Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

המחברים מודים הקבוצתית של Heedeok הונג-במחלקה לכימיה, אוניברסיטת מישיגן, על בחביבות לספק את התאים Escherichia coli הניסויים. המחברים תודה את התמיכה הלאומית המכון כללי רפואי למדעים, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך גרנט R01GM118470 (ל X. Liu), R01GM125991 גרנט (כדי ל' א' ו- X. Liu).

1. הכנת ציפוי LPA על הקיר הפנימי של נים ההפרדה
<ol><li>
רעלני של נימי
	<ol>
<li>ריקון של נימי fused סיליקה (120 ס מ אורך, 50 מיקרומטר בקוטר הפנימי [תעודת זהות], 360 מיקרומטר קוטרו החיצוני [יתר]) במרוכז עם 500 µL של 1 מ' נתרן הידרוקסידי, מים יונים, חומצה הידרוכלורית 1 מ', מים יונים ו LC-MS כיתה מתנול באמצעות מז?...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Electrospray+Ionization+Interface+for+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip.">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li><li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis.">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests.">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li><li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry:+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome.">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC+:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions.">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי להשתמש CZE-MS/MS עבור אפיון proteoforms דגימות חלבון ברזולוציה גבוהה, זיהוי בקנה מידה גדול proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים. דיאגרמה של מערכת CZE-ESI-MS/MS מוצג באיור1. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הכנת ציפוי LPA באיכות גבוהה על הקיר הפנימי של נ?...

פרוטאומיקס מלמעלה למטה (TDP) שואפת אפיון proteoforms בתוך פרוטאום בקנה מידה גדול. TDP מסתמך על ההפרדה שלב נוזלי יעיל של חלבונים שלמים לפני ניתוח יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (ESI-MS/MS) ספקטרומטריית electrospray בשל המורכבות גבוהה של טווח דינמי ריכוז גדול של פרוטאום1,2 ,3,4,5. אזור נימי אלקטרופורזה (CZE) היא טכניקה חזקה עבור הפרדת מולקולות המבוססת על יחסי גודל לתשלום שלהם6. CZE היא יחסית פשוטה, הדורשים בלבד פתוח צינורי התמזגו סיליקה נימי, על רקע אלקטרוליט (BGE), ספק כוח. מדגם של חלבונים שלמים ניתן לטעון לתוך נימי באמצעות לחץ או מתח, ההפרדה הוא שיזם הטבעית בשני קצוות נימי ב BGE ויישום של מתח גבוה. CZE יכולים לגשת יעילות הפרדה גבוהה במיוחד (> לוחות תיאורטי מיליון) דוגל בהפרדה בין מולקולות7. CZE-MS יש רגישות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשימוש נרחב כרומטוגרפיה נוזלית הפוך-פאזי (RPLC)-MS לניתוח של חלבונים שלמים8. למרות CZE-MS יש פוטנציאל גדול עבור בקנה מידה גדול מלמעלה פרוטאומיקס, היישום שלה רחב ב פרוטאומיקס יש כבר מובן מספר בעיות, כולל מדגם נמוך-העמסה חלון צר ההפרדה. המדגם טיפוסי טעינת אמצעי אחסון ב- CZE הוא כ 1% מהנפח נימי הכולל, המתאים לרוב פחות מ- 100 nL9,10,11. החלון ההפרדה של CZE הוא בדרך כלל פחות מ 30 דקות בשל9,זרימה (EOF)10electroosmotic חזק. בעיות אלה מגבילות CZE-MS/MS לצורך זיהוי מספר רב של proteoforms ו- proteoforms שופע נמוך מ פרוטאום מורכבים.
