Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Detta arbete stöds av centrum för Skellefteåsjukan sjukdomar (CMD). FAA stöds av en Senior Research Fellowship award från Alzheimers Society, UK (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammar erhölls från de Caenorhabditis elegans genetiska centrum (CGC).

1. beredning av material för C. elegans protokoll
<ol><li>
För att förbereda en 10 x M9 buffertlösning, tillsätt 30 g monobasiskt kaliumfosfat, 60 g dibasiskt natriumfosfat och 50 g natriumklorid en 1 L autoklaverbart flaskan.
	<ol>
<li>Lägg till 1 L av renat vatten och autoklavera vid ca 121 ° C under 15 minuter.</li>
		<li>Späd 10 gånger i renat vatten och autoklavera vid ca 121 ° C under 15 minuter.</li>
		<li>När svalnat, tillsätt 1 mL av en lösning av 1 M magnesiumsulfat. Obs: Endast 1 x M9 (M9) bör användas för mask hantering i följande steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
För att förbereda nematoder odlingsmedium (Rich-NGM), blanda 2,7 g natriumklorid, 15,75 g agar, 5.75 g kasein, 900 mL renat vatten och autoklav vid 121 ° C i 15 min.
	<ol>
<li>Överföra Rich-NGM mediet till en värmande ugn (ca. 70 ° C) om den inte används omedelbart; Rich-NGM kan hållas smält vid ca 70 ° C i upp till 12 h innan det blir oanvändbart.</li>
		<li>Rich-NGM blanda, tillsätt 900 µL av en lösning av 1 M kalciumklorid, 900 µL av en lösning av 1 M magnesiumsulfat och 900 µL av en lösning av 5 mg/mL kolesterol i absolut etanol. Obs: Kolesterol kräver inte autoklavering före användning.</li>
		<li>För att förbereda de experimentella plattor som upprätthåller befolkningens ålder synkron, tillsätt 92 µL 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUDR) vid 812 µM till 900 mL Rich-NGM. Obs: FUDR är både giftig och cancerframkallande, så det är viktigt att bära nitrilhandskar Förutom lab rockar och skyddsglasögon. Tillåt inte avfall att ange allmänna avfall strömma och avyttra genom förbränning med en efterbrännkammare.</li>
		<li>Häll 20 mL av Ånghärdad Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål att generera en tillväxtplattan (Rich-NGM plattan). Häll 15 mL av Ånghärdad Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål att göra en motilitet plåt (Mot plattan). Häll 20 mL av Rich-NGM med FUDR i en 9 cm steril petriskål att generera en FUDR plattan. Obs: Låg agar volymen av Mot plattan underlättar kameran fokusera och mask spårning (se punkt 3.2.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Förbereda OP50 Escherichia coli stam, genom autoklavering 1 L LB buljong vid 121 ° C i 15 min och Inokulera med förrätt kultur när svalnat.
	<ol>
<li>Låt den bakteriella kulturen att växa över natten vid 37 ° C och sterilisera röret som ska användas för centrifugering.</li>
		<li>Överför bakterierna till sterila rör och centrifugera vid 4.600 x g i 15 min.</li>
		<li>Dekantera supernatanten och med sterilt vatten, avbryta i 10% av den ursprungliga volymen att skapa 10 x (10 gånger koncentrerade) OP50 lager.</li>
		<li>Späd ut 15 mL 10 x OP50 beståndet till 150 mL att generera 1 x OP50, med sterilt vatten, innan de används till utsäde Rich-NGM plattor. De återstående 10 x lösning till utsäde FUDR plattor. Obs: Mot plattorna förblir unseeded och kommer att användas endast i bild förvärv steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Att frö plattor med bakterier, segregera Rich-NGM och FUDR plattor.
	<ol>
<li>Under sterila förhållanden och tillsätt 350 µL av 1 x OP50 till Rich-NGM tallrikar och fördela jämnt. Obs: Sprid inte på kanten av plattan som maskar kommer krypa upp sidorna av plattan och dö.</li>
		<li>Under sterila förhållanden och tillsätt 350 µL 10 x OP50 till FUDR tallrikar och fördela jämnt.</li>
		<li>Låt plattorna torka och inkubera vid 20 ° C under 2 d före användning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beredning av C. elegans för användning med WF-NTP
<ol><li>Bibehålla C. elegans på Rich-NGM tallrikar eller genom att överföra en liten mängd agar som innehåller maskar med framsidan nedåt på ett nytt bakteriell skikt. Upprätthålla de C. elegans stammarna på detta sätt innan de experimentella protokoll.</li>
	<li>Med överlämnande-tekniken (se steg 2.1), utsäde 20 plattor av varje stam med välnärda, blandad Stadium maskar och tillåta dem att växa för 2 d vid 20 ° C.</li>
	<li>Tvätta bort 5 plattor som innehåller maskar med 15 mL M9 och pool i en 15 mL tub. Upprepa för alla 20 plattor för varje stam.</li>
	<li>Centrifugera maskar vid 2000 x g i 2 min, avlägsna supernatanten och avbryta i 2 mL M9 lösning.</li>
