Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Bu iş merkezi tarafından Misfolding hastalıklar (CMD) için destek verdi. FAA kıdemli araştırma bursu ödülü Alzheimer Derneği, İngiltere'de (Grant sayı 317, AS-SF-16-003) tarafından desteklenmektedir. C. elegans suşları Caenorhabditis elegans genetik Merkezi (CGC) elde edilmiştir.

1. C. elegans iletişim kuralları için malzemelerin hazırlık
<ol><li>
10 x M9 arabellek çözüm hazırlamak, Yem mono potasyum fosfat 30 g, dibasic sodyum fosfat 60 g ve 50 g sodyum klorür bir 1 L autoclavable şişe ekleyin.
	<ol>
<li>1 litre saf su ve basınçlı kap, ca. 121 ° C 15 dakika ekleyin.</li>
		<li>Arıtılmış su ve basınçlı kap, ca. 121 ° C 15 dakika içinde 10 kat sulandırmak.</li>
		<li>Soğuyunca, 1 mL 1 M magnezyum sülfat çözeltisi ekleyin. Not: Sadece 1 x M9 (M9) aşağıdaki adımlarda işleme solucan için kullanılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nematot büyüme orta (zengin-NGM) hazırlamak için sodyum klorür, agar, kazein, 900 mL saf su ve basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de 5,75 g 15.75 gr 2,7 g karıştırın.
	<ol>
<li>Zengin NGM orta bir ısınma fırın (ca. 70 ° C) aktarım değilse hemen; Zengin NGM, ca. 70 ° C en fazla 12 saat için kullanılamaz hale önce erimiş tutulabilir.</li>
		<li>Zengin NGM karıştırın, 1 M kalsiyum klorür, magnezyum sülfat 1 M lik 900 µL ve 5 mg/mL kolesterol lik 900 µL lik 900 µL mutlak etanol ekleyin. Not: Kolesterol ısıyla kullanmadan önce gerektirmez.</li>
		<li>Bir yaş zaman uyumlu nüfusu korumak deneysel tabak hazırlamak, 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) 92 µL 812 µM zengin NGM 900 mL için ekleyin. Not: FUDR toksik ve kanserojen, nitril eldiven yanı sıra laboratuvar mont ve koruyucu gözlük için gerekli bu yüzden. Atık genel atık girmek izin değil akarsu ve bir afterburner ile yakma tarafından atmayın.</li>
		<li>Autoclaved zengin NGM 20 mL 9 cm steril Petri kabına bir büyüme tabak (zengin NGM plaka) oluşturmak için dökün. Autoclaved zengin NGM 15 mL 9 cm steril Petri kabına hareketliliği plaka (Mot plaka) yapmak için dökün. Zengin-NGM FUDR ile 20 mL 9 cm steril Petri kabına bir FUDR plaka oluşturmak için içine dökün. Not: Mot plaka düşük agar hacmi kamera kolaylaştırır odaklanmak ve (bkz. Adım 3.2.5) izleme solucan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OP50 Escherichia coli gerginliği, ısıyla 1 L tarafından hazırlamak LB suyu 121 ° C'de 15 dakika ve ne zaman soğutmalı starter kültürü ile aşılamak.
	<ol>
<li>Bir gecede büyümek 37 ° C'de ve Santrifüjü için kullanılmak üzere tüp sterilize bakteri kültürü izin.</li>
		<li>Bakteri steril tüpler ve 15 dakika 4.600 x g , santrifüj aktarın.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak ve steril su kullanarak, 10 x (10 kat konsantre) OP50 stok oluşturmak için orijinal hacminin % 10 askıya alma.</li>
		<li>1 oluşturmak için 150 ml 10 x OP50 stokunun 15 mL seyreltik x OP50, steril su, zengin-NGM plakaları temel için kullanılmadan önce kullanarak. Tohum FUDR levhalar kullanım kalan 10 x çözüm. Not: Mot plakaları seribaşı kalır ve yalnızca görüntü edinme adımda kullanılacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bakteri, ayırmak zengin NGM ve FUDR plakaları ile tohum plakalar için.
	<ol>
<li>Steril koşullarda, zengin-NGM OP50 tabaklar ve eşit yayılmış 1 x 350 µL ekleyin. Not: Solucanlar plaka ve Kalıp kenarlarına kadar tarıyor olarak plaka kenarına yaymak değil.</li>
		<li>Steril koşullarda, OP50 FUDR için tabaklar ve eşit yayılmış 10 x 350 µL ekleyin.</li>
		<li>Kuru ve kullanımdan önce 2 d için 20 ° C'de kuluçkaya plakaları izin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hazırlanması C. elegans WF-NTP ile kullanmak için
<ol><li>Transfer ederek agar içeren küçük bir miktar taze bir bakteriyel katman üzerine aşağı yönde kurt ya C. elegans zengin NGM tabaklarda korumak. C. elegans suşları deneysel protokoller başlatmadan önce bu şekilde korumak.</li>
	<li>Transfer tekniği kullanarak (bkz. Adım 2.1), her tohum 20 plakaları iyi beslenmiş, karışık sahne solucanlar kullanarak strain ve 20 ° C'de 2 d için büyümeye izin</li>
	<li>M9 ve bir 15 mL tüp havuzda 15 mL kullanarak solucan içeren 5 plakaları kapalı yıkayın. Her yük tüm 20 plakaları için yineleyin.</li>
	<li>Solucanlar 2.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 2 mL M9 çözüm askıya alma.</li>
	<li>% 13 sodyum hipoklorit ve 4 M sodyum hidroksit cilt/vol. 3:2 oranında, karıştırarak 10 mL beyazlatma çözeltisi hazırlamak Not: Bu çözüm ısıyla gerektirmez. Bileşenleri ve elde edilen çözüm aşındırıcı ve nitril eldiven kullanarak dikkatle ele alınmalıdır. Sodyum hidroksit loşluğa hafif aşındırıcı ve plastik kaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Her santrifüj tüpü beyazlatma çözüm 1 mL ekleyin ve yaklaşık 3,5 dk için şiddetle veya manikür tamamen eriyene kadar çalkalanır.</li>
