Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
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저자 친절 하 게 제공 대장균 세포 실험을 위한 미시간 주립 대학, 화학과에서 Heedeok 홍의 그룹을 감사 합니다. 저자 (L. Sun X. Liu)를 일반 의료 과학의 국립 연구소, 국립 보건원의 건강 (NIH) 그랜트 R01GM118470 (X. Liu)을 통해 부여 R01GM125991에서 지원을 감사합니다.

1. 분리 모 세관의 안 벽에 LPA 코팅의 준비
<ol><li>
모 세관의 전처리
	<ol>
<li>1 M 수산화 나트륨, 이온된 수, 1 M 염 산, 이온된 수, 및 LC MS 학년 메탄올 주사기 펌프를 사용 하 여 500 µ L로 연속적으로 용융 실리 카 모 세관 (내경 [아이디], [마약] 외경에서 360 µ m에에서 50 µ m, 길이 120cm) 플러시.</li>
		<li>질소 가스 (≥ 12 h 10 psi) 모 세관을 건조 하 고 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl)는 모 세관 채우기?...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Electrospray+Ionization+Interface+for+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip.">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li><li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis.">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests.">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li><li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry:+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome.">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC+:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions.">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

여기 우리는 간단한 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별 CZE-MS/MS를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. CZE-ESI-MS/MS 시스템의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜에는 4 개의 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 모 세관의 안 벽에 높은-품질 LPA 코팅의 준비는 매우 중요 하다. LPA 코팅 분리 모 세?...

