Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

يشكر المؤلفون مجموعة هيديوك هونغ في قسم الكيمياء، جامعة ولاية ميشيغان، يرجى توفير خلايا الإشريكيّة القولونية للتجارب. يشكر المؤلفون الدعم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة، والوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) من خلال منحة R01GM118470 (على X. Liu) ومنحة R01GM125991 (للأم الشمس و X. Liu).

1-إعداد طلاء بدل الوالد الوحيد على الجدار الداخلي لشعري الانفصال
<ol><li>
المعالجة المسبقة شعري
	<ol>
<li>مسح شعري والسليكا فوسيد تباعا مع 500 ميليلتر هيدروكسيد الصوديوم 1 م والمياه، وحمض الهيدروكلوريك 1 م، المياه. و LC-MS الصف الميثانول باستخدام مضخة الحقن (120 سم في الطول، 50 ميكرومتر في القط...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Electrospray+Ionization+Interface+for+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip.">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li><li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis.">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests.">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li><li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry:+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome.">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC+:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions.">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

هنا نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام تشيكيا-MS/MS لتوصيف الاستبانة بروتيوفورمس في عينات بسيطة البروتين وتحديد بروتيوفورمس في عينات البروتين معقدة واسعة النطاق. رسم تخطيطي لمنظومة تشيكيا-ESI-MS/MS يرد في الشكل 1. هناك أربع خطوات حاسمة في البروتوكول. أولاً، إعداد عالي الجودة [لبا] الطل...