	<li>2 dk. süpernatant kaldırmak ve 15 mL M9 çözüm askıya alma steril koşullarda, örnekleri 15 mL M9 ve santrifüj 2.000 x g de oranında seyreltin.</li>
	<li>2.7 6 kat, sadece solucan yumurta kalır ve çözümü artık bir klor kokusu var kadar adımları yineleyin.</li>
	<li>2.000 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 2 mL M9 çözüm askıya alma.</li>
	<li>Steril koşullarda, M9 içeren yumurta 2 mL 12-iyi doku kültürü plaka her kuyunun içine aktarıp 16 h en az 20 ° C'de kuluçkaya steril Cam Pipet kullanın. Not: Her zorlanma için ayrı levhalar çapraz kontaminasyonu önlemek için kullanın. Santrifüj tüpleri transfer adımından için solucan boğulma önlemek için çok wells yardımcı olur.</li>
	<li>Gecede 12-şey plakalar 15 mL santrifüj tüpler içine yumurtadan solucan aktarın. 5 µL solucan çözüm 3 damla alın ve solucanlar ilk larva aşamasında (L1) mevcut saymak.</li>
	<li>Solucanlar µL çözüm başına sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Tohum L1 üzerine zengin NGM tabak tabak başına 3.000 solucanlar, solucan ve onlar son larva sahne (L4) sahne ulaşana kadar 20 ° C'de 2 gün boyunca büyümeye izin.</li>
</ol>3. genel WF-NTP Protokolü
<ol><li>
Her uyuşturucu bileşik 2,2 mL uygun konsantrasyonu ekleyin (bu kadar 25 veya 10 mM ilaçlar için hangi tarihlerde squalamine1518 ve bexarotene, sırasıyla) için 6 FUDR tabaklar ve her solucan zorlanma istenilen için steril koşullarda kurumasını sağlar. Not: Bu adım her bileşiği altında muayene, her toplama ve kullanılan her çözücü için yinelenir.<ol>
<li>15 mL M9 arabellek kullanarak 2,13 adımda hazırlanan 5 zengin NGM plakaları kapalı solucanlar yıkama ve solucanlar bir santrifüj tüpü aktarmak.</li>
		<li>2.000 x g 2 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 3 mL M9 askıya alma. 5 µL solucan içeren M9 çözümün 3 damla alın ve solucanlar son larva aşamasında L4 mevcut saymak.</li>
		<li>Solucanlar başına µL M9 arabelleği sayısını hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tohum 700 L4 larvaları 6 verilen bir bileşim, her toplama her için işlemi yineleyin içeren kuru FUDR plakaların üzerine Bileşik ve steril koşullarda kurumasını bekleyin.
	<ol>
<li>Solucanlar 24 ° c L4 gelen solucan felç sadece reklam zorlanma38gibi sıcaklık yükselterek nerede indüklenen bu suşlar için kuluçkaya. L4 larva sahne erişkin D0 ertesi günü saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sahne ışıkları için İzleyici'yi açın.
	<ol>
<li>% 70 etanol ile cam sahne temiz ve hiçbir görünür kalıntı kalır, sonra lens kapağı kaldırın emin olun. Bir hava toz bezi kullanarak görüntüleme objektif temiz. Kameranın doğru takılı ve yüklü olduğundan emin olun ve görüntü yakalama yazılımı ile kayıt işlemini başlatmak.</li>
		<li>20 kare/sn, mono 16 parametreleri Kur kayıt ile kaydetmek için kamera ayarlarını; 1200 kare, % 95'i sıkıştırma oranında MJPEG biçimde kaydetmek kaydetmek. Boş bir 9 cm Petri kabına sahneye doğru yüksekliği için ayarlandığından emin olun kullanmak ve gerekirse ayarlayın. Not: Bu düzgün çalışması için 'tutun-ölü' algoritma izin verdiği plaka kenarlarını kayıtta görünür olduğundan emin olun (Şekil 1a).</li>
		<li>Steril koşullarda, daha önce adım 3.2 aynı koşullarla ve 1 Mot 1.2.4. adımda hazırlanan tabak eleme hazırlanmış 2 tabak al. M9 çözüm 3 mL Mot plakasına ekleyin. Kullanım 1/3 adım 3.2 Mot plaka üzerine hazırlanmış 2 tabak yüzey alanının yıkamak için M9 diğer 2 mL.</li>
		<li>M9 çözüm ve yaklaşık 600 solucanlar İzleyicisi'ni Sahne Alanı'na yaklaşık 5 mL içeren Mot tabak koyun. Bireysel bir solucan kullanarak kamera odaklama ve kayıt başlar.</li>
		<li>Kayıt tamamlandığında, solucanlar Mot plakalı atmak; bir kez kullanılan olarak FUDR plakaları işaretlemek ve kuluçka makinesi için geri.</li>
		<li>3.3.3-3.3.5 deneysel her koşul için yineleyin.</li>
		<li>Yetişkin ömrü olarak her zaman için 3.3.3 3.3.6 adımları yineleyin. Not: Solucan'ın yetişkin ömrü (yaklaşık 3 hafta) herhangi bir noktada tarama işlemleri gerçekleştirilebilir. Bu protokoller ilâ 9 saat puan eleme kolaylaştırmak; Yazarlar 2 yetişkinlik gün 1'den başlayan günde eleme öneririz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ayrı doz çalışmaları için optimizasyon
<ol><li>
Solucanlar 3.1.1-3.1.3 adımları tekrar ederek hazırlamak.
	<ol>
<li>Tohum ca. 1000 L4 5 FUDR levhalar solucanlar. D3 erişkin, reklam38 içeren deneyler için solucanlar kadar tabak 24 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Steril cam pipet, transfer kullanarak solucanlar plaka steril koşullarda 15 mL santrifüj tüpü, 2.000 x g , santrifüj 2 min için hazırlanan ve süpernatant kaldırın.
