключевых параметров, такие как изгибы и скорость, позволяют пользователю выбрать степень изгиба необходимо считать загиба тела и количество кадров, считается, что необходимо оценить скорость животных. Отключения параметров могут быть далее настроены для включения парализована животных. Выходные данные автоматически показывается в результирующих файлах. Эти значения рассматриваются как верхних пределов для оценки доли парализована животных. Пользователь также может выбрать одну или несколько областей, представляющих интерес. Эта функция особенно полезна для анализа субпопуляций червей и результат сортируется автоматически в файлы результатов. Параметр вывода позволяет пользователю выбрать папку вывода и количество отслеживания кадры, которые будут подготовлены для него. Различные наборы инструментов может также использоваться для дальнейшего анализа данных, такие как участок пути инструмент, который показывает отдельные червь треков и дактилоскопия инструмент, который позволяет пользователю создавать отпечатков пальцев карты.
Эта методология позволяет новые подходы, которые будут приняты, не только для биологических исследований C. elegans , но и для целей медицинских и фармакологических исследований, например высокопроизводительного скрининга генетической модификации и медикаментозного лечения. Мы продемонстрировали этот потенциал, описывая характеристика фенотипов крупных демографических исследований (N > 1000) различных моделей червь нейродегенеративные заболевания (frontotemporal деменции (FTD)39, болезни Паркинсона (PD)7 , Болезни Альцгеймера (AD)16,40и боковой амиотрофический склероз (ALS)19 (Рисунок 3А) и характеризующих последствия потенциальных терапевтических молекул с помощью модели червь PD18 и AD 15,12 (рис. 3b). Два маленьких молекул, скваламин18 и bexarotene15, вводили в концентрациях до 25 мкм PD (рис. 3b) и 10 мкм до AD38 (рис. 3b) червей, соответственно. Оба соединения показал ясно дозозависимый эффект в диапазоне концентраций испытания. Мы показали, что эта высокая точность измерений достигается путем увеличения числа червей, которые могут быть проанализированы по сравнению с традиционными методами (рис. 3 c). Мы свидетельствует о важности размер выборки (рис. 3 c) в молекулярной скрининга, а также как характеристика мутантных штаммов. Увеличение температуры от 20 ° C приводит к примерно половина AD червей, став парализована после 3 дней взрослой жизни. Червь населения были проверены в различных условиях, например, , когда черви, чрезмерно выражая 42-остатки формы амилоид β пептида (значения1-42) (AD черви) были подвержены тонкие температуры (рис. 3 c, слева Группа), когда значения1-42 было высказано в всех нейронов (рис. 3 c, Центральная панель), или когда AD червей были подвержены bexarotene (рис. 3 c, правая панель). Черви также были проанализированы от небольших трансформирования, случайно выбранных из полное поле зрения видео, полученные с WF-NTP (N баров < 50, желтый), подчеркнув сравнение сократительной способности этих червей с средняя подвижности населения всей червь (N < 1000). В всех панелей разница измеряется в целом червь населения представляется статистически значимое p ≤ 0,0001 (*).
WF-NTP протокол, описанные здесь также позволяет одновременная запись нескольких параметров (рис. 1b) для поддержки, оптимальным образом, внутренние проверки и разработки всеобъемлющей отпечатков широкий спектр условий по отношению к контрольной пробы, позволяя для значимого сопоставления через несколько исследований. Это мульти параметрический подход включает в себя одновременный анализ нескольких поведенческих особенностей, включая изгиб частоту, скорость, паралич ставка, размер, амплитуды изгиба и изгиб перемещения36. Это позволяет тысячи животных контролироваться очень подробно и очень высокую чувствительность и статистической значимости и предоставляет возможности для исследования больших групп населения. Эта процедура отслеживания также имеет преимущество, позволяя паралич исследования выполняться параллельно с другими поведенческие измерения, ключевой особенностью в молекулярной скрининговых исследований.
Результаты, достигнутые до настоящего времени в AD15,,3435 и PD18 лекарственных препаратов свидетельствуют о важности приобретения широкого поля зрения данных значительно увеличить количество животных, которые могут быть мониторинг в одном эксперименте, значительно уменьшается экспериментальной ошибки и значительно улучшение статистической достоверности исследований. На основе этих результатов, мы ожидаем, что WF-NTP протокол, который мы сделали доступными для сообщества36, будет значительно расширить использование C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Рисунок 1: WF-NTP шаги анализа и примером отпечатков. () 1. Оригинальное видео. 2. фоновое изображение. 3. фон вычитается изображения. 4-6. Бинаризация шаги. 7-9. единый маркировки червей. (b) несколько фенотипов сообщается с отпечатков пальцев для дикого типа червей и червь модели PD и AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Рисунок 2: графический пользовательский интерфейс (GUI) WF-NTP. Конкретные видео и выбранные кадры могут быть выбраны в GUI для анализа, и коэффициент пересчета пикселей может быть вставлен, после чего проводится анализ с одним из двух алгоритмов данной отслеживания. Это позволяет выбрать степень изгиба необходимо считать загиба тела, а также количество кадров, необходимых для оценки скорости животных. Тела поворотах и скорость порогов можно определить статистику парализована червя. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Рисунок 3: примеры приложений, поддерживающих WF-NTP методом. (a) приложения WF-NTP в крупных демографических исследований (N > 1000) измерений BPM для моделей C. elegans целого ряда нейродегенеративных заболеваний, в том числе FTD, PD, AD и ALS. (b) приложения WF-NTP в лекарственных препаратах. (c) важность демографических исследований в чувствительность температуры, эффективность препарата и характеристика мутантный штамм. Фенотипы субпопуляций N < 50 (жёлтые столбики) сравниваются с теми, кто всего червь населения (N < 1000). Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Автоматизированная поведенческого анализа больших C. elegans населения с помощью широкого поля зрения отслеживания платформа