	<li>Förbereda 10 mL blekning lösning genom att blanda 13% natriumhypoklorit och 4 M natriumhydroxid i förhållandet 3:2 vol/vol. Obs: Denna lösning kräver inte autoklavering. Både komponenter och den resulterande lösningen är frätande och ska hanteras med omsorg med handskar i Nitril. Natriumhydroxid är milt frätande på glas och bör förvaras i plastbehållare.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL blekning lösning till varje centrifugrör och skaka kraftigt i ca 3,5 min eller tills nagelbanden är helt upplöst.</li>
	<li>Under sterila förhållanden och späd proven till 15 mL M9 och centrifugera vid 2000 x g för 2 min. avlägsna supernatanten och suspendera i 15 mL M9 lösning.</li>
	<li>Upprepa steg 2,7 6 gånger, tills endast mask ägg kvar, och lösningen inte längre har en lukt av klor.</li>
	<li>Centrifugera proverna vid 2000 x g i 2 min, avlägsna supernatanten och avbryta i 2 mL M9 lösning.</li>
	<li>Under sterila förhållanden och Använd en steril glas pipetten att överföra 2 mL av M9 innehållande ägg i varje brunn 12-väl vävnadsodling platta och inkubera vid 20 ° C under minst 16 h. Obs: Använda separata plattor för varje stam för att förhindra korskontaminering. Överlåtande steget från Centrifugera rören till flera wells hjälper att undvika mask kvävning.</li>
	<li>Överföra de maskar som kläckts över natten från de 12 brunnar i 15 mL centrifugrör. Ta 3 droppar 5 µL mask lösning och räkna antalet maskar närvarande vid första larvstadium (L1).</li>
	<li>Beräkna antalet maskar per µL lösning.</li>
	<li>Utsäde L1 maskar på Rich-NGM pläterar på 3.000 maskar per platta och tillåta dem att växa för 2 dagar vid 20 ° C, tills de når sista larvstadium (L4) etappen.</li>
</ol>3. allmänna WF-NTP-protokollet
<ol><li>
Lägg till 2,2 mL av varje läkemedel som är sammansatta i lämplig koncentration (sådan som 25 eller 10 mM för droger som squalamine18 och bexaroten15, respektive) till 6 FUDR plattor och låt torka under sterila förhållanden för varje önskad mask stam. Obs: Detta steg upprepas för varje förening under granskning, för varje koncentration och varje lösningsmedel används.<ol>
<li>Tvätta maskar av 5 Rich-NGM plattor beredd vid steg 2.13 med 15 mL M9 buffert och överföra maskar till ett centrifugrör.</li>
		<li>Centrifugera vid 2000 x g i 2 min, ta bort supernatanten och upphäva 3 ml M9. Ta 3 droppar 5 µL av M9 lösningen innehållande maskar och räkna antalet maskar närvarande vid den sista larvstadium L4.</li>
		<li>Beräkna antalet maskar per µL av M9 buffert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utsäde 700 L4 larver på 6 i torr FUDR plattorna som innehåller en viss förening, upprepa för varje koncentration av varje förening och låt torka under sterila förhållanden.
	<ol>
<li>Inkubera maskar vid 24 ° C från L4 för dessa stammar där masken förlamningen framkallas endast genom att höja temperaturen, till exempel AD stam38. Räkna dagen efter den L4 larvstadium som D0 av vuxenlivet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slå på scenbelysningen för tracker.
	<ol>
<li>Rengör glaset scenen med 70% etanol och säkerställa att inga synliga rester kvar, sedan ta bort linsskyddet. Ren objektivets imaging använder en air duster. Kontrollera att kameran är korrekt ansluten och installerat och börja spela in med programvaran image capture.</li>
		<li>Justera kamerainställningar för att spela in 20 bildrutor/s, med mono 16 inspelning parametrar installationen. spela in 1.200 ramar, Spara i MJPEG format på en 95% komprimering. Använd en tom 9 cm petriskål för att säkerställa att scenen är inställd på rätt höjd och vid behov justera. Obs: Se till att kanterna på plattan syns i inspelningen eftersom detta gör att 'hålla-dead' algoritmen fungerar korrekt (figur 1a).</li>
		<li>Under sterila förhållanden och ta 2 plattor tidigare beredd på steg 3,2 med samma villkor och 1 Mot screening plattan som bereddes i steg 1.2.4. Lägga till 3 mL av M9 lösningen Mot plattan. Använda andra 2 mL M9 att tvätta 1/3 av ytan av 2 plattor beredd vid steg 3,2 på Mot plattan.</li>
		<li>Placera Mot plattan innehållande cirka 5 mL M9 lösningen och cirka 600 maskar på tracker scenen. Fokusera kameran med en enskild mask och börja inspelningen.</li>
		<li>När inspelningen är klar, kasta Mot plattan med maskar; Markera FUDR plattorna som används en gång och returnera den till inkubatorn.</li>
		<li>Upprepa steg 3.3.3 till 3.3.5 för varje experimentella villkor.</li>
		<li>Upprepa steg 3.3.3 till 3.3.6 för varje tidpunkt vuxen livslängd. Obs: Undersökningsförfaranden som kan utföras när som helst av maskens vuxen livslängd (ca. 3 veckor). Dessa protokoll underlätta screening upp till 9 tidpunkter; författarna rekommenderar screening varje 2 dagar från dag 1 i vuxen ålder.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. optimering för diskreta dosstudier
<ol><li>
Förbereda maskar genom att upprepa steg 3.1.1 till 3.1.3.