הרבה מאמץ כדי לשפר את הדגימה טעינת אמצעי אחסון מהשיטות CZE באמצעות דגימת מקוון ריכוז (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME]12,13, דגימה משופרת שדה הערימה [פס]9 , 11 , 14, ו pH דינמי צומת15,16,17,18). פס ו pH דינמי צומת הם פשוט יותר מאשר SPME, רק לדרוש הבדל משמעותי בין המאגר מדגם BGE את מוליכות, pH. פס מעסיקה מאגר מדגם עם הרבה מוליכות נמוכה יותר מאשר BGE, שמוביל הערמה של analytes על גבול בין אזור הדגימה את אזור BGE נימי. צומת ה-pH דינמי מנצל פקק מדגם בסיסיים (למשל, 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8), של BGE חומצי (למשל, חומצה אצטית 5% [וי/v], pH 2.4) משני הצדדים של התקע הדגימה. בעת יישום של מתח חיובי גבוה בסוף הזרקה נים, טיטור של התקע מדגם basic מתרחש, תוך התמקדות את analytes לתוך פקק חזק לפני שעברו פרידה CZE. לאחרונה, הקבוצה השמש באופן שיטתי לעומת פס ו- pH דינמי צומת על הערימה מקוון של חלבונים שלמים, הפגינו בצומת pH הדינמי הזה יכול להפיק ביצועים טובים הרבה יותר פס עבור ריכוז חלבונים שלמים באינטרנט כאשר האחסון הזרקה מדגם היה 25% הנפח נימי הכולל19.
יש כבר מועסקים ההפרדה נייטרליים מצופה נימים (למשל, לינאריות לזיהוי [LPA]) כדי להפחית EOF ב נימי, מאטים את ההפרדה CZE והרחבת ההפרדה חלון20,21. הקבוצה Dovichi פותח לאחרונה הליך פשוט להכנת ציפוי LPA יציב על הקיר הפנימי של נימים, ניצול קירור (APS) בתור יוזם ומפתח טמפרטורה (50 ° C) ייצור רדיקלים חופשיים, הפילמור22 . ממש לאחרונה, הקבוצה השמש מועסקים נימי ההפרדה מצופים LPA ושיטת צומת pH דינמי עבור CZE הפרדת חלבונים שלמים, להגיע מדגם בקנה מידה microliter טעינת החלון 90-מין הפרדה19ונפח. מערכת זו CZE פותח את הדלת בפני משתמש CZE-MS/MS פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.
CZE-MS דורש ממשק רגיש ועמיד מאוד לזוג CZE ל MS. שלושה ממשקים CE-MS כבר מפותחת היטב ממוסחר בהיסטוריה של CE-MS, והם נדן-זרימה co-צירית ממשק23, הממשק sheathless באמצעות טיפ נקבובי כמו פולט ESI24, ו אלקטרו-kinetically נדן שאוב לזרום ממשק25,26. אלקטרו-kinetically שאוב נדן-ממשק-מבוססות זרימה CZE-MS/MS הגיעה למגבלה9זיהוי פפטיד zeptomole נמוך, ההזדהויות פפטיד מעל 10,000 (IDs) של הלה התא פרוטאום יחיד להפעיל14, אפיון מהר של חלבונים שלמים11ולאחר ניתוחים לשחזור ויציבה מאוד של מולקולות26. לאחרונה, את נימי ההפרדה מצופים LPA השיטה צומת pH דינמי, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב שימשו פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול של פרוטאום Escherichia coli (e. coli)19 ,27. פלטפורמת CZE-MS/MS התקרב יותר מ-500 חתימות proteoform יחיד להפעיל19 ו כמעט 6,000 proteoform מזהים באמצעות מצמד עם גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות)-RPLC fractionation27. התוצאות מראות בבירור את היכולת של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.