	<ol>
<li>Solucanlar çözüm 1 mL M9 arabellek askıya alma. Bir microcentrifuge Tüp, 2 dk, 300 x g , santrifüj solucanlar aktarmak ve süpernatant kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protein iletim, transfection teslim reaktif 40 µL ve yerli protein 20 µL istenen konsantrasyonu (genellikle 40 µM) eklemek ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
	<ol>
<li>Steril koşullarda, steril Cam Pipet solucanlar 4.2.1 adımından 1060 µL. bir toplam hacmi yer tüpler yatay olarak vermek ve 8 h için kuluçka sallayarak 24 ° c 60 RPM sallamak kapsüllenmiş protein içeren bir microcentrifuge tüp içine aktarmak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Steril koşullarda M9 çözüm 4 mL Mot plakasına ekleyin ve bir microcentrifuge tüp solucanları artı uyuşturucu Mot plaka üzerine aktarın.
	<ol>
<li>İzci kadar adımları 3.3-3.3.2 yineleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Steril koşullarda M9 çözüm 4 mL Mot plakasına ekleyin ve bir microcentrifuge tüp solucanları artı uyuşturucu Mot plaka üzerine aktarın.</li>
		<li>İzci sahne Mot tabağa yerleştirin, bireysel bir solucan kamera odaklama ve kayıt başlayabilirsiniz. Tamamlandığında, Mot plaka etiket ve bir yana ayarlayın.</li>
		<li>4.4.1 4.4.3 için tüm örneklerini aygıtlarından.</li>
		<li>Cam Pipet kullanarak, solucanlar steril koşullarda Mot plaka 15 mL santrifüj tüpü için aktarmak ve Pelet bir FUDR plaka üzerine kaldır süpernatant, transfer, 2.000 x g 2 dakika süreyle santrifüj kapasitesi ve steril koşullarda kurumasını sağlar.</li>
		<li>4.4.5 tüm örnekleri için yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar 24 ° c kadar erişkin D6 kuluçkaya. Not: Birden fazla antikor incubations da mümkündür.</li>
	<li>
M9 arabellek 3 mL Mot plakasına eklemek ve 2 mL M9 çözeltisi Mot plaka üzerine bir FUDR plaka tüm solucanlar yıkamak için kullanın.
	<ol>
<li>İzci kadar adımları 3.3-3.3.2 yineleyerek ayarlayın.</li>
		<li>İzci sahne Mot tabağa yerleştirin, gerektiği gibi kamera odaklama ve kayıt başlayabilirsiniz. Kayıt tamamlandığında, Mot plaka atın veya istenirse daha fazla tarama için yeniden elde etmek.</li>
		<li>4.6-4.6.2 tüm örnekleri için yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Video verilerini çözümleme
<ol><li>
Videoları aldıktan sonra veri analizi için yazılım GUI (Şekil 2) uygun parametreleri seçin.
	<ol>
<li>Tek veya birden çok video yolu ile tarama işlevi yükleyin. Bir çıkış hedef klasörü seçin. 600-1200 kare bir 30 s analiz için kullanıldığından emin olun. Not: Herhangi bir çerçeve aralığını analiz edilebilir.</li>
		<li>Bir piksele mm dönüştürme faktörü, hangi-ecek var olmak için 9 cm Petri yemekler vasıl dolu kararlılık düşsel 0.029 yerleştirin. 'Ölü tutmak' izleme algoritma seçin. Not: Dönüştürme faktörünü kullanılan görüş alanı üzerinde bağlıdır. Z-dönüşümü algoritması de alternatif olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Locating bölüm (Şekil 2) parametrelerinde doldurun: görüntüleri kullanım Z = 100, Z doldurma = 3, Std piksel 54, eşik = = 9, açılış = 1, Kapanış = 2. En küçük boyut için filtre parametrelerini ayarlamak = 20, en fazla boyutu = 180, solucan benzeri 0,94 =.</li>
		<li>Şekil verme yörüngeleri parametreleri ayarlamak: maksimum mesafe taşımak = 10; En az uzunluk = 150, bellek = 10.</li>
		<li>Dirsek ve hız parametrelerini ayarlamak. 1.8 Bend eşikiçin en az virajlıiçin 0 ve 150 için kare hızı tahmin etmek içinkullanın.</li>
		<li>Ölü solucan istatistikayarlayın. 5.0 için dakika başına maksimum yendi ve 1.0 maksimum hıziçin kullanın.</li>
		<li>Çıkış klasörü seçin. Çıkış kare sayısı 50'ye ayarla. Yazı tipi boyutunu 10 değerine ayarlayın. Not: İsteğe bağlı olarak, bir veya daha fazla faiz bölgelerinde (ROIs) seçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Parametreleri örnek işlevini kullanarak sınayın. Örnek görüntüler çıktı ve solucanlar (Şekil 1) 8 eşik adımları görünür olduğundan emin olun.</li>
	<li>İşi başlatmak işlevini kullanın.</li>
	<li>
Metin sonuç dosyaları tüm veri kümesi için tek tek sonuçları birleştirerek analiz. Tsv işlevi ver GUI içinde kullanın. Not: İsteğe bağlı olarak, solucanların bireysel ölçümleri de nüfus çalışmaları için kabul edilebilir.<ol>
<li>İstatistiksel yazılım paketi ile veri analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması vardır bildirin.

Teknikleri optik bilimler alanındaki hızlı genişleme nedeniyle, şimdi önemli ölçüde yeni yollarla otomatik yöntemleri C. elegans çalışmalarda gereksinimini gidermek mümkündür. Sonuç olarak, dijital platformlar20,41,42,43,44,45,46 izleme bir dizi tasarlanmış ve üzerinde kullanılabilir Son birkaç yıldır ve hareket, frekans, felç oranı gibi davranışların omega döner ve ömrü ölçümleri gibi daha karmaşık formlar bükme hızı gibi parametreleri elle saymak yerine için. En son otomatik platformlar tekrarlanabilirlik büyük ölçüde düzeldi ve C. elegans duyarlılığını41 çalışmalar ve yüksek kalitede veri küçük tabur veya bile bireysel hayvanlar üzerinde sağlanan. Biz de bin-in hayvan paralel tabur fenotipleri değerlendirmek mümkün kılmak için solucan davranış analizi Otomasyon uzatma kararı aldı. Solucan tabur eğitim yaklaşımı en büyük avantajı bu solucan davranış24 yüksek iç değişkenliği ve ilaç tedavisi araştırmaları, sık sık olan ince fenotipik varyasyonları için yol aslında hesap oluşturma için sağlanmıştır küçük bir grup hayvan kullanırken yeterli istatistiksel anlamlılık ile tespit etmek zor. Algılama (POD) yüksek gücünü gerçekten güven ile herhangi bir önemli değişiklik davranışlara algılamak ve yanlış pozitif sonuçlar25sınırlamak için gereklidir.