탑-다운 proteomics (TDP) proteoforms는 프로테옴 내 대규모 특성에 대 한 목표로 한다. TDP에 높은 복잡성 때문에 분무 이온화 탠덤 질량 분석 (ESI-MS/MS) 분석 하기 전에 본래 단백질의 효과적인 액체 상 분리 및 프로테옴1,2의 큰 농도 동적 범위 사용 ,3,,45. 모 세관 지역 전기 이동 법 (CZE) 그들의 크기에 충전 비율6에 따라 생체의 분리에 대 한 강력한 기술입니다. CZE만 있는 오픈 관 융합 된 실리 카 모 세관, 배경 전해질 (BGE) 및 전원 공급 장치 요구는 상대적으로 간단 하다. 그대로 단백질의 샘플은 모 세관 압력 또는 전압를 사용 하 여 로드할 수 그리고 분리는 BGE에 모 세관의 양쪽 끝을 immersing 높은 전압을 적용 하 여 시작 됩니다. CZE 매우 높은 분리 효율을 접근할 수 있다 (> 1 백만 이론적 접시) 생체7의 분리에 대 한. CZE MS는 널리 사용 되는 반전 단계 액체 크로마토그래피 (RPLC) 보다 크게 높은 감도-그대로 단백질8의 분석에 대 한 MS. CZE MS 대규모 내려 proteomics에 대 한 큰 잠재력이 있다, 하지만 proteomics에 넓은 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량, 좁은 분리 창 등 여러 문제로 장애가 되어 있다. CZE에 볼륨을 로드 하는 일반적인 샘플은 보통 100 미만 nL9,10,11에 해당 총 모 세관 볼륨의 약 1%입니다. CZE의 분리 창 일반적으로 강한 electroosmotic 교류 (EOF)9,10인 미만 30 분입니다. 이러한 문제는 CZE-MS/MS proteoforms 및 복잡 한 프로테옴에서 낮은 풍부한 proteoforms의 많은 수의 식별에 대 한 제한.
CZE 통해 온라인 샘플 농도 방법 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME]12,13, 필드 강화 된 샘플 스택 [자 백]9 의 볼륨을 로드 하는 예제를 개선 하기 위해 많은 노력이 했다 , 11 , 14, 그리고 동적 pH 접속점15,16,,1718). 자 백 및 동적 pH 접합 SPME만 전도성 및 pH에 샘플 버퍼와는 BGE 사이의 중요 한 차이 요구 보다 간단 하 게 있습니다. 자 백 샘플 영역 및 모 세관에서 BGE 영역 사이 경계에 analytes의 스태킹 이끌어 BGE 보다 훨씬 더 낮은 전도도와 샘플 버퍼를 사용 합니다. 동적 pH 접합 기본적인 샘플 플러그인 (예, 50mm 염화 중 탄산염, pH 8) 샘플 플러그의 양쪽에는 산 성 BGE (예를 들어, [v] 5% 초 산, pH 2.4)을 활용합니다. 모 세관의 주입 후에 높은 긍정적인 전압의 응용 프로그램에 따라 기본적인 샘플 플러그인의 적정, CZE 분리를 겪고 전에 꽉 플러그에는 analytes을 집중 발생 합니다. 최근, 태양 그룹 체계적으로 비교 자 백 및 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 스태킹에 대 한 그 동적 pH 접합 그대로 단백질의 온라인 농도 대 한 자 백 보다 훨씬 더 나은 성능을 생산할 수 있는 시연 때 샘플 주입 볼륨 총 모 세관 볼륨19의 25% 이었다.
중립으로 코팅된 분리 모세 혈관 (예를 들어, 선형 polyacrylamide [LPA])을 줄이기 위해 감속 CZE 분리 하 고 분리 창20,21확대는 모 세관에서 EOF 고용 있다. 최근, Dovichi 그룹 개발, 모세 혈관의 내부 벽에 안정적인 LPA 코팅의 준비에 대 한 간단한 절차 암모늄 persulfate (AP)를 활용 하 여 시작자 및 자유 래 디 칼 생산 및 합22에 대 한 온도 (50 ℃) . 아주 최근에, 태양 그룹 고용 모 세관 LPA 코팅 분리 및 동적 pH 접합 방법 그대로 단백질, CZE 분리에 대 한 로드 볼륨 및 90 분 분리 창19microliter 규모 샘플에 도달. 이 CZE 시스템 대규모 내려 proteomics에 대 한 CZE-MS/MS를 사용 하 여 문을 엽니다.
CZE MS 몇 ms CZE 매우 강력 하 고 중요 한 인터페이스를 필요합니다. 3 CE MS 인터페이스 잘 개발 하 고 상용화 CE-MS의 역사에 있었고 그들은 co-칼 집 기류 인터페이스23, ESI 미터24, 다공성 팁을 사용 하 여 sheathless 인터페이스와 전기 접착 펌핑된 칼 집 인터페이스25,26흐름. 전기 접착 펌핑된 칼 집-흐름-인터페이스 기반 CZE-MS/MS는 낮은 zeptomole 펩 티 드의 탐지 한계9에 도달 했습니다, 그리고 10000 이상의 펩 티 드 식별 (Id)는 헬러에서14, 빠른 특성화를 실행 하는 단일에서 프로테옴 그대로 단백질11, 및 생체26의 매우 안정적이 고 재현 가능한 분석. 최근, LPA 코팅 분리 모 세관, 동적 pH 접합 방법 및 전기 접착 펌핑된 칼 흐름 인터페이스는 대장균 (대장균) 프로테옴19의 대규모 내려 proteomics에 사용 되었다 ,27. CZE-MS/MS 플랫폼 접근 500 proteoform Id19 고 거의 6000 proteoform Id를 통해 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)와 커플링을 실행 하는 단일-RPLC 분별 법27. 결과 명확 하 게 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 기능을 보여준다.
여기, CZE-MS/MS를 사용 하 여 대규모 내려 proteomics에 대 한 자세한 절차는 설명 되어 있습니다. CZE-MS/MS 시스템 사용을 줄이기 위해 모 세관, 단백질, ms, 한 orbitrap CZE 커플링에 대 한 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 인터페이스의 온라인 농도 대 한 동적 pH 접합 방법에에서 EOF LPA 코팅 모 세관 질량 단백질, 및 proteoform ID 통해 데이터베이스 검색에 대 한 TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform 식별 및 특성화) 소프트웨어의 MS 및 MS/MS 스펙트럼의 컬렉션에 대 한 분석기.