	<ol>
<li>Utsäde ca. 1000 L4 maskar på 5 FUDR plattor. Inkubera plattorna vid 24 ° C tills D3 i vuxen ålder, för experiment med AD38 maskar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Med steril glas pipett överföring maskar beredd under sterila förhållanden från plattan till en 15 mL centrifugrör, Centrifugera vid 2000 x g i 2 min och avlägsna supernatanten.
	<ol>
<li>Avbryta lösningen av maskar i 1 mL av M9 buffert. Överför maskar i en mikrocentrifug rör, Centrifugera vid 300 x g under 2 minuter, och avlägsna supernatanten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
För protein transduktion, tillsätt 40 µL av transfection leverans reagens och 20 µL av infödda protein på önskad koncentration (vanligtvis 40 µM) och odla i rumstemperatur i 30 min.
	<ol>
<li>Under sterila förhållanden och Använd en steril glas pipetten för att överföra maskar från steg 4.2.1 i en mikrocentrifug rör innehållande inkapslade protein för att ge en total volym på 1060 µL. plats rör horisontellt och skaka på 60 rpm i en 24 ° C skakar inkubator för 8 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Under sterila förhållanden och tillsätt 4 mL M9 lösning till en Mot plattan och överföra ett mikrocentrifug rör av maskar plus drog på Mot plattan.
	<ol>
<li>Ställa in tracker genom att upprepa steg 3.3 till 3.3.2.</li>
		<li>Under sterila förhållanden och tillsätt 4 mL M9 lösning till en Mot plattan och överföra ett mikrocentrifug rör av maskar plus drog på Mot plattan.</li>
		<li>Placera Mot plattan på tracker scenen, fokuserar kameran på en enskild mask och börja inspelningen. När du är klar, etikett Mot plattan och ställ åt sidan.</li>
		<li>Upprepa steg 4.4.1 och 4.4.3 för alla prover.</li>
		<li>Med glas pipett överföra maskar under sterila förhållanden från Mot plattan till en 15 mL centrifugrör, Centrifugera vid 2000 x g i 2 min. ta bort supernatanten, överföring pelleten på en FUDR plattan och låt torka under sterila förhållanden.</li>
		<li>Upprepa steg 4.4.5 för alla prover.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubera maskar vid 24 ° C tills D6 i vuxen ålder. Obs: Flera antikropp inkubationer är också möjliga.</li>
	<li>
Tillsätt 3 mL M9 bufferten till Mot plattan och Använd 2 mL M9 lösning för att tvätta alla maskar från en FUDR plattan på Mot plattan.
	<ol>
<li>Ställa in tracker genom att upprepa steg 3.3 till 3.3.2.</li>
		<li>Placera Mot plattan på tracker scenen, fokusera kameran som behövs och börja inspelningen. När inspelningen är klar, kassera Mot plattan eller återställa det för ytterligare screening om så önskas.</li>
		<li>Upprepa steg 4,6 till 4.6.2 för alla prover.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analysera videodata
<ol><li>
Efter att förvärva videor, Välj parametrarna i programvaran GUI (figur 2) för dataanalys.
	<ol>
<li>Ladda enstaka eller flera videoklipp via funktionen webbsökning . Välj en utdatamapp för destination. Säkerställa att 600 till 1 200 ramar används för en 30 s analys. Obs: Alla intervall av bildrutor kan analyseras.</li>
		<li>Infoga en pixel att mm omvandlingsfaktor som kommer att vara 0,029 för imaging en 9 cm petriskålar med full upplösning. Välj spårning algoritmen 'hålla döda'. Obs: Omvandlingsfaktorn beror på synfältet används. Z-omforma algoritm kan också användas som ett alternativ.</li>
		<li>Fyll i parametrarna i avsnittet identifiera (figur 2): Z använda bilder = 100, Z stoppning = 3, Std pixlar = 54, tröskelvärde = 9, öppning = 1, utgående = 2. Justera filtrering parametrar till Minimum storlek = 20, maximal storlek = 180, maskliknande = 0,94.</li>
		<li>Finjustera parametrarna bilda banor : Maximalt avstånd flytta = 10; Minsta längd = 150, minne = 10.</li>
		<li>Ange parametrar för böjar och hastighet . Använd 1,8 för böj tröskel, 0 för Minimum böjaroch 150 för ramar att uppskatta hastighet.</li>
		<li>Tune döda masken statistik. Använda 5.0 för maximal beat per minut och 1,0 för maximal hastighet.</li>
		<li>Välj utdatamappen. Ange antalet bildrutor som utdata till 50. Ange teckenstorlek till 10. Obs: Du kan också välja en eller flera regioner av intresse (ROIs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Testa parametrarna med hjälp av funktionen exempel . Utgång till exempel bilder och kontrollera att maskar är synliga i hela 8 tröskelvärde stegen (figur 1).</li>
	<li>Använd funktionen starta jobbet .</li>
	<li>
Analysera resultatet textfiler genom att kombinera de enskilda resultaten för hela datamängden. Använd Export till tsv funktion i GUI. Obs: Alternativt kan enskilda mätvärden av maskar också övervägas för befolkningsstudier.<ol>
<li>Analysera data med en statistiskt programpaket.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

På grund av den snabba expansionen av tekniker inom optisk vetenskaper är det nu möjligt att kravet på automatiserade metoder i C. elegans studier i väsentligen nya sätt. Som ett resultat, ett antal digital tracking plattformar20,41,42,43,44,45,46 har utformats och förfogande över de senaste åren för att ersätta manuell räkning av parametrar såsom hastighet rörlighet, bockning frekvens, förlamning hastigheten, samt mer komplexa former av beteenden såsom omega svängar och livslängd mätningar. Den senaste automatiserade plattformar har kraftigt förbättrat reproducerbarhet och känsligheten hos C. elegans studier41 och högkvalitativ data på små kohorter eller ens enskilda djur. Vi beslutade att förlänga automatisering av analysen av masken beteende till gör det också möjligt att utvärdera fenotyperna av kohorter av tusentals djur parallellt. Den största fördelen med metoden att studera mask kohorter är att det tillåter för redovisning för hög inneboende variabilityen av masken beteende24 och det faktum att drogen behandlingsstudier ofta leda till subtila fenotypiska variationer, som är svåra att detektera med tillräcklig statistisk signifikans när du använder en liten grupp av djur. En hög effekt för upptäckt (POD) är verkligen nödvändigt att upptäcka med förtroende någon betydande variation i beteende och begränsa falskt positiva resultat25.