ويهدف البروتيوميات من أعلى إلى أسفل (ماساتشوستس) لوصف بروتيوفورمس داخل البروتين على نطاق واسع. TDP تعتمد على فصل السائل-المرحلة الفعالة من البروتينات سليمة قبل التحليل الكتلي التأين-جنبا إلى جنب (أي إس أي-MS/MS) اليكتروسبراي بسبب تعقيد عالية وتركيز كبير النطاق الديناميكي ل البروتين1،2 3، ،،من45. المنطقة الشعرية التفريد (تشيكيا) تقنية قوية لفصل الجزيئات الحيوية استناداً إلى نسب الحجم-إلى-المسؤول عن6. تشيكيا بسيط نسبيا، التي تتطلب فقط فتح أنبوبي تنصهر السيليكا شعرية، خلفية اﻻلكتروﻻيت (بجي)، وإمدادات طاقة. يمكن تحميل عينة بروتينات سليمة في شعري استخدام الضغط أو الجهد، والانفصال هو بدأها غمر طرفي شعري في بجي وتطبيق جهد العالي. تشيكيا يمكن النهج كفاءة فصل عالية جداً (> لوحات النظرية 1 مليون) لفصل الجزيئات الحيوية7. تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد لديه حساسية أعلى كثيرا مما تستخدم على نطاق واسع عكس المرحلة اللوني السائل (ربلك)-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل البروتينات سليمة8. على الرغم من أن مرض التصلب العصبي المتعدد-تشيكيا إمكانات كبيرة لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات، قد أعاق تطبيقها على نطاق واسع في البروتيوميات العديد من القضايا، بما في ذلك انخفاض تحميل عينة القدرة ونافذة ضيقة الانفصال. العينة النموذجية تحميل وحدة التخزين في تشيكيا هو حوالي 1 في المائة من مجموع حجم الشعرية، الذي يقابل عادة إلى أقل من 100 nL9،10،11. فصل نافذة تشيكيا عادة أقل من 30 دقيقة بسبب9،اليكتروسموتيك قوي التدفق (EOF)10. تحد هذه القضايا تشيكيا-MS/MS للتعرف على عدد كبير من بروتيوفورمس ومنخفضة بروتيوفورمس وفيرة من البروتين معقدة.
بذلت الكثير من الجهد لتحسين نموذج تحميل وحدة التخزين تشيكيا عبر نموذج عبر الإنترنت تركز أساليب (مثلاً، ميكروكستراكشن المرحلة الصلبة [سبمي]12،13، المزودة بحقل نموذج التراص [FESS]9 , 11 , 14، والأس الهيدروجيني دينامية مفرق15،16،،من1718). FESS ومفرق الأس الهيدروجيني الديناميكية أبسط من سبمي، تتطلب فقط اختلاف كبير بين المخزن المؤقت الذي عينة وبج في الموصلية والأس الهيدروجيني. FESS يستخدم المخزن مؤقت عينة مع كثير موصلية أقل مما بجي، مما يؤدي التراص لتحليلها على الحدود بين منطقة العينة ومنطقة بجي في شعري. ملتقى الأس الهيدروجيني دينامية تستخدم المكونات عينة أساسية (مثلاً، بيكربونات الأمونيوم 50 ملم، ودرجة الحموضة 8) وبجي حمضية (مثلحامض الخليك 5% [v/v]، الرقم الهيدروجيني 2.4) على كلا الجانبين من المكونات العينة. بناء على طلب جهد العالي إيجابية في نهاية حقن شعري، يحدث المعايرة للمكونات العينة الأساسية، تركز تحليلها إلى سد ضيقة قبل أن يخضع فصل تشيكيا. في الآونة الأخيرة، مجموعة الشمس بانتظام مقابل FESS ومفرق الأس الهيدروجيني دينامية التراص على الإنترنت من البروتينات سليمة، مما يدل على أن تقاطع الأس الهيدروجيني دينامية يمكن أن تؤدي إلى أداء أفضل بكثير مما FESS لتركيز البروتينات سليمة على الإنترنت عندما وكان حجم العينة حقن 25 في المائة من إجمالي حجم الشعرية19.
فصل المغلفة بصورة محايدة الشعيرات الدموية (مثلاً، بولياكريلاميدي الخطية [[لبا]]) قد استخدمت لتقليل EOF في الشعرية، تباطؤ انفصال تشيكيا واتساع20،نافذة الفصل21. في الآونة الأخيرة، دوفيتشي وضعت المجموعة إجراءات بسيطة لإعداد طلاء بدل الوالد الوحيد المستقر في الجدار الداخلي الشعيرات الدموية، الاستفادة من فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) البادئ ودرجة الحرارة (50 درجة مئوية) لإنتاج الجذور الحرة والبلمره22 . مؤخرا جداً، يعمل فريق الشمس فصل الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد وأسلوب مفرق الأس الهيدروجيني دينامية لفصل البروتينات سليمة، وتشيكيا التوصل إلى عينة ميكروليتير-مقياس تحميل وحدة التخزين ومن نافذة فصل 90 دقيقة19. هذا نظام تشيكيا يفتح الباب أمام استخدام تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات.
تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد يتطلب واجهة قوية للغاية وحساسة للزوجين تشيكيا لمرض التصلب العصبي المتعدد. كانت ثلاثة CE-مرض التصلب العصبي المتعدد الواجهات نمواً جيدا وتسويقها تجارياً في تاريخ CE-مرض التصلب العصبي المتعدد، وهم غمد co-المحوري-تدفق واجهة23، واجهة شعثلس باستخدام تلميح مسامية ك باعث ESI24، والكهربائية-كينيتيكالي غمد ضخ تدفق واجهة25،26. وصلت غمد-واجهة-القائم على التدفق ضخ كينيتيكالي الكهربائية تشيكيا-MS/MS زيبتومولي منخفضة ببتيد الكشف عن الحد الأقصى9، 10,000 أكثر تعريفات الببتيد (IDs) من الحلة الخلية البروتين في واحد تشغيل14، وصف سريع 11من البروتينات سليمة، وتحليلات مستقرة للغاية واستنساخه من الجزيئات الحيوية26. في الآونة الأخيرة، استخدمت الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد الفاصل، وطريقة تقاطع الأس الهيدروجيني دينامية، وواجهة تدفق غمد ضخ كينيتيكالي الكهربائية البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع للبروتين الإشريكيّة القولونية (كولاي)19 ،27. منهاج تشيكيا-MS/MS اقترب أكثر من 500 بروتيوفورم المعرفات في واحد تشغيل19 وتقريبا 6,000 بروتيوفورم معرفات عبر اقتران مع حجم الاستبعاد اللوني (ثانية)-ربلك وجود27. تشير النتائج بوضوح قدرة تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات.
ويرد هنا، إجراء مفصل لاستخدام تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات. ويستخدم النظام تشيكيا-MS/MS الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد لتقليل الفولكلوري في الشعرية، أسلوب مفرق الأس الهيدروجيني دينامية لتركيز البروتينات، واجهة تدفق غمد ضخ كينيتيكالي الكهربائية لاقتران تشيكيا لمرض التصلب العصبي المتعدد، أوربيتراب الإنترنت الشامل مطياف لجمع أطياف مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/MS للبروتينات، وبرمجيات توبيك (TOP-Down Mass Spectrometry-Based بروتيوفورم تحديد وتوصيف) لمعرف بروتيوفورم عن طريق قاعدة بيانات البحث.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