Burada, bir dizi son zamanlarda bildirilen otomatik tarama yöntemi üzerinde C. elegansiçin geniş görüş alanı Yuvarlak solucanlar platformu (WF-NTP)36izleme tabanlı protokol anlatmıştık. Burada açıklanan protokol 5 bölüme ayrılmıştır. Parçalar 1 ve 2 büyük solucan nüfus hazırlanması açıklar. Çalışma koşulları kısırlık ve reaktifler ve levha deneyler çalıştırmak için gereken hazırlanması önemli adımlardır. Biz diğer yöntemleri36eleme karşılaştırıldığında bu protokol tarafından sağlanan artan işlem hacmi nedeniyle, bu da reaktifler artan miktarlarda, gerekir; Bu faktör deneysel tasarım dikkatle düşünülmesi gerekir. Ayrıca ağartma adım önemlidir ve önceden çok sayıda yumurta test edilmesi gerekiyor ve sağlıklı larvalar bu deneyler çalıştırmak için gerekli olan dikkat edin. Bu iletişim kuralı parçası 3 katı ortam ve ekran solucan uyuşturucu nüfus sunmak nasıl ayrıntılı. Bu protokolün bir parçası güçlü ilaçlar ve ilaç konsantrasyonları paralel olarak Kullanıcı tarafından test edilecek sayısına bağlı olduğunu unutmayın. Prosedürü ve hızlı veri toplama tam otomasyon davranış gözlem reaktif hazırlık ve büyüme ve büyük solucan nüfus eşitlenmesi için sınırlayıcı adım kaydır. Anahtar davranış tarama sırasında kayıt ve herhangi bir solucan adımlar (Örneğin, izleme platformu NGM plakalar üzerinden solucanlar transferi) işleme zamanlamaları adımlardır. Burada açıklanan protokolü 9 gün yetişkin ömrü sırasında için solucanlar ekran için tasarlanmış bir örnektir; Ancak, bu iletişim kuralı Kullanıcı, örneğin, 18 gün üst üste36istediği kadar zaman sayı ekran kolayca adapte edilebilir. Bölüm 4 sonra protein molekülleri (örneğin, antikorlar ve moleküler chaperones) teslim etmek için Uygulama Protokolü'nün C. elegansve nasıl parçalar 1-3 resimli Protokolü kolayca, istenen bağlı olarak özelleştirilebilir gösterir gösterir uygulama. Biz nasıl bu yordam sadece uyuşturucu benzeri moleküllerin aynı zamanda moleküler chaperones veya antikorlar37yönetim için teslimat için Genişletilebilir göstermek. İlk dört adımları (parçalar) steril koşullarda, aksi belirtilmediği sürece devam etmektedir. Tüm sıvı bileşenleri kullanılmadan önce autoclaved olmalıdır ve %70 bağıl nem kuluçka adımlar gerçekleştirilmelidir. Bölüm 5, biz nasıl izleme sahne ile birlikte sağlanan yazılım paketi kullanıldığını açıklar. Bu yazılım büyük solucan nüfus davranışını ilgili WF-NTP veri analizi için tasarlanmış özel olmuştur. Kullanıcı veri analizi için Bölüm 5'te sağlanan yönergeleri takip öneririz; Ancak, bu parametreler (yani, fps, görüş alanı, video çözünürlüğü, alınan çerçeve sayısı) Kaydedilen videoların belirli özelliklerine bağlıdır. GUI içinde sağlanan örnek işlevini doğru parametrelerin analiz önce değerlendirilmesi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Bu dizi protokol eserler nedeniyle hayvanlar davranışını içsel değişkenliği azaltmak C. elegans büyük popülasyonlarda (Şu anda en paralel 5000 bireysel solucanlar) fenotipleri etkili bir şekilde analiz etmek mümkün hale , ile anlaşma algılama çalışmaları C. elegans25için istatistiksel anlamlılık elde etmek için gerekli gücü üzerinde ön çalışmalar. Platform yüksek çözünürlüklü kamera, görüntüleri hayvanlar yüksek hızda, çok sayıda aynı anda birden çok büyük tabur kaydederken kaydedebilen bir sistemi kullanır. Yüksek performans ve yüksek akış verimi WF-NTP iletişim kuralı, çok küçük değişiklikler solucan davranış çok doğru bir şekilde belirlemek mümkün kılar. Bu nedenle, bu yöntemi sadece C. elegansbiyoloji çalışma için ama Ayrıca genetik değişiklikler ve uyuşturucu ile yüksek-den geçerek taranması gibi farmakolojik ve tıbbi araştırma için dikkate alınması gereken yeni yaklaşımlar sağlar tedaviler. Bu yordam Ayrıca felç çalışmalar yapılması diğer davranışsal ölçümler ile paralel, moleküler tarama çalışmalarında önemli bir özelliği sağlayan avantajı vardır.
AD15,34,35 ve PD18 ilaç keşif programlarında defa elde sonuçları geniş görüş alanı veri toplama önemli ölçüde artan önemini göstermek numaraları hayvanların önemli ölçüde deneysel hataları azaltmak ve büyük ölçüde çalışmaların istatistiksel geçerliliği iyileştirilmesi tek bir deney izlenebilir. Bu protokol için açıklanan geçerli yaklaşım ilaç keşif alanındaki sorunları ele odaklanmıştır, biz metodoloji toplumda yaygın olarak kabul edileceğini ve uygulanması karmaşık genetik uzun olabilir umuyoruz ve davranışsal çalışmalar ve şu anda tespit fenotipleri sayısını artırmak.