Мы описываем протоколы для использования платформы широкое поле зрения нематоды отслеживания (WF-NTP), которая позволяет высок объём фенотипические характеристики больших популяций Caenorhabditis elegans. Эти протоколы могут использоваться для характеризуют тонкие поведенческие изменения в мутантных штаммов или в ответ на медикаментозное лечение в масштабируемой моды.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в процессе обнаружения наркотиков о том, как конкретный препарат ведет себя в живом организме. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет быстро и эффективно проверять большие размеры выборки. Этот метод уже оказывает значительное влияние на открытие наркотиков, позволяя весьма quanititative оценки последствий наркотиков кандидатов.Этот метод дает новые механистические идеи в начале и прогрессировании неправильного сфоливания заболеваний. Кроме того, этот метод может быть применен и к другим системам, таким как старение и генетические скрининги. Мы очень рады этой возможности внедрить новые физические методы в пространство обнаружения наркотиков.Эти demonstartions этого метода имеет решающее значение, как скрининг шаги требуют высокого знакомства с этим Ново автоматической техники. Демонстрацией процедуры будет Сэм Кейсфорд, помощник по поиску из нашей лаборатории. Перед началом процедуры добавьте 2,2 миллилетеров каждого лекарственного соединения при соответствующей концентрации в шесть 5-фтордоксиуридин или ФУДР пластины на штамм червя, тщательно распределив соединение по всей поверхности пластины, и высушите пластины в стерильных условиях.Пока пластины высыхают, используйте 15 миллилитров буфера M9 для мытья червей из пяти богатых пластин фактора роста нематод, и перенесите освобожденных червей в коническую трубку для центрифугации. Повторно приостанавливать нематод в трех миллилитров свежего буфера M9 для количественной оценки количества червей в личинок этапе L4, и семян 700 L4 личинок на каждом из шести сухих пластин FUDR на червя штамма, на соединение. Когда все нематоды были посеяны, поместите пластины, содержащие штаммы, для которых парлиз индуцируется путем повышения температуры на 24 градусов по Цельсию в течение 24 часов.На следующий день включите сценические огни параллельного трекера червя и очистите стеклянную сцену трекера 70-процентным этанолом. Если видимых остатков не осталось, снимите крышку объектива и используйте воздушный тряпку для очистки объектива. Подтвердите, что камера правильно подключена и установлена, и начните запись с помощью программного обеспечения для захвата изображения.Отрегулируйте настройки камеры до рекордных 20 кадров в секунду с соответствующими параметрами записи моно-16. Используйте пустую девятиметровую чашку Петри, чтобы убедиться, что сцена установлена на правильную высоту, и при необходимости отрегулируйте сцену. В стерильных условиях добавьте три миллилитров раствора M9 в подвижность скрининговой пластины и используйте два миллилитров раствора M9 для мытья одной трети площади поверхности двух нематод, загруженных пластинами FUDR из той же экспериментальной группы в скрининговую пластину.Затем поместите скрининговую пластину на сцену трекера. Используйте одного червя, чтобы сфокусировать камеру, и начать запись животных. Когда запись будет завершена, отбросьте пластину подвижности и отметьте пластины FUDR как используемые один раз, прежде чем вернуть их в инкубатор.Чтобы проанализировать видео данные, откройте параллельный червь трекер анализа данных программного обеспечения графического пользовательского интерфейса, и использовать функцию просмотра для загрузки видео интерес. Выберите папку назначения вывода и подтвердите, что для 30-секундного анализа настроено от 600 до 1200 кадров. Вставьте 0,029 пикселя до миллиметра коэффициент преобразования для изображения девяти сантиметров чашки Петри в полном разрешении, и выберите держать мертвых отслеживания algorithhm.