במסמך זה, מתואר הליך מפורט של שימוש CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. מערכת CZE-MS/MS מעסיקה את נימי מצופים LPA להפחית EOF בנימי, שיטת צומת pH דינמי עבור ריכוז חלבונים, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב עבור צימוד CZE ל MS, orbitrap מקוון המוני ספקטרומטר עבור האוסף של MS ו- MS/MS ספקטרום של חלבונים ו תוכנת TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform זיהוי ואפיון) עבור מזהה proteoform באמצעות חיפוש במסד הנתונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

אזור נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS) הוכרה ככלי שימושי פרוטאומיקס מלמעלה שמטרתו לאפיין proteoforms ב proteomes מורכבים. עם זאת, היישום של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול לו היה מובן את קיבולת טעינה הדגימה נמוך וצר ההפרדה, חלון CZE. כאן, פרוטוקול מתואר באמצעות CZE-MS/MS עם נפח העמסה מדגם בקנה מידה microliter וחלון הפרדה 90-מין עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. פלטפורמת CZE-MS/MS מתבסס על לינאריות לזיהוי (LPA)-נימי בתזרים electroosmotic נמוך ביותר, שיטה ריכוז מדגם דינאמיים המבוססות על pH-צומת באינטרנט עם יעילות גבוהה של חלבון בערימה, מצופה ההפרדה ממשק זרימה CE-MS נדן שאוב אלקטרו-kinetically עם רגישות גבוהה מאוד, ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים עם גבוה המונית, רזולוציה, מהירות הסריקה. פלטפורמת יכול לשמש האפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון שלם פשוט דוגמאות ואפיון בקנה מידה גדול של proteoforms ב proteomes מורכבים שונים. כדוגמה, הוא הפגין הפרדה יעילה במיוחד של תערובת חלבונים רגיל, של זיהוי רגישה מאוד זיהומים רבים באמצעות הפלטפורמה. כדוגמה נוספת, פלטפורמה זו יכול לייצר מעל 500 proteoform ולהפעיל ההזדהויות חלבון 190 מ פרוטאום Escherichia coli ב יחיד CZE-MS/MS.

איור 1 מציג תרשים של דינאמיות המבוססות על pH-צומת CZE-ESI-MS מערכת המשמשים את הניסוי. פקק ארוך של המדגם במאגר הבסיסי מוזרק מצופים LPA ההפרדה נימי מלא של BGE חומצי. לאחר החלת מתח גבוה I ו- II, analytes באזור הדגימה תהיה מרוכזת באמצעות השיטה צומת pH דינמי. כדי להעריך את ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

שיטה זו יכולה לעזור לשפר את קנה המידה הגדול ואת אפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון isoforms ושינויים חלבון שלאחר תרגום בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזה אזור נימי מציע הפרדה יעילה מאוד וזיהוי רגיש מאוד של חלבונים שלמים. כדי לטפל מראש נימי, לייבש אותו עם גז חנקן ב 10 psi לפחות 12 שעות.לאחר מכן, מלא את נימי עם 50% נפח אחר נפח 3-propyl מתאקרילאט במתנול באמצעות משאבת מזרק. לאטום את שני הקצוות של נימי עם גומי סיליקה. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות לפחות, ממשיכים עם ציפוי פוליאקרילמיד ליניארי על הקיר הפנימי של נימי ההפרדה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לשרוף חלק נימי באמצעות להבה עדינה כדי להסיר את הציפוי החיצוני פוליאמיד סביב ארבעה סנטימטרים מקצה אחד של נימי. לנקות בעדינות את החלק השרוף של נימי על ידי ניגוב כדי להסיר את ציפוי פוליאמיד לחלוטין. לקדוח חור קטן בסוף צינור 200 microliter סביב אותו גודל כמו הקוטר החיצוני נימי מספיק להחזיק את נימי במקום ברגע שהוא מושחל דרך החור הזה.