Här har vi beskrivit en rad protokoll baserat på en nyligen rapporterade automatiserad screeningmetod för C. elegans, brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)36. Protokollet beskrivs här är uppdelad i 5 delar. Delarna 1 och 2 beskriver utarbetandet av stora mask populationer. Kritiska steg är sterilitet av arbetsförhållandena och beredning av reagens och plattor behövs för att köra experiment. Vi noterar att, på grund av ökad genomströmning som tillhandahålls av detta protokoll jämfört med andra screening metoder36, det kräver också ökade kvantiteter av reagenser. Denna faktor måste noga övervägas i experimentell design. Vi noterar också att steget blekning är kritisk och måste testas i förväg som ett stort antal ägg och friska larver är nödvändiga för att köra dessa experiment. Del 3 av detta protokoll Detaljer hur man levererar droger i solid media och skärmen mask populationer. Vi noterar att denna del av protokollet är starkt beroende av antalet droger och läkemedelskoncentrationen att testas av användaren parallellt. Den komplett automatiseringen av screeningen och snabb datainsamling skifta det begränsande steget från beteendevetenskaplig observation till REAGENSBEREDNING och tillväxt och synkronisering av stora mask populationer. De viktigaste stegen under beteendemässiga screening är tidpunkterna för inspelningen och någon mask hantering steg (t.ex., överföring av maskar från NGM plattorna till spårning plattform). Protokollet beskrivs här är ett exempel som utformats till skärmen maskar för upp till 9 dagar under vuxen livslängd; dock kan detta protokoll enkelt anpassas till skärmen så många tidpunkter som användaren önskar, t.ex., 18 dagar36. Del 4 sedan illustrerar tillämpningen av protokollet att leverera proteinmolekyler (t.ex. antikroppar och molekylär chaperones) i C. elegansoch visar hur protokollet illustreras i delarna 1-3 kan enkelt anpassas, beroende på önskad ansökan. Vi visar hur detta förfarande kan utökas inte bara till leverans av narkotika-liknande molekyler men också för administrationen av molekylär chaperones eller antikroppar37. De första fyra stegen (delar) utförs under sterila förhållanden, om inte annat anges. Alla likvida komponenterna bör Ånghärdad före användning och inkubationsstegen bör utföras vid 70% relativ luftfuktighet. I del 5 beskriver vi hur du använder programpaketet som tillhandahålls i kombination med spårning scenen. Denna programvara har varit anpassade utformade för analys av WF-NTP data relaterade till uppförandet av stora mask populationer. Vi föreslår att användaren följer de riktlinjer som fastställs i del 5 för dataanalys; dessa parametrar är dock beroende på särdragen i det inspelade videor (dvs, fps, synfält, upplösning, antal förvärvade ramar). Till exempel funktion i GUI har utformats för att underlätta utvärderingen av korrekta parametrar före analysen.
Dessa serier av protokoll gör det möjligt att analysera fenotyperna av stora populationer av C. elegans (för närvarande upp till 5 000 enskilda maskar parallellt) effektivt, minska artefakter på grund av det inneboende variabilitet av beteendet hos djuren , i samförstånd med förundersökningar om identifiering krävs för att uppnå statistisk signifikans för studier av C. elegans25. Plattformen använder ett system av högupplösta kameror, kan spela in bilder av stora mängder djur med hög hastighet, medan du spelar samtidigt in flera stora kohorter. Hög prestanda och hög genomströmning av WF-NTP-protokollet gör det möjligt att fastställa mycket små förändringar i masken beteende på ett mycket exakt sätt. Denna metod kan därför nya infallsvinklar anses inte bara för att studera biologi C. elegans, men dessutom för farmakologiska och medicinsk forskning, såsom hög genomströmning screening av genetiska modifieringar och drog behandlingar. Detta förfarande har också fördelen att förlamning studier som ska genomföras i parallell med andra beteendemässiga mätningar, en nyckelfunktion i molekylär screening studier.
De resultat som har uppnåtts hittills i drug discovery program AD15,34,35 och PD18 visar vikten av bred field-of-view datainsamling för att avsevärt öka den antal djur som kan övervakas i en enda experiment, vilket avsevärt minskar de experimentella fel och kraftigt förbättra statistiska giltigheten av studier. Den nuvarande metoden som beskrivs i detta protokoll har fokuserat på utmaningar inom läkemedelsutveckling, vi hoppas att metoden allmänt antas i gemenskapen och att dess tillämpning kommer att utvidgas till komplexa genetiska och beteendemässiga studier och utöka antalet fenotyper som för närvarande kan detekteras.