Yaklaşık yarım yüzyıl önce Sydney Brenner Caenorhabditis elegans (C. elegans) geliştirme ve Nörobiyoloji, bu küçük olarak çalışmaya bir modeli sistem olarak tanıttı (1 mm içinde uzunluk), şeffaf yuvarlak solucan işlemek kolay Genetik ve laboratuvar1' korumak için. Bugün, C. elegans çok çeşitli dahil apoptosis, hücre sinyallemesi, hücre döngüsü, gen düzenlemesi, metabolizma doğası ve2yaşlanma biyolojik süreçlerin incelemek için kullanılır. Ayrıca, cep ve doku karmaşıklığı, protein ifade desenleri ve hastalık yolları C. elegans ve (solucan genlerin % 80'i var bir insan orthologue) daha yüksek organizmalar arasında koruma sadeliği ile bağlantılı ve maliyet-etkililik ekimi, yapmak o bir etkili vivo içinde model organizma mükellef yüksek üretilen iş genetik3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ve uyuşturucu14,15,16 gösterimleri. Tüm bu nedenlerden dolayı C. elegans normal ve hastalığı ile ilgili moleküler yolları karakterizasyonu için istihdam edilmiştir; ateş alanında, örneğin, protein toplama3,4,7,15,17yaşlanma etkilerini keşfi editörünü, 18ve organizatör karakterizasyonu ve inhibitörleri protein toplama3,4,5,6,7,14, 18.
Çalışma bu tür tanımlanmış olması önemli bir davranış parametresi olan genel sağlık solucanların, el ile çeşitli şekillerde, gibi vücut kıvrımları dakika (BPM)4,6, başına sayılması tarafından ölçülebilir 19, ya da hareket20,21,22hızını ölçme yanı sıra tarafından ortalama ömrü ve felç oranları ölçmek. El ile ölçümleri vücut kıvrımları ve dolaşım hızı moleküler yolları ve mekanizmaları3,4,14,19çeşitli birçok önemli anlayışlar açmıştır rağmen 20,23, el ile testleri kalır şu anda düşük işlem hacmi, son derece emek ve zaman alıcı iken hataları ve insan önyargıları eğilimli olma. Bu sorunları önemli sorunlar ince davranış değişiklikleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel gücü ile veri koleksiyonunda mevcut. Bu sınırlama tedaviler potansiyel ilaç molekülleri genellikle küçük fenotipik değişiklikler24için yol olarak eleme, bu nedenle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hayvanlar çok sayıda çalışma gerektiren bir uyuşturucu için özellikle uygundur. Bu noktada göstermek için son yıllarda yapılan çalışmalarda algılama (POD) yüksek bir güç ve güven ile önemli bir değişiklik davranışını tanımlamak için yanlış pozitif sonuçlar25gerekli olduğunu göstermiştir. Bu el ile yeniden oluşturulabilir, otomatik, zaman - ve cost - effective ölçümleri ile sayma değiştirmek için güçlü bir motivasyon C. elegans toplumda sonuçlandı. Bu talebi karşılamak için çeşitli Laboratuvarlar son zamanlarda yüksek-duyarlı ölçümler ve doğru solucan solucanlar22,26,27,28 sayıda izlenmesine yönelik yöntemler geliştirdik ,29,30,31,32,33.
Amacıyla daha da istatistiksel olarak anlamlı ölçülerini gerekli hayvanların büyük tabur için Otomasyon işlemi genişletmek için biz son zamanlarda platformu (WF-NTP)15,34 izleme bir geniş görüş alanı Yuvarlak solucanlar geliştirdik ,35,36çok büyük solucan nüfus üzerinde birden çok fenotipik dökümanları, istatistiksel olarak ilgili phenotypical algılama25önemli bir faktör aynı anda incelenmesi sağlar,. Sadece WF-NTP Şu anda paralel 5. 000'e kadar hayvanlar izleyebilirsiniz, ancak fenotipik dökümanları da oranı ve genlik vücut kıvrımları, ve hareket hızı, felç olduğunu, nüfusun kısmı da dahil olmak üzere birden çok parametre içerir ve hayvanlar boyutu. Bu nedenle kolayca ekran binlerce Worms paralel ve farklı sonuçlar bir çok boyutlu parmak izi36oluşturmak için davranışsal bir harita birleştirmek için mümkündür. İlişkili açık kaynak yazılım da bunu çalıştırmak için gereklidir ve tamamen özelleştirilebilir Python ile yazılmış. Kullanıcıların bu teknoloji benimsenmesi bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) mevcuttur.
Burada, bir dizi bazı WF-NTP potansiyel uygulamalar göstermek protokolleri mevcut. Özellikle, bileşiklerin küçük moleküllerin protein therapeutics için değişen yönetim tartışmak ve böylece etkili bir şekilde küçük örnek için ihtiyaç kaldırarak solucanlar, büyük nüfus üzerinde doğrudan etkileri ekran olarak tarif alt nüfus. Böyle bir amaç için kullanılması, WF-NTP zaten Alzheimer hastalığı (Ah)15,34,35 ve Parkinson hastalığı (PD)18 ilaç bulma programları tasarlamak için hedef alan yordamlarda önemli avantajlar getirdi tedavi edici adaylar35,37değerlendirmesi için içinde vivo verileri kullanarak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans Biyomedikal araştırma, yaygın olarak işlevsel genomik ve yaşlanma çalışmaları istihdam iyi kurulmuş bir hayvan modeli var. Sağlık ve fitness altında eğitim hayvanların değerlendirmek için bir genellikle vücut viraj sayısı veya dolaşım hızı ölçümü gibi hareketliliği dökümanları kullanır. Bu ölçümler genellikle el ile sayım içeren, yapım o zaman iyi istatistiksel anlamlılık elde edilir ve kısıtlamaları kez emek zorlu sınırı her deneyde 25 veya daha az hayvan sayısı. Yüksek istatistiksel güç tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve ne zaman zayıf fenotipik etkileri incelenmiştir yanlış pozitif ve negatif sonuçlar sınırlamak için gerekli olduğundan, çabaları son zamanlarda otomatik protokolleri artırılması üzerinde duruldu geliştirmek için yapılmıştır hareket algılama ve çok parametrik davranış profil. duyarlılık Biz burada 5. 000'e kadar bireysel hayvanların çalışma sağlar bir teknolojik gelişme algılama çoğu kez genetik çalışmalar ve ilaç keşif önemli küçük fenotipik değişiklikleri yakalamak için gerekli seviyeye sınırını genişletmek için tarif aynı anda, istatistiksel ölçümler tarafından gücünü artırarak yaklaşık 1000 kat daha fazla karşılaştırıldığında için el ile testleri ve yaklaşık 100-fold diğer kullanılabilir otomatik yöntemlerine göre.