قد اعترفت المنطقة الشعرية اليكتروسبراي الكهربي التأين-جنبا إلى جنب الكتلي (تشيكيا-ESI-MS/MS) كأداة مفيدة للبروتينات من أعلى إلى أسفل التي تهدف إلى وصف بروتيوفورمس في بروتيوميس المعقدة. ومع ذلك، تطبيق تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات قد أعاق قدرة عينة-تحميل منخفض وتضييق إطار الانفصال لتشيكيا. هنا، هو وصف بروتوكول استخدام تشيكيا-MS/MS مع حجم عينة-تحميل ميكروليتير على نطاق وإطار فصل 90 دقيقة لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات. يستند منهاج تشيكيا-MS/MS خطي polyacrylamide ([لبا])-الشعرية مع تدفق اليكتروسموتيك منخفضة للغاية، وطريقة تركيز عينة على إنترنت ديناميكية الأس الهيدروجيني-المستندة إلى مفرق مع كفاءة عالية للبروتين التراص، المغلفة فصل غمد الكهربائية كينيتيكالي ضخ تدفق CE-مرض التصلب العصبي المتعدد واجهة مع حساسية عالية للغاية، وفخ أيون مطياف شامل مع ارتفاع كتلة القرار وسرعة المسح الضوئي. يمكن استخدام المنصة لتوصيف عينات بسيطة من البروتين سليمة ذات الدقة العالية ووصف بروتيوفورمس في بروتيوميس المعقدة المختلفة على نطاق واسع. ويتجلى على سبيل مثال، فصل خليط البروتين القياسية ذات كفاءة عالية وحساسة للغاية الكشف عن العديد من الشوائب باستخدام المنصة. وكمثال آخر، هذا المنهاج يمكن أن تنتج ما يزيد على 500 بروتيوفورم وتشغيل تعريفات البروتين 190 من البروتين القولونية الإشريكيّة في واحد تشيكيا-MS/MS.

ويبين الشكل 1 مخططا لنظام ديناميكي تشيكيا-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد المستندة إلى مفرق الأس الهيدروجيني المستخدمة في التجربة. المكونات طويلة من العينة في المخزن مؤقت أساسية يحقن المغلفة ببدل الوالد الوحيد فصل شعرية مليئة بجي حمضية. بعد تطبيق الف?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