משחילים את קצה נימי הקרוב לחלק השרוף דרך החור עד שהחלק השרוף נמצא בצינור. לאחר מכן, להוסיף כ 150 microliters של HF לצינור 200 microliter כך פתרון HF הוא בערך באמצע הדרך במעלה החלק השרוף על נימי. הדגירה נימי בתספורת HF בטמפרטורת החדר במשך 90 עד 100 דקות.הכינו את תערובת החלבון הסטנדרטית ואת דגימת ה-E.coli כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להגדיר את אלקטרופורזה של אזור נימי, או מערכת CZE, לטעון את המדגם, אלקטרוליט הרקע, ואת נימי ההפרדה לתוך מדגם אוטומטי CZE. בחר עומס לדוגמה בעמוד הבקרה הידני של הדוגמה האוטומטית של CZE.טען את בקבוקון האלקטרוליטים ברקע למגש המאגר של הדוגם האוטומטי, וצוין את מיקומו במגש המאגר. לאחר מכן, טען את בקבוקון הדגימה לתוך מגש הדגימה של הדוגם האוטומטי, ונומקם במיקום שלו במגש לדוגמה. מקם את הדוגמן האוטומטי במיקום היישור באמצעות בקרה ידנית.עכשיו, לטעון את נימי ההפרדה לתוך מדגם אוטומטי CZE באמצעות הקצה הלא חרוט של נימי. התאימו את גובה קצה ההזרקה של נימי אם נפח הדגימה נמוך מ-50 מיקרוליטר. העבר את הדוגמן האוטומטי למצב המתנה באמצעות בקרה ידנית.הקלד את מיקום הדגימה במערכת והזז את נימי לדגימה. לדחוף את קצה ההזרקה של נימי עוד יותר למטה כדי להגיע לתחתית הבקבוקון מדגם. ממשיך להשתמש בשליטה ידנית, לשטוף את נימי עם אלקטרוליט הרקע במשך 20 דקות באמצעות לחץ של 20 psi.עכשיו, תארגן ממשק זרימת נדן מסחרי שאוב אלקטרוקינטית לחזית ספקטרומטר המסה. מלאו את מאגר מאגר הנדן במאגר המכיל מתנול בנפח נפח של 10% וחומצה פורמית בנפח נפח של 0.2% במים ברמה LCMS. לשטוף את T בממשק עם מאגר נדן באמצעות הפעלת לחץ באופן ידני עם מזרק.משחילים את הקצה החיצוני המילימטר אחד של פולט אלקטרוספריי דרך צינורות שרוול ולחבר את המקרן עם יציאה אחת של T באמצעות הולם. כל שעליך לעשות הוא לשטוף את T באופן ידני שוב עם מזרק כדי למלא את המקרן עם מאגר נדן. התאימו את המרחק בין פתח המקרן לבין הכניסה של ספקטרומטר המסה לכ-2 מילימטרים בעזרת המצלמה שהגיעה עם הממשק.החל מתח 2 עד 2.2 קילו-וולט בבקבוקון חיץ הנודנים עבור אלקטרוספריי. לאחר מכן, כוונן את מתח הריסוס כדי להגיע לאלקטרוספריי יציב. החל לחץ נמוך בקצה ההזרקה של נימי במהלך תהליך זה כדי לוודא שאין בועות נימי.מכבים את מתח הריסוס ומשחילים בעדינות את הקצה החרוט של נימי ההפרדה דרך ה- T לתוך המקרן עד שלא ניתן לדחוף אותו עוד יותר. לאחר עצירת הלחץ הנמוך בקצה ההזרקה של נימי, לשטוף את המקרן קצת עם חיץ נדן. שוב, להחיל שניים עד 2.2 קילו-וולט של מתח ספריי כדי לבדוק את התרסיס.בחר שיטה חדשה תחת התפריט הנפתח של הקובץ במסך הכלי הראשי. שם, בחר inlet כמו בקבוקון מדגם מתחיל, סיום בקבוקון מדגם, מגש כמו מדגם, לחץ כמו חמישה psi, kilovolts כאפס, ומשך כמו 95 שניות עבור הזרקת מדגם. לאחר מכן, הגדר את המפץ כ- inlet vial, מגש כחוצץ, לחץ כאפס psi, קילו-וולטים כ- 30 ומשך זמן של 4, 200 שניות להפרדת דגימת תערובת החלבון הסטנדרטית.