Ungefär ett halvt sekel sedan, Sydney Brenner introducerade Caenorhabditis elegans (C. elegans) som modellsystem studera utvecklingen och neurobiologi, som denna lilla (1 mm i längd), transparent nematoder mask är lätt att manipulera genetiskt och upprätthålla i laboratoriet1. Idag används C. elegans att studera en mängd biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, typ av cellcykeln, genreglering, metabolism, och åldrande2. Dessutom mobilnät och vävnad komplexitet, protein uttrycksmönster och bevarande av sjukdom vägar mellan C. elegans och högre organismer (80% av masken gener har en mänsklig orthologue), länkad med enkelheten och kostnadseffektiviteten för odling, gör det en effektiv i vivo modellorganism mottagliga för hög genomströmning genetiska3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 och drog14,15,16 filmvisningar. Av alla dessa skäl, har C. elegans varit anställd för karakterisering av normala och sjukdomsrelaterade molekylära vägar; i fältet för neurodegeneration, exempelvis har det aktiverat utforskandet av effekterna av åldrande på protein aggregering3,4,7,15,17, 18, och karakterisering av initiativtagare och hämmare av protein aggregering3,4,5,6,7,14, 18.
Den kondition av maskar, som är en viktig beteendemässiga parameter definieras i denna typ av studie, kan mätas manuellt i en mängd olika sätt, såsom genom att räkna antalet kropp kurvor per minut (BPM)4,6, 19, eller genom att mäta hastigheten på rörelse20,21,22, samt genom att mäta den genomsnittliga livslängden och priser av förlamning. Även om manuella mätningar av kroppen böjar och rörelsens hastighet har lett till många viktiga insikter i olika molekylära vägar och mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuella analyser förblir för närvarande låg genomströmning, mycket arbetsintensiva och tidskrävande samtidigt som det är benägna att fel och människors fördomar. Dessa frågor presenterar betydande utmaningar i insamlingen av uppgifter med tillräcklig statistisk effekt att skilja subtila beteendeförändringar. Denna begränsning är särskilt relevant för drug screening som behandlingar med potentiella drog molekyler leder ofta till små fenotypiska förändringar24, därför kräver studier av stort antal djur för att erhålla reproducerbara resultat. För att illustrera denna punkt, har nyligen genomförda studier visat att en hög effekt för upptäckt (POD) är nödvändigt att definiera med tillförsikt några betydande förändringar i beteende och begränsa falskt positiva resultat25. Detta har resulterat i en stark motivation i C. elegans gemenskapen att ersätta manuell räknar med reproducerbara, automatiserad, tid - och kostnads - effective mätningar. För att möta denna efterfrågan, har flera laboratorier nyligen utvecklat metoder för högkänsliga mätningar och korrekt mask spårning av större antal maskar22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
För att expandera ytterligare processen för automation till de stora kohorterna av djur behövs för statistiskt signifikant mätningar, har vi nyligen utvecklat ett brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)15,34 ,35,36, vilket möjliggör samtidig undersökning av flera fenotypiska utläsningar på mycket stora mask populationer, en nyckelfaktor i statistiskt relevanta fenotypiska upptäckt25. Inte bara kan WF-NTP för närvarande övervaka upp till 5 000 djur parallellt, men fenotypiska avläsning även omfatta flera parametrar, inklusive hastighet och amplitud av kroppen böjar, hastigheten, andelen av befolkningen som är förlamad, och den storleken på djuren. Det går därför lätt att skärm tusentals av maskar parallellt och att kombinera olika avläsning till kartan beteende för att skapa en flerdimensionell fingeravtryck36. Den associerade programvaran med öppen källkod är skrivet i Python, som också krävs för att använda det och är helt anpassningsbara. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) som också möjliggör användare att anta denna teknik.
Här presenterar vi en serie av protokoll som illustrerar några av de potentiella tillämpningarna av WF-NTP. I synnerhet vi diskutera administrationen av föreningar, alltifrån små molekyler till protein therapeutics, och beskriva hur man skärmen deras effekter direkt över stora populationer av maskar, således effektivt ta bort behovet av att prova på små delpopulationer. Användning av WF-NTP för sådant ändamål har redan medfört betydande fördelar i förfaranden som syftar till att utforma drug discovery program för Alzheimers sjukdom (AD)15,34,35 och Parkinsons sjukdom (PD)18 med hjälp av in vivo-data för bedömning av terapeutisk kandidater35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans är en väl etablerad djurmodell i biomedicinsk forskning, allmänt sysselsatt inom funktionell genomik och åldrande studier. För att bedöma de hälso- och fitness av djuren under studien, åberopat en typiskt motilitet utläsningar, såsom mätning av antalet kropp kurvor eller hastigheten. Dessa mätningar innebära brukar manuella räknar, vilket gör det svårt att få bra statistisk signifikans, som tid och arbete begränsningar ofta begränsa antalet djur i varje experiment till 25 eller mindre. Eftersom hög statistisk effekt är nödvändigt att erhålla reproducerbara resultat och begränsa falska positiva och negativa resultat när svaga fenotypisk effekter undersöks, det nyligen har man gjort ansträngningar att utveckla automatiserade protokoll fokuserat på att öka den känslighet för motilitet detektering och flera parametriska beteendemässiga profilering. För att fördjupa detektionsgränsen till den nivå som behövs för att fånga de små fenotypiska förändringar som är ofta avgörande för genetiska studier och läkemedelsutveckling, beskriver vi här en teknisk utveckling som gör att studien av upp till 5 000 enskilda djur samtidigt ökar den statistiska styrkan av mätningar av 1.000-faldig jämfört cirka med manuella analyser och 100-fold jämfört ca med andra tillgängliga automatiserade metoder.