ويرد وصف بروتوكول مفصل لفصل وتحديد، وتوصيف بروتيوفورمس في عينات البروتين باستخدام المنطقة الشعرية اليكتروسبراي الكهربي التأين-جنبا إلى جنب الكتلي (تشيكيا-ESI-MS/MS). يمكن استخدام البروتوكول لتوصيف الاستبانة بروتيوفورمس في عينات بسيطة البروتين وتحديد بروتيوفورمس في عينات البروتين معقدة واسعة النطاق.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحسين توصيفات عالية النطاق وعالية الدقة للبروتين isoforms والتعديلات اللاحقة للبروتين في الخلايا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن منطقة الشعيرات الدموية الكهربائي الطيفي الشامل يوفر فصل عالية الكفاءة والكشف الحساسة للغاية من البروتينات سليمة. لعلاج ما قبل الشعرية، جففه بغاز النيتروجين عند 10 بوصة مربعة لمدة 12 ساعة على الأقل.ثم، ملء شعري مع 50٪ حجم من قبل حجم 3-بروبيل الميثاكريلات في الميثانول باستخدام مضخة حقنة. ختم طرفي شعري مع المطاط السيليكا. بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة على الأقل، والاستمرار مع طلاء بوليكريلاميد خطي على الجدار الداخلي من الشعرية الفصل، كما هو موضح في بروتوكول النص.حرق جزء من شعري باستخدام لهب لطيف لإزالة الطلاء الخارجي بوليميد حوالي أربعة سنتيمترات بعيدا عن نهاية واحدة من الشعرية. تنظيف بلطف الجزء المحروق من الشعرية عن طريق مسح لإزالة طلاء البولي أميد تماما. حفر حفرة صغيرة في نهاية أنبوب 200 ميكرولتر حول نفس حجم القطر الخارجي الشعري لعقد ما يكفي من الشعيرات الدموية في مكان بمجرد أن يتم الخيوط من خلال هذا الثقب.خيط نهاية الشعرية التي هي قريبة من الجزء المحترق من خلال ثقب حتى الجزء المحترق هو في الأنبوب. ثم، إضافة ما يقرب من 150 ميكرولترات من التردد العالي إلى أنبوب 200 ميكرولتر بحيث حل HF هو حوالي منتصف الطريق حتى الجزء المحترق على شعري. احتضان الشعيرات الدموية في محلول HF في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 إلى 100 دقيقة.إعداد مزيج البروتين القياسي وعينة الإشريكية القولونية كما هو موضح في بروتوكول النص. لإعداد منطقة الشعيرات الدموية الكهربائية، أو نظام CZE، تحميل العينة، والكهرباء الخلفية، والشعيرات الدموية في CZE العينات التلقائي. حدد نموذج التحميل في صفحة التحكم اليدوي من العينات CZE التلقائي.قم بتحميل قارورة الإلكتروليت الخلفية في علبة المخزن المؤقت لعينات السيارات، مع الإشارة إلى موضعها في حاوية المخزن المؤقت. ثم، قم بتحميل قارورة العينة في علبة العينة العينة التلقائية، مع الإشارة إلى موضعها في علبة العينة. ضع العينات التلقائية إلى موضع المحاذاة باستخدام التحكم اليدوي.الآن، تحميل الشعرية فصل في CZE لصناعة السيارات العينات باستخدام نهاية غير محفورة من الشعرية. ضبط ارتفاع نهاية حقن الشعرية إذا كان حجم العينة أقل من 50 ميكرولترات. قم بتبديل العينات التلقائية إلى وضع الاستعداد باستخدام التحكم اليدوي.اكتب موضع العينة في النظام ثم حرك الشعيرات الدموية إلى العينة. دفع نهاية حقن الشعرية مزيد من أسفل للوصول إلى الجزء السفلي من القارورة عينة. الاستمرار في استخدام التحكم اليدوي، مسح شعري مع المنحل بالكهرباء الخلفية لمدة 20 دقيقة باستخدام ضغط 20 psi.الآن، جبل تجاري كهربائي ضخ واجهة تدفق اغنم إلى الجزء الأمامي من مطياف الكتلة. ملء خزان العازلة مع العجم مع العازلة التي تحتوي على 10٪ حجم حجم الميثانول و 0.2٪ حجم حجم حمض فورميك في المياه LCMS الصف. تدفق T في واجهة مع العازلة مع اغدغة عن طريق الضغط عن طريق الضغط يدويا مع حقنة.خيط الطرف الخارجي قطر واحد ملليمتر من باعث اكزبر من خلال أنابيب الأكمام وتوصيل الباعث بمنفذ واحد من T عبر تركيب. ببساطة تدفق T يدويا مرة أخرى مع حقنة لملء باعث مع العازلة اغرد. ضبط المسافة بين فتحة الباعث ومدخل مطياف الكتلة إلى ما يقرب من مليمترين بمساعدة الكاميرا التي تأتي مع الواجهة.تطبيق جهد 2-2.2 كيلوفولت في قارورة العازلة الزدة للرذاذ الكهربائي. ثم، ضبط الجهد رذاذ للوصول إلى رذاذ كهربائي مستقر. تطبيق ضغط منخفض في نهاية حقن الشعرية خلال هذه العملية للتأكد من عدم وجود فقاعات في الشعيرات الدموية.إيقاف الجهد رذاذ وخيط بلطف نهاية محفورة من الشعرية فصل من خلال T في باعث حتى لا يمكن دفعها أكثر من ذلك. بعد وقف الضغط المنخفض في نهاية حقن الشعرية، تدفق باعث قليلا مع عازلة اغددار. مرة أخرى، تطبيق اثنين إلى 2.2 كيلوفولت من رذاذ الجهد لاختبار رذاذ.حدد طريقة جديدة تحت القائمة المنسدلة ملف على الشاشة الصك الرئيسي. هناك، حدد مدخل كقارورة عينة البداية، وإنهاء قارورة عينة، صينية كعينة، والضغط على النحو خمسة psi، كيلوفولتس كما صفر، ومدة 95 ثانية لحقن العينة. ثم، تعيين مدخل كما قارورة مدخل، علبة كما العازلة، والضغط كما psi صفر، كيلوفولت 30، ومدة 4، 200 ثانية لفصل عينة بروتينية القياسية.