להפרדת דגימת הפרוטום E.coli, הגדר את המפץ כ- inlet vial, מגש כחוצץ, לחץ כאפס psi, קילו-וולטים כ- 20 ומשך זמן של 6, 600 שניות. לבסוף, בחר inlet כמו סיגלית inlet, מגש כמו חיץ, לחץ כמו 10 psi, קילו-וולטים כמו 30, ומשך כמו 600 שניות עבור שטיפה נימי. עכשיו, להגדיר את הפרמטרים MS ו MS / MS לניתוח חלבון שלם באמצעות ספקטרומטר מסכת מלכודת יון מרובע.כדי לכוונן את הגדרות קובץ הכוונון, הפעל מצב חלבון שלם ולהשתמש בלחץ השמנה של 0.2. הגדר את טמפרטורת נימי העברת היון ל 320 מעלות צלזיוס ואת רמת RF עדשת S ל 55. כדי לבצע את ניסוי CZE MS/MS, הפעל את שיטת איסוף הנתונים במחשב ספקטרומטר המסה, תחילה על-ידי בחירת רצף ריצה.לאחר מכן, התחל את רצף האלקטרופורזה נימי במחשב אלקטרופורזה נימי מדגם אוטומטי. בצע חיפוש במסד נתונים עם TopPIC בחבילת TopPIC ובממשק המשתמש הגרפי TopPIC. לחץ על קובץ מסד הנתונים ובחר מסד נתונים מתאים לחיפוש.לחץ על קובץ ספקטרום ובחר את ms2 שנוצר. msalign קובץ שנוצר כקלט. בחר את קובץ התכונות של MS1 ובחר את קובץ התכונות שנוצר.הגדר ציסטאין קרבמידומטיל C57 כשינוי קבוע עקב טיפול iodoacetamide. בחר את תכונת מסד הנתונים של הפיתיון ותחת הגדרות ניתוק, בחר קצב גילוי כוזב בתפריט הנפתח לצד רמת הספקטרום. הגדר את קצב הגילוי הכוזב ל- 0.01 ברמת הספקטרום.השאר את פונקציית יצירת הפונקציה לא מסומנת והגדר את עמידות השגיאה ל- 15 חלקים למיליון. הגדר את שיעור הגילוי הכוזב ל- 0.05 ברמת הפרוטופורם. תחת פרמטרים מתקדמים, בחר שתיים עבור המספר המרבי של משמרות מסה בתפריט הנפתח.הגדר את התזוזה ההמונית המרבית של שינויים לא ידועים ל- 500 דלתונים. השאר את כל הפרמטרים האחרים בערכי ברירת המחדל שלהם ולחץ על לחצן התחל בפינה השמאלית התחתונה של ממשק המשתמש הגרפי. האלקטרופרוגרמה הייצוגית לתערובת החלבון הסטנדרטית מוצגת.תערובת החלבון הסטנדרטית מופעלת בדרך כלל לפחות בשכפול כדי להעריך את יעילות ההפרדה ואת יכולת הרבייה של המערכת. ניתן להעריך את יעילות ההפרדה עם מספר הלוחות התיאורטיים של חלבונים מסוימים. ניתן להעריך את הרבייה על ידי סטיות התקן היחסיות של עוצמת החלבון וזמן הנדידה.פלטפורמת MS/MS של CZE יכולה לשמש לאפיון בקנה מידה גדול של פרוטאופורמים בפרוטומות מורכבות שונות, זיהוי מעל 500 פרוטאופורמים ו-190 חלבונים מ- E.coli proteome בהפעלה אחת בביטחון גבוה. כאן, תצוגה מוגדלת של האלקטרופרוגרמה יכולה לשמש להערכת חלון ההפרדה של המערכת. ערך E נמוך מאוד רוזוולט ספקטרלי מציע את הביטחון הגבוה של ID.The מספר גבוה של היונים שבר תואם עוד יותר מציין את הביטחון הגבוה של ID.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשחיל את נימי ההפרדה חרוט לתוך פולט electrospray לאט ובעדינות.תיוג איזוטופ יציב או שיטות ללא תווית ניתן לשלב לתוך הליך MS CZE כדי לקבוע כיצד שפע proteoform משתנה בתאים על פני תנאים שונים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטומיקה מלמעלה למטה לחקור את תפקידם של פרוטאופורמים בוויסות תהליכים ביולוגיים שונים בתאים. אל תשכח כי עבודה עם חומצה הידרופלואורית יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי תקין שיש נהלי חירום במקום תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - Native נקה ג&#39;ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...