Çalışma, multiparametric analiz ve resimli WF-NTP protokolünün (Şekil 1 ve 2) yüksek üretilen iş kolaylığı çok küçük değişiklikler solucan davranış çok doğru bir şekilde belirlemek olanak sağlar. Özel yapım opto-mekanik tabanlı görüntüleme platformu ve 16 mm odak uzaklığı 1'' sensör, bir 8'' ile arka 8'' beyaz ışık ile aydınlatılmış için yüksek çözünürlüklü lens ile birlikte 6 MP tek renkli kamera ile monte edilebilir ( Tablo malzemeleri görmek ve ayrıca36 ek ayrıntılar için başvuru). İlişkili WF-NTP yazılımları Python ile yazılmış ve Windows platformlarında çalışmak üzere geliştirilmiş. 3.00 GHz octa çekirdekli işlemci ve 64 GB rasgele erişim belleği (RAM) ile özel bir birleştirilmiş bilgisayar üzerinde çalışır. Yazılım aynı zamanda iş ve video analiz RAM ve CPU bilgisayarın temel parallelize tasarlanmıştır; yani, bir makine daha düşük bir hesaplama gücü ile sonuçlanacak içinde daha az videoları paralel olarak çalıştır. Şu anda kullanıyor Kur ca. 16 videoları paralel olarak çalıştırmak için en iyi duruma getirilmiş ve ca. 100 video analizi gecede tamamlayabilirsiniz. Ayrıca, ayrıntılı WF-NTP GUI içinde sağlanan özelleştirme yüksek düzeyde görüntüleme analizi kalitesini büyük kontrol sağlar. GUI doğrudan paralel veya bireysel videoları büyük veri yüklemek için kullanılabilir; belirli çerçeveler de davranışsal ölçümler tahmin etmek için kullanılan bir piksel dönüştürme faktörü ile birlikte detaylı alt analiz için seçilebilir. İki farklı izleme algoritmalar (tutmak ölü ve Z-dönüşümü) Kullanıcı olsun veya olmasın analiz felç hayvanlar düşünün istiyorum bağlı olarak seçilebilir. Eşik parametresi video ile buna göre ayarlanmış ve deneysel kalite olabilir. Açılış ve kapanış parametreleri gürültü çıkarmak ve daha fazla eşik işlevi uygulamak kullanıcı izin verir. Skeletonizing algoritması analiz alternatif bir yöntem sunar. Ek bir filtre arka plan gürültü için nesne boyutu (filtreleme) kesintileri sağlamak ve solucan benzeri parametre solucanlar yalnızca nesneleri ellipsoidal bir şekilde, bu nedenle aynı piksel boyutu olabilir diğer nesnelerden ayırt düşünün düzenlemesine olanak sağlar. solucanlar. Bu eşik işlemlerinden sonra elde edilen etiketli bölgeler bireysel solucanlar belirlenebilir ve bölgelere konumlarını daha sonra her çerçeve için daha sonraki analiz ve iz için saklanır. Her izlenen solucan merkezcillik solucan ölçümleri (BPM) zaman bir fonksiyonu bükme solucan ölçüde gibi tahmin etmek için kullanılır. Kullanıcılar aynı zamanda bir solucan çarpışmalar takip yazılımı bellekte tutmak için kullanılan kare sayısını seçmesine izin verilir ve bir solucan çerçeveler arasında taşıyabilirsiniz piksel sayısını da hayvanlar gürültü ayırt etmek için ayarlanabilir. En az parça uzunluğu seçeneği yalnızca birkaç kare için izlenen solucanlar atmak Kullanıcı sağlar. Virajlı ve hız, gibi diğer anahtar Parametreler vücut viraj ve hayvanlar hızını tahmin etmek için gerekli kabul kare sayısı sayılması için gerekli bükme derecesi seçmesini sağlar. Kesme parametreleri daha fazla felçli hayvanlar eklenmesi için ayarlanabilir. Çıkış sonuç dosyalarını otomatik olarak gösterilir. Bu değerler felçli hayvanlar kısmını değerlendirilmesi için üst sınır olarak kabul edilir. Kullanıcı-ebilmek da seçme bir veya daha fazla bölge ilgi. Bu özellik solucanlar altgrupları çözümlemek yararlıdır ve çıktı sonuç dosyalarını otomatik olarak sıralanır. Output seçeneği çıkış klasörü ve bunun için üretilecek çerçeveler izleme numarası seçmesini sağlar. Bireysel solucan parça gösterir Arsa yol aracı ve kullanıcının parmak izi oluşturmasına izin verir Parmakizi aracı haritaları gibi çeşitli araç kümeleri daha fazla veri çözümleme için de kullanılabilir.