Förenklar drift och multiparametric analys och hög genomströmning av illustrerade WF-NTP-protokollet (siffrorna 1 och 2) gör det möjligt att fastställa mycket små förändringar i masken beteende på ett mycket exakt sätt. Imaging plattformen bygger på skräddarsydd opto-mekanik, och den kan monteras med hjälp av en 6 MP svartvit kamera kombinerat med 16 mm brännvidd för högupplösta för 1'' sensor, upplyst med en 8'' av 8'' vit bakgrundsbelysning (se Tabell för material ”och också referera36 för ytterligare detaljer). Associerade WF-NTP programvaran är skrivet i Python och har utvecklats för att köras på Windows-plattformar. Det körs på en anpassad dator med 3.00 GHz octa-core-processor och 64 GB av minne (RAM). Programvaran var också avsedd att parallellisera arbete och video analys baserat på RAM och CPU av datorn; dvs, en maskin med en lägre beräkning makt kommer att resultera i mindre videor parallellt. Den setup som vi använder för närvarande är optimerad för att köra upp till ca. 16 videor parallellt och kan utföra en analys av ca. 100 videor över natten. Dessutom tillåter den hög detaljnivån av anpassning i GUI av WF-NTP stor kontroll av kvaliteten på bildanalys. GUI kan användas för att direkt ladda upp stora datamängder i parallell eller enskilda videor; specifika bildrutor kan också väljas för detaljerad sub analys, tillsammans med en pixel omvandlingsfaktor som kan användas för att uppskatta beteendemässiga mätvärden. En av de två olika spårning algoritmerna (håll döda och Z-transformen) kan väljas beroende på om användaren vill överväga förlamade djur i analysen. Parametern tröskelvärde kan vara trimmad med detta med video och experimentell kvalitet. Öppnande och avslutande parametrar tillåter användaren att ta bort buller och fortsätta att genomföra funktionen tröskelvärde. Skeletonizing algoritmen erbjuder en alternativ metod för analys. De objektet storlek cut-off (filtrering) tillhandahåller ett ytterligare filter för bakgrundsljud och parametern maskliknande tillåter användaren att överväga maskar endast objekt med en elliptiskt form, därav särskiljande från andra objekt som kan ha samma pixelstorlek maskar. Efter dessa tröskelvärde operationer, alla de resulterande märkta regionerna kan identifieras som enskilda maskar och positionerna för dessa regioner lagras sedan för varje ram för efterföljande analys och spårning. Excentriciteten av varje spårad mask används för att uppskatta mask mätvärden såsom omfattningen av masken bockning (BPM) som en funktion av tiden. Användarna får också välja antalet ramar som används för att hålla en mask i minnet av programvaran efter kollisioner, och antalet pixlar som en mask kan flytta mellan ramar kan också ställas in för att skilja djuren från buller. Alternativet minsta spår längd tillåter användaren att kassera maskar som har spårats för endast ett fåtal bildrutor. Andra viktiga parametrar, såsom böjar och hastighet, tillåter användaren att välja graden av bockning krävs för att räknas som en kropp böj och antalet ramar som anses behövas för att beräkna hastigheten på djuren. Cut-off parametrar kan justeras ytterligare för införande av förlamade djur. Utdata visas automatiskt i resultatet filer. Dessa värden betraktas som övre gränser för utvärdering av fraktionen av förlamade djur. Användaren kan också välja ett eller flera områden av intresse. Den här funktionen är särskilt användbart för att analysera subpopulations av maskar och utdata sorteras automatiskt i resultatfilerna. Alternativet tillåter användaren att Välj utdatamappen och antalet spårning ramar som kommer att produceras för den. Olika verktygsuppsättningar kan också användas för ytterligare analys av data, såsom verktyget tomt bana som visar enskilda mask spår och verktyget fingeravtryck som tillåter användaren att skapa fingeravtryck kartor.