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	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS) 복잡 한 proteomes에 proteoforms 하는 것을 목표로 내려 proteomics에 대 한 유용한 도구로 인정 받고 있습니다. 그러나, 대규모 내려 proteomics CZE-MS/MS의 응용 프로그램 낮은 샘플 로드 용량에 의해 장애가 되었습니다 고 분리 창 CZE의 좁은. 여기, 프로토콜 대규모 내려 proteomics microliter 규모 샘플 로드 볼륨과 90 분 분리 창 CZE-MS/MS를 사용 하 여 설명 합니다. CZE-MS/MS 플랫폼 기반으로 선형 polyacrylamide (LPA)-매우 낮은 electroosmotic 교류, 단백질 스태킹에 대 한 높은 효율으로 동적 pH 접합-기반 온라인 샘플 농도 방법으로 모 세관 코팅된 분리는 펌핑된 운동 전기 칼 흐름 CE MS 인터페이스 매우 높은 감도 높은 이온 트랩 질량 분석기 대량 해상도 스캔 속도. 플랫폼은 간단한 그대로 단백질 샘플의 고해상도 특성화 및 다양 한 복잡 한 proteomes에서 proteoforms의 대규모 특성에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 단백질 혼합물의 고효율 분리 및 플랫폼을 사용 하 여 많은 불순물의 매우 민감한 검출은 설명 했다. 또 다른 예로,이 플랫폼은 500 proteoform를 생성할 수 있습니다 하 고 단일 CZE-MS/MS에는 대장균 의 프로테옴에서 190 단백질 식별 실행 합니다.

그림 1 실험에 사용 된 동적 pH 접합-기반 CZE-ESI-MS 시스템의 다이어그램을 보여 줍니다. 기본 버퍼에서 샘플의 긴 플러그는 LPA 코팅 분리 모세는 산 성 BGE 가득에 주입 됩니다. 높은 전압을 적용 한 후 I 및 II, analytes 샘플 영역에 집중을 통해 동적 pH 접합 방법 있을 것입니다. CZE MS 시스템의 성능을 평가 하는 표준 단백질 혼합물 (시 토 크롬 c, lyso...

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Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