Bu yöntem sadece C. elegans biyolojik araştırmalar aynı zamanda yüksek üretilen iş tarama genetik değişiklikler ve ilaç tedavileri gibi farmakolojik ve tıbbi araştırma amacıyla kabul edilmesi için yeni yaklaşımlar sağlar. Biz bu potansiyeli büyük nüfus araştırmaları (N > 1000) (da demans (FTD)39, Parkinson hastalığı (PD)7 nörodejeneratif hastalığın çeşitli solucan modellerin fenotipleri karakterizasyonu açıklayarak gösterildiği , Alzheimer hastalığı (Ah)16,40ve amyotrofik lateral skleroz (ALS)19 (Şekil 3a) ve PD18 ve reklam solucan modelleri kullanarak potansiyel terapötik molekülleri etkileri karakterize 15,12 (Şekil 3b). İki küçük molekül, squalamine1518 ve bexarotene, en fazla 25 µM konsantrasyonlarda PD (Şekil 3b) ve 10 uygulanmıştır µM reklam38 (Şekil 3b) solucan, anılan sıraya göre. Her iki bileşikler doz bağımlı etkileri konsantrasyonları aralığı boyunca test açık gösterdi. Biz bu yüksek doğruluk ölçümler analiz edilebilir (resim 3 c) geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında solucanları sayısını artırarak elde edilir göstermiştir. Moleküler de mutant suşları karakterizasyonu olduğu gibi eleme içinde örnek boyutu (Şekil 3 c) önemi resimli. 20 ° c sıcaklık artış yetişkinlik 3 gün sonra felç olma Reklam Solucanlar yaklaşık yarısı yol açar. Solucan nüfus ekranlı farklı koşullar altında örneğinne zaman aşırı β-amiloid peptid (Aβ1-42) 42-kalıntı şeklinde ifade solucanlar (reklam solucanlar) ince ısı farklılıkları (Şekil 3 c, sol maruz kaldılar, Aβ1-42 bütün nöronlar (Şekil 3 c, merkezi panel) ya da AD solucan bexarotene (Şekil 3 c, doğru kapı aynası) sinin eklediğinizde ifade edildi panel). Solucanlar da küçük ROIs WF-NTP (N < 50, sarı çubuk) tüm solucan nüfus (N ortalama hareket ile bu solucanları hareketliliği karşılaştırılması vurgulama ile alınan videoları tam görüş alanı rasgele seçildiği üzerinden analiz edildi < 1000). Tüm panelleri, ölçülen fark tüm solucan nüfus p ≤ 0,0001 (*) ile istatistiksel olarak anlamlı gibi görünüyor.
Burada açıklanan WF-NTP Protokolü Ayrıca, en uygun bir şekilde desteklemek için birden çok parametre (Şekil 1b) aynı anda kayıt sağlar koşulları geniş kapsamlı bir parmak izi geliştirilmesi ve iç doğrulama birden fazla çalışmalar arasında anlamlı karşılaştırmaların yapılmasına olanak denetim, bir örneğe göre. Bu çok parametrik yaklaşımı frekans, hız, felç oranı, boyutu, bend genlik ve bend deplasman36bükme dahil olmak üzere birden çok davranış özellikleri, aynı anda analizini içerir. Bu bin-in hayvan ayrıntılı olarak ve bir çok yüksek hassasiyet ve istatistiksel anlamlılık izlenecek ve büyük popülasyonlarda çalışmaları için fırsatlar sağlar. Bu izleme yordamı da felç çalışmalar yapılması diğer davranışsal ölçümler ile paralel, moleküler tarama çalışmalarında önemli bir özelliği sağlayan avantajına sahiptir.
Bu kadar reklam15,34,35 ve PD18 ilaç keşif elde ettik sonuçları büyük ölçüde olabilir hayvan sayılarını artırmak için geniş görüş alanı veri toplama önemini göstermek önemli ölçüde deneysel hataları azaltmak ve büyük ölçüde çalışmaların istatistiksel geçerliliği iyileştirilmesi tek bir deney izlenir. Bu sonuçlara dayanarak, biz toplum36için hazır yaptık, WF-NTP Protokolü önemli ölçüde C. eleganskullanımı uzatacaktır tahmin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Şekil 1: WF-NTP çözümleme adımları ve parmak izi örneği. (bir) 1. Orijinal video. 2. arka plan görüntüsü. 3. arka plan görüntü çıkartılır. 4-6. eşik adımları. 7-9. tek kurtlardan etiketleme. (b) birden fazla fenotipleri vahşi tipi solucanlar için parmak izi ile bildirdi ve solucan PD ve reklam modelleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Şekil 2: grafik kullanıcı arayüzü (GUI) WF-NTP. Belirli Videoları ve Seçili kare analizi için GUI seçilebilir ve sonra analiz bir iki belirli izleme algoritmaları ile gerçekleştirildiği bir piksel dönüştürme faktörü eklenebilir. Vücut viraj olarak hem de hayvanlar hızını tahmin etmek için gerekli kare sayısını saymak gerekli bükme derecesi seçmek mümkündür. Vücut kıvrımları ve hız eşikleri felçli solucan istatistikleri belirleyebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Şekil 3: WF-NTP yöntemi tarafından etkin uygulamalara örnek olarak. (bir) uygulama WF-NTP büyük nüfus çalışmaları (N > 1000) FTD, PD, reklam, dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların bir dizi C. elegans modelleri için BPM ölçümlerin ve ALS. (b) uygulama WF-NTP ilaç bulma. (c) sıcaklık hassasiyeti, ilaç etkinliğini ve mutant suşu karakterizasyonu nüfus araştırmaları önemi. Fenotipleri altgrupları N < 50 (sarı çubuk) bu tüm solucan nüfus ile karşılaştırılır (N < 1000). Hata çubukları demek (SEM) standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Biz yüksek üretilen iş Caenorhabditis elegansbüyük popülasyonlarda fenotipik karakterizasyonu sağlayan geniş görüş alanı nematodunun izleme platformu (WF-NTP) kullanarak iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller mutant suşları veya yüksek ölçeklenebilir bir moda farmakolojik tedaviye yanıt ince davranış değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Yani bu yöntem, belirli bir ilacın yaşayan bir organizmada nasıl işlediğine dair bir ilaç bulma