В соответствии с вкладкой параметров размещения установите изображения с использованием q до 100, q-padding до 3, стандартные пиксели до 54, порог до 9, отверстие до 1 и закрытие до 2. Отрегулируйте параметры фильтрации до минимального размера 20, максимальный размер 180, и червь, как 0,94. Установите параметры формовообразующих траекторий до максимального перемещения расстояния 10, минимальной длины 150 и памяти 10.Установите параметры изгибов и скорости до порогового порога изгиба 1,8, минимальных изгибов 0 и рамок для оценки скорости 150. Настройте статистику мертвого червя до максимального удара в минуту 5, и максимальная скорость 1. Выберите папку вывода и выберите количество выходных кадров до 50, а размер шрифта до 10.Используйте функцию примера для проверки параметров и вывода изображений образца, чтобы проверить, видны ли черви на протяжении восьми пороговых шагов. Затем инициируйте функцию Start Job и объедините индивидуальные результаты для всего набора данных для анализа файлов результатов тестирования, сохраняя результаты через экспорт функции TSV. Этот метод позволяет характеристикировать фенотипы нематод для больших популяционных исследований различных моделей червей нейродегенеративных заболеваний, таких как фронтотемпоральная деменция, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз.А также характеристика воздействия потенциальных терапевтических молекул, с использованием червей модели болезни Паркинсона и Альцгеймера. Высокая точность этих измерений достигается за счет увеличения числа червей, которые могут быть проанализированы по сравнению с традиционными методами. Выполняя эту процедуру, важно помнить, чтобы свести к минимуму время между добавлением червей к подвижности и начала отслеживания.После этой процедуры, другие методы могут быть выполнены в дополнение к результатам и связь с агрегацией белка. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области нейродегенеративных и неправильного обращения заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера, чтобы изучить правильные приложения открытия. Не забывайте, что работа с FUDR может быть чрезвычайно опасной и меры предосторожности, такие как ношение нитрил перчатки, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Перечень основных периферической крови популяции лейкоцитов для многоцентровых клинических испытаний с использованием полного анализа крови Фенотипирование

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Автоматизированная Разделение<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Переменно колонизирована бактериальным патогеном

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Экспрессия генов профилирования заражения микробами, использующим платформу цифровой штрих-кодирования

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Полуавтоматический подход к подготовке антител коктейли Иммунофенотипирование периферической крови человека

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Мультиплекс цитокина профилирование Splenocytes стимулировали мыши с использованием платформы на базе гранулярных шарик иммуноанализа

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Сбор и обработка лимфатических узлов от крупных животных для анализа РНК: подготовка исследований транскриптомики Лимфоузел крупных видов животных

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Высокой пропускной способностью, высоким содержанием, на основе жидкости C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...