Denna metod gör det möjligt för nya metoder antas, inte bara för biologiska studier av C. elegans men också för farmakologiska och medicinska forskningsändamål, såsom hög genomströmning screening av genetiska modifieringar och läkemedelsbehandlingar. Vi har illustrerat denna potential genom att beskriva karakterisering av fenotyperna för stora befolkningsstudier (N > 1000) av olika mask modeller av neurodegenerativ sjukdom (frontotemporal demens (FTD)39, Parkinsons sjukdom (PD)7 , Alzheimers sjukdom (AD)16,40, och amyotrofisk lateralskleros (ALS)19 (figur 3a) och karakterisera effekten av potentiella terapeutiska molekyler mask modeller av PD18 och AD 15,12 (figur 3b). Två små molekyler, squalamine18 och bexaroten15, administrerades vid koncentrationer upp till 25 µM till PD (figur 3b) och 10 µM till AD38 (figur 3b) maskar, respektive. Båda föreningarna visade tydligt dosberoende effekter över spänna av koncentrationer testats. Vi har visat att denna höga noggrannhet i mätningarna uppnås genom att öka antalet maskar som kan analyseras jämfört med traditionella metoder (figur 3 c). Vi illustrerat vikten av urvalets storlek (figur 3 c) i molekylär screening samt liksom karakterisering av muterade stammar. Temperaturhöjningen från 20 ° C leder till ungefär hälften av AD maskar blir förlamad efter 3 dagar av vuxenlivet. Worm populationer screenades under olika förhållanden, t.ex., när maskar över uttrycker 42-rester form av amyloid-beta peptiden (Aβ1-42) (AD maskar) utsattes för subtila temperaturvariationer (figur 3 c, vänster ”panel), när Aβ1-42 uttrycktes i alla nervceller (figur 3 c, centrala panelen) eller när AD maskar utsattes för bexaroten (figur 3 c, högra panelen). Worms analyserades också från små ROIs slumpmässigt utvalda från hela synfältet av de videor som förvärvats med WF-NTP (N < 50, gula staplar) belyser jämförelsen av motiliteten av dessa maskar med den genomsnittliga motiliteten av hela masken befolkningen (N < 1000). I alla paneler, skillnaden mätt på hela masken befolkningen verkar vara statistiskt signifikant med p ≤ 0,0001 (*).
WF-NTP-protokollet som beskrivs här kan även samtidig inspelning av flera parametrar (figur 1b) att stödja, på ett optimalt sätt, både intern validering och utvecklingen av ett omfattande fingeravtryck av en rad olika förhållanden i förhållande till ett kontrollprov, möjliggör meningsfulla jämförelser över flera studier. Denna multi parametrisk metod innefattar samtidig analys av flera behavioral funktioner, inklusive bockning frekvens, hastighet, förlamning hastigheten, storlek, böj amplitud och böj deplacement36. Detta tillåter tusentals djur övervakas i detalj och på en mycket hög känslighet och statistisk signifikans och ger möjligheter för stora populationer studier. Proceduren spårning har också fördelen att förlamning studier som ska genomföras i parallell med andra beteendemässiga mätningar, en nyckelfunktion i molekylär screening studier.
De resultat som har uppnåtts hittills i AD15,34,35 och PD18 läkemedelsutveckling visar vikten av bred field-of-view datainsamling att kraftigt öka antalet djur som kan vara övervakas i en enda experiment, avsevärt minska de experimentella fel och kraftigt förbättra statistiska giltigheten av studierna. Baserat på dessa resultat, räknar vi med att WF-NTP-protokollet, som vi gjorde lätt tillgängliga för gemenskapens36, avsevärt kommer att utöka användningen av C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Figur 1: WF-NTP analys steg och exempel på ett fingeravtryck. (en) 1. Originalvideon. 2. bakgrundsbild. 3. bakgrund subtraheras bild. 4-6. tröskelvärde steg. 7-9. enda märkning av maskar. (b) flera fenotyper redovisas med ett fingeravtryck för vildtyp maskar och mask modeller av PD och AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Figur 2: grafiskt användargränssnitt (GUI) av WF-NTP. Specifika videoklipp och markerade bildrutor kan väljas i GUI för analys och en pixel konverteringsfaktor kan infogas, varefter analysen utförs med en av de två givna spårning algoritmerna. Det är möjligt att välja graden av bockning nödvändigt att räkna som en kropp böj samt antalet ramar som behövs för att beräkna hastigheten på djuren. Kropp kurvor och hastighet tröskelvärden kan avgöra den förlamade mask statistiken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Figur 3: exempel på tillämpningar som möjliggörs av WF-NTP metoden. (en) tillämpning av WF-NTP i stora befolkningsstudier (N > 1 000) av BPM mätningar för C. elegans modeller av en rad neurodegenerativa sjukdomar inklusive FTD, PD, AD, och ALS. (b) tillämpning av WF-NTP i läkemedelsutveckling. (c) betydelsen av befolkningsstudier i temperatur känslighet, drogen effekt och mutant stam karakterisering. Fenotyper av subpopulationer N < 50 (gula staplar) jämförs med dem av hela masken befolkningen (N < 1000). Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

Vi beskriver protokoll för att använda den breda fält-of-view nematoder spårning plattform (WF-NTP), vilket möjliggör hög genomströmning fenotypisk karakterisering av stora populationer av Caenorhabditis elegans. Dessa protokoll kan användas för att karaktärisera subtila beteendeförändringar i mutant stammar eller som svar på farmakologisk behandling i en mycket skalbar mode.