sürecindeki anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, büyük örnek boyutlarının hızlı ve verimli bir şekilde taranmasını sağlamasıdır. Bu teknik, uyuşturucu adaylarının etkilerinin son derece niceliksel bir değerlendirmesini sağlayarak ilaç keşfinde zaten önemli bir etkiye sahiptir.Bu yöntem, yanlış katlama hastalıklarının başlangıcı ve ilerlemesi içine yeni mekanistik anlayışlar sağlar. Ayrıca bu yöntem yaşlanma ve genetik taramalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Uyuşturucu keşfi alanına yeni fiziksel yöntemler getirme fırsatı bizi çok heyecanlandırıyor.Tarama adımları bu novo otomatik teknik ile yüksek aşinalık gerektirdiğinden bu yöntemin bu demonstartions önemlidir. Prosedürü gösteren Sam Casford, laboratuarımızdan bir arama asistanı olacak. İşleme başlamadan önce, her ilaç bileşiğinin uygun konsantrasyonda 2,2 milileter ekleyin ve solucan suşu başına altı adet 5-fluorodeoxyuridine veya FUDR plakası, bileşiğin tüm yüzeyine dikkatlice yayarak ve tabakları steril koşullarda kurutarak.Plakalar kururken, solucanları beş zengin nematod büyüme faktörü plakasından yıkamak için 15 mililitre M9 tamponu kullanın ve kurtarılan solucanları santrifüj için konik bir tüpe aktarın. L4 larva aşamasında solucan sayısının ölçülmesi için taze M9 tampon üç mililitre nematodlar yeniden askıya, ve tohum 700 L4 larvaher solucan suşu başına altı kuru FUDR plakaları üzerine, bileşik başına. Tüm nematodlar tohumlu olduğunda, 24 saat boyunca 24 santigrat derece sıcaklık yükselterek parlysis indüklenen suşları içeren plakalar yerleştirin.Ertesi gün, paralel solucan izcisahne ışıkları açın ve yüzde 70 etanol ile izci cam sahne temizleyin. Görünür kalıntı kalmazsa, lens kapağını çıkarın ve görüntüleme lensini temizlemek için bir hava sökücü kullanın. Kameranın doğru şekilde takılı ve takılı olduğunu doğrulayın ve görüntü yakalama yazılımıyla kaydetmeye başlayın.Kamera ayarlarını uygun mono-16 kayıt parametreleriyle saniyede 20 kare kaydacak şekilde ayarlayın. Sahnenin doğru yüksekliğe ayarlandığından emin olmak için boş, dokuz santimetrelik bir petri kabı kullanın ve gerekirse sahneyi ayarlayın. Steril koşullar altında, bir motilite tarama plakasına üç mililitre M9 çözeltisi ekleyin ve aynı deney grubundan aynı deney grubundan iki nematod yüklü FUDR plakasının yüzey alanının üçte birini yıkamak için iki mililitre M9 çözeltisi kullanın.Daha sonra, tarama plakasını izci aşamasına yerleştirin. Kamera odaklanmak için tek bir solucan kullanın ve hayvanları kaydetmeye başlayın. Kayıt tamamlandığında, hareketlilik plakasını atın ve FUDR plakalarını kuvöze geri vermeden önce bir kez kullanılmış olarak işaretleyin.Video verilerini analiz etmek için paralel solucan izci veri analizi yazılımı grafik kullanıcı arabirimini açın ve ilgi çekici videoyu yüklemek için tarama işlevini kullanın. Bir çıktı hedef klasörü seçin ve 30 saniyelik bir çözümleme için 600 ila 1200 çerçeveayarlı olduğunu onaylayın. Tam çözünürlükte dokuz santimetrelik petri kabının görüntülenmesi için 0,029 pikselden milimetreye dönüştürme faktörü ekleyin ve ölü izleme algorithhm'ini seçin.Konum belirleme parametreleri sekmesialtında, Z-use görüntülerini 100'e, Z dolguyu 3'e, standart pikselleri 54'e, eşiği 9'a, 1'e açılımı ve 2'ye kapatmaya ayarlayın. Filtreleme parametrelerini en az 20, en fazla 180 boyutuna ve 0,94 gibi bir solucana ayarlayın. Şekillendirme yörüngeparametrelerini en fazla 10 mesafe hareketine, en az 150 uzunluğa ve 10 belleğe ayarlayın.Bükümleri ve hız parametrelerini 1,8 büküm eşiğine, en az 0 bükümlere ve hızı tahmin etmek için 150'ye ayarla. Ölü solucan istatistiklerini dakikada 5'lik bir maksimum minmim vuruşu ve maksimum 1 hıza ayarlayın. Çıktı klasörünü seçin ve çıktı çerçevesi sayısını 50'ye, yazı tipi boyutunu da 10'a seçin.Parametreleri sınamak için örnek işlevi kullanın ve solucanların sekiz eşik adımıboyunca görünür olup olmadığını kontrol etmek için örnek görüntüleri çıktı. Ardından Start Job" işlevini başlatın ve test sonuç dosyalarını çözümlemek için tüm veri kümesinin tek tek sonuçlarını birleştirerek sonuçları TSV işlevine dışa aktarma yoluyla kaydedin. Bu yöntem, Frontotemporal Demans, Parkinson Hastalığı, Alzheimer Hastalığı ve Amiyotrofik Lateral Skleroz gibi nörodejeneratif hastalığın çeşitli solucan modellerinin büyük nüfus çalışmaları için nematod fenotiplerin karakterizasyonu sağlar.Yanı sıra potansiyel terapötik moleküllerin etkilerinin karakterizasyonu, Parkinson ve Alzheimer Hastalığı solucan modelleri kullanarak. Bu ölçümlerin yüksek doğruluğu, geleneksel yöntemlere göre analiz edilebilen solucan sayısının artırılması ile elde edilir. Bu yordamı gerçekleştirirken, solucanların hareketliliğe eklenmesi ile izlemenin başlangıcı arasındaki süreyi en aza indirmeyi unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, diğer yöntemler sonuçları tamamlamak ve protein toplama ile bağlantı için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif ve yanlış katlama hastalıkları alanında araştırmacıların doğru keşif uygulamalarını keşfetmelerinin önünü açtı. FUDR ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve nitril eldiven takmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...