لفصل عينة البروتيوم الإشريكية القولونية، تعيين مدخل قارورة مدخل، صينية كما العازلة، والضغط كما صفر PSI، كيلوفولتس 20، ومدة 6، 600 ثانية. وأخيرا، حدد مدخل قارورة مدخل، علبة كما العازلة، والضغط كما 10 psi، كيلوفولتس ك 30، ومدة 600 ثانية لالرمشاط الشعرية. الآن، إعداد المعلمات MS وMS / MS لتحليل البروتين سليمة باستخدام مطياف قناع فخ ايون رباعية.لضبط إعدادات ملف التناغم، قم بتشغيل وضع البروتين السليم واستخدم ضغط تعويض اللون 0.2. تعيين درجة حرارة الشعيرات الدموية نقل أيون إلى 320 درجة مئوية ومستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة إلى 55. لتنفيذ تجربة MS/MS CZE، ابدأ تشغيل أسلوب الحصول على البيانات على جهاز الكمبيوتر الطيفي الشامل، أولاً بتحديد تسلسل التشغيل.ثم، بدء تسلسل الكهربائي الشعرية على الكمبيوتر الكهربائي الشعرية العينات التلقائي. إجراء بحث في قاعدة بيانات باستخدام TopPIC في مجموعة TopPIC وفي واجهة المستخدم الرسومية TopPIC. انقر فوق ملف قاعدة البيانات وحدد قاعدة بيانات مناسبة للبحث.انقر على ملف الطيف وحدد ms2 ولدت. msalign الملف الذي تم إنشاؤه كمدخل. حدد ملف ميزة MS1 واختر ملف الميزة التي تم إنشاؤها.تعيين السيستين كارباميدوميثيل C57 كتعديلات ثابتة بسبب علاج iodoacetamide. حدد ميزة قاعدة بيانات الخداع وتحت إعدادات القطع، حدد معدل اكتشاف زائف في القائمة المنسدلة بجوار مستوى الطيف. تعيين معدل الاكتشاف الخاطئ إلى 0.01 على مستوى الطيف.ترك وظيفة توليد غير محددة وتعيين التسامح مع الخطأ إلى 15 أجزاء في المليون. تعيين معدل اكتشاف كاذبة إلى 0.05 على مستوى البروتيفورم. ضمن المعلمات المتقدمة، حدد اثنين للعدد الأقصى من التحولات الجماعية في القائمة المنسدلة.تعيين الحد الأقصى للتحول الشامل من تعديلات غير معروف إلى 500 daltons. اترك كافة المعلمات الأخرى بقيمها الافتراضية وانقر فوق زر البدء في أسفل يمين واجهة المستخدم الرسومية. يظهر المخطط الكهربائي التمثيلي لخليط البروتين القياسي.وعادة ما يتم تشغيل مزيج البروتين القياسي على الأقل في مكررة لتقييم كفاءة الفصل وإعادة إنتاج النظام. ويمكن تقييم كفاءة الفصل مع عدد من لوحات نظرية من بعض البروتينات. ويمكن تقييم قابلية التكاثر من خلال الانحرافات المعيارية النسبية لكثافة البروتين ووقت الهجرة.يمكن استخدام منصة CZE MS/MS لتوصيف البروتيوفورم على نطاق واسع في مختلف البروتيومات المعقدة ، وتحديد أكثر من 500 بروتيوفورم و 190 بروتين من بروتين الإشريكية القولونية في شوط واحد بثقة عالية. هنا، يمكن استخدام التكبير في ضوء electropherogram لتقييم نافذة الفصل للنظام. القيمة الإلكترونية المنخفضة جداً وFDR الطيفية تشير إلى الثقة العالية من ID.The proteoform ID.The ارتفاع عدد الأجزاء المتطابقة يشير كذلك إلى الثقة العالية من ID.While محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الخيط الشعري الفصل المحفورة في باعث رذاذ كهربائي ببطء وبلطف.يمكن دمج وضع العلامات النظيرية المستقرة أو الأساليب الخالية من التسميات في إجراء CZE MS لتحديد كيفية تغير الوفرة البروتيفورمية في الخلايا عبر ظروف مختلفة. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البروتيوميات من أعلى إلى أسفل لاستكشاف أدوار البروتيفورمات في تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة في الخلايا. لا ننسى أن العمل مع حمض الهيدروفلوريك يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة وجود إجراءات الطوارئ في مكان دائما عند تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

نطاق واسع غير المستهدفة التنميط Metabolomic من المصل بواسطة الترا الطيف الأداء اللوني الكتلة السائل (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - واضح الأصلية جل مزال-جزء السائل الفخ الكهربائي

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

تحليل التنفس في الوقت الحقيقي باستخدام التأين نانوليكتروسبراي الثانوية بالإضافة إلى دقة عالية الطيف الكتلي

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

مراقبة المخدرات الفائق وشاملة باستخدام مولتيسيجمينت الشعرية حقن التفريد الكتلي

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

إعداد الترافيسيرات الشعرية -البلازما المقترنة الاستقرائي الطيف الطيفي (CE-ICP-MS) لقياس كمية من أنواع الأكسدة الحمراء الحديد (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...