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Så denna metod kan bidra till att svara på viktiga frågor i en drog upptäckt process om hur ett specifikt läkemedel beter sig i en levande organism. Den största fördelen med denna teknik är det tillåter stora provstorlekar som skall screenas snabbt och effektivt. Denna teknik har redan en stor inverkan på läkemedelsupptäckten genom att möjliggöra en mycket kvantititativ bedömning av effekterna av läkemedelskandidater.Denna metod ger nya mekanistiska insikter i debuten och progression av felvikning sjukdomar. Vidare kan denna metod också tillämpas på andra system, såsom åldrande och genetiska screenings. Vi är mycket glada över denna möjlighet att införa nya fysiska metoder i utrymmet för drogupptäckt.Dessa demonstartioner av denna metod är kritisk som screening stegen kräver hög förtrogenhet med denna novo automatisk teknik. Demonstrerar proceduren blir Sam Casford, en sökassistent från vårt laboratorium. Innan du påbörjar förfarandet, tillsätt 2,2 millileters av varje läkemedelsförening vid lämplig koncentration till sex 5-fluorodeoxyuridin eller FUDR plattor per mask stam, genom att försiktigt sprida föreningen över hela ytan av plattan, och torka plattorna under sterila förhållanden.Medan plattorna torkar, använd 15 milliliter M9 buffert för att tvätta maskarna från fem rika nematod tillväxtfaktor plattor, och överföra de befriade maskarna i ett koniskt rör för centrifugering. Åter upphäva nematoder i tre milliliter av färsk M9 buffert för kvantifiering av antalet maskar i L4 larvstadiet, och utsäde 700 L4 larver på var och en av de sex torra FUDR plattor per mask stam, per förening. När alla nematoder har såts, placera plattorna som innehåller de stammar för vilka parlys framkallas genom att höja temperaturen vid 24 grader celsius i 24 timmar.Nästa dag, slå på scenen ljus en parallell mask tracker, och rengör glaset skede av tracker med 70 procent etanol. Om inga synliga rester återstår, ta bort linsskyddet och använd en luftvippa för att rengöra bildobjektivet. Bekräfta att kameran är korrekt inkopplad och installerad, och börja spela in med programvaran för bildupptagning.Justera kamerainställningarna för att spela in 20 bilder per sekund, med lämpliga mono-16-inspelningsparametrar. Använd en tom, nio centimeter petriskål för att säkerställa att scenen är inställd på rätt höjd, och justera scenen om det behövs. Under sterila förhållanden, tillsätt tre milliliter M9-lösning till en motility screening platta, och använd två milliliter M9-lösning för att tvätta en tredjedel av ytan av två nematod lastade FUDR plattor från samma experimentella grupp i screeningplattan.Placera sedan screeningplattan på tracker-scenen. Använd en enda mask för att fokusera kameran, och börja spela in djuren. När inspelningen är klar, kassera motility plattan, och markera FUDR plattor som används en gång innan de returneras till inkubatorn.För att analysera videodata, öppna parallellmask tracker dataanalys programvara grafiskt användargränssnitt, och använda surfning funktion för att ladda video av intresse. Välj en utdatamålmapp, och bekräfta att 600 till 1200-bildrutor är inställda för en 30 sekunders analys. Sätt in en 0,029 pixel till millimeters konverteringsfaktor för avbildning av en nio centimeter petriskål med full upplösning och välj den fortsätt att spåra död algorithhm.Under fliken lokaliserande parametrar anger du Z-användningsbilderna till 100, Z-stoppningen till 3, standardpixlarna till 54, tröskelvärdet till 9, öppningen till 1 och stängningen till 2. Justera filtreringsparametrarna till en minsta storlek på 20, en maximal storlek på 180 och en mask som 0,94. Ställ in de bildar banor parametrarna till en maximal avstånd flytta på 10, en minsta längd på 150, och ett minne av 10.Ställ in böjarna och hastighetsparametrarna till en böjtröskeltröskel på 1,8, en minsta böjning på 0 och en bildrutor för att uppskatta hastigheten på 150. Stämma de döda mask statistik till en maxmim beat per minut av 5, och en maximal hastighet på 1. Välj utdatamappen och välj antalet utdataramar till 50, och teckenstorleken till 10.Använd exempelfunktionen för att testa parametrarna och mata ut exempelbilderna för att kontrollera om maskarna är synliga i de åtta tröskelstegen. Initiera sedan Start Job"-funktionen, och kombinera de enskilda resultaten för hela datamängden för att analysera testresultatfilerna, vilket sparar resultaten via export till TSV-funktionen. Denna metod möjliggör karakterisering av nematod fenotyper för stora befolkningsstudier av olika mask modeller av neurodegenerativ sjukdom, såsom Frontotemporal Demens, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, och Amyotrofisk Lateral skleros.Samt karakterisering av effekterna av potentiella terapeutiska molekyler, med hjälp av mask modeller av Parkinsons och Alzheimers sjukdom. Den höga noggrannheten hos dessa mätningar uppnås genom att öka antalet maskar som kan analyseras jämfört med traditionella metoder. Medan du utför den här proceduren är det viktigt att komma ihåg att minimera tiden mellan tillsats av maskarna till motiliteten och början av spårningen.Efter denna procedur, andra metoder kan utföras för att komplettera resultaten och att länka med protein aggregering. Efter dets utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området neurodegenerativa och felvikningssjukdomar, såsom Parkinsons och Alzheimers, att utforska rätt upptäcktsapplikationer. Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med FUDR och att försiktighetsåtgärder, som att bära nitrilhandskar, alltid bör tas medan du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiserad Separation av<em&gt; C. elegans</em&gt; Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Gene Expression Profilering av infekterar Mikrober hjälp av en digital Bar-kodande Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En halvautomatisk metoden att förbereda antikropp Cocktails för Immunophenotypic Analys av humant perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Multiplex cytokin profilering av stimuleras mus Splenocytes använder en flödescytometrisk pärla-baserad Immunoassay plattform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Insamling och bearbetning av lymfkörtlar från stora djur för RNA analys: förbereda för lymfkörtel Transcriptomic studier av stora djurarter

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

En hög genomströmning, hög-innehåll, vätskebaserade C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...