이 방법은 세포에서 단백질 동소 형태 및 단백질 번역 후 변형의 대규모 및 고해상도 특성화를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모세관 영역 전기 포근 질량 분석법이 손상되지 않은 단백질의 매우 효율적인 분리 및 매우 민감한 검출을 제공한다는 것입니다. 모세관을 미리 치료하려면 질소 가스로 10 psi에서 적어도 12 시간 동안 건조하십시오.그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 메탄올에서 50% 볼륨당 3-프로필 메타크릴레이트로 모세관을 채우게 한다. 실리카 고무로 모세관의 양쪽 끝을 밀봉하십시오. 적어도 24시간 동안 실온에서 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 분리 모세관의 내벽에 선형 폴리아크릴아미드 코팅을 계속한다.모세관의 한쪽 끝에서 약 4센티미터 떨어진 폴리아미드 외부 코팅을 제거하기 위해 부드러운 화염을 사용하여 모세관의 일부를 구울 수 있습니다. 폴리아미드 코팅을 완전히 제거하기 위해 닦아 모세관의 탄 부분을 부드럽게 청소하십시오. 이 구멍을 통해 나사로 연결되면 모세관을 충분히 제자리에 고정하기 위해 모세관 외량과 동일한 크기의 200 마이크로리터 튜브의 끝에 작은 구멍을 뚫습니다.연소된 부분이 튜브에 들어갈 때까지 구멍을 통해 번트 부분에 가까운 모세관의 끝을 실어냅니다. 이어서, HF 용액이 모세혈관상탄부분의 절반 정도되도록 200 마이크로리터 튜브에 HF약 150마이크로리터를 첨가한다. HF 용액의 모세관을 실온에서 90~100분 동안 배양한다.텍스트 프로토콜에 설명된 표준 단백질 혼합물 및 대장균 샘플을 준비한다. 모세관 영역 전기 포근 또는 CZE 시스템을 설정하려면 샘플, 배경 전해질 및 분리 모세관을 CZE 자동 샘플러로 로드합니다. CZE 자동 샘플러의 수동 제어 페이지에서 샘플 부하를 선택합니다.백그라운드 전해질 바이알을 자동 샘플러의 버퍼 트레이에 로드하여 버퍼 트레이의 위치를 지정합니다. 그런 다음 샘플 유리병을 자동 샘플러의 샘플 트레이에 로드하여 샘플 트레이의 위치를 지적합니다. 수동 제어를 사용하여 자동 샘플러를 정렬 위치에 배치합니다.이제 모세관의 비에칭 된 끝을 사용하여 분리 모세관을 CZE 자동 샘플러에 적재합니다. 샘플 부피가 50 마이크로리터보다 낮은 경우 모세관의 주입 끝의 높이를 조정합니다. 수동 제어를 사용하여 자동 샘플러를 대기로 전환합니다.시스템에 샘플 위치를 입력하고 모세관을 샘플로 이동합니다. 모세관의 주입 끝을 더 아래로 밀어 샘플 유리병의 바닥에 도달합니다. 수동 제어를 계속 사용하여 20 psi의 압력을 사용하여 20 분 동안 배경 전해질로 모세관을 플러시하십시오.이제 상업용 전기학적으로 펌핑된 칼집 흐름 인터페이스를 질량 분광계 의 전면에 장착합니다. 칼집 버퍼 저장소를 LCMS 급 물에서 10% 볼륨 볼륨 메탄올 및 0.2% 부피 포름산을 함유한 버퍼로 채웁니다. 주사기로 수동으로 압력을 가하여 시스 버퍼로 인터페이스에서 T를 플러시합니다.슬리브 튜브를 통해 전기 스프레이 방출기의 1밀리미터 외부 직경 끝을 스레드하고 피팅을 통해 T의 한 포트와 방출기연결합니다. 주사기로 T를 수동으로 플러시하기만 하면 방사체를 칼집 버퍼로 채우기만 하면 됩니다. 인터페이스와 함께 제공 된 카메라의 도움으로 약 2 밀리미터에 방출기의 오리피스와 질량 분광계의 입구 사이의 거리를 조정합니다.전기 스프레이용 칼집 완충 유리병에 2~2.2킬로볼트 전압을 적용합니다. 그런 다음 스프레이 전압을 조정하여 안정적인 전기 스프레이에 도달합니다. 모세관에 거품이 없는지 확인하기 위해 이 과정에서 모세관의 주입 끝에 저압을 적용하십시오.스프레이 전압을 끄고 분리 모세관의 에칭 끝을 T를 통해 방출기에 부드럽게 스레드하여 더 밀수 없을 때까지. 모세관의 주입 끝에서 저압을 중지 한 후, 칼집 버퍼로 방출기를 조금 플러시. 다시, 스프레이 전압의 2 ~ 2.2 킬로볼트를 적용하여 스프레이를 테스트합니다.기본 계측기 화면의 파일 드롭다운 메뉴 에서 새 메서드를 선택합니다. 거기에서, 시료 유리병을 시작, 샘플 유리병으로 끝, 샘플 바이알로 트레이, 5 psi로 압력, 0으로 킬로볼트, 샘플 주입을위한 95 초로 지속 시간으로 입구를 선택합니다. 이어서, 입구를 입구 바이알로, 트레이를 완충제로, 압력제로, 압력은 제로 psi로, 킬로볼트는 30으로, 표준 단백질 혼합물 샘플의 분리를 위해 4, 200초로 지속한다.대장균 프로테오메 시료의 분리를 위해 입구 바이알, 트레이를 완충제로, 압력제로, 킬로볼트는 20초, 지속 시간을 6, 600초로 설정한다. 마지막으로 입구 바이알, 트레이를 버퍼로, 압력은 10psi, 킬로볼트를 30초로, 모세관 플러싱의 경우 600초로 선택합니다. 이제 4중 이온 트랩 마스크 분광계를 사용하여 손상되지 않은 단백질 분석을 위해 MS 및 MS/MS 매개변수를 설정합니다.튜닝 파일 설정을 조정하려면 그대로 단백질 모드를 켜고 0.2의 트래핑 압력을 사용합니다. 이온 이송 모세관 온도를 섭씨 320도, S 렌즈 RF 레벨을 55도로 설정합니다. CZE MS/MS 실험을 수행하려면 먼저 실행 시퀀스를 선택하여 질량 분광계 컴퓨터에서 데이터 수집 방법을 시작합니다.이어서, 모세관 전기포레시스 자동 시퀀스를 모세관 전기지질 자동 시료 컴퓨터에서 시작한다. TopPIC 제품군과 TopPIC 그래픽 사용자 인터페이스에서 TopPIC를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행합니다. 데이터베이스 파일을 클릭하고 검색에 적합한 데이터베이스를 선택합니다.스펙트럼 파일을 클릭하고 생성된 ms2를 선택합니다. 입력으로 생성된 msalign 파일입니다. MS1 피처 파일을 선택하고 생성된 피쳐 파일을 선택합니다.시스테인 카르바미도메틸 C57을 요도아세타미드 처리로 인한 고정 변형으로 설정한다. 미끼 데이터베이스 기능을 선택하고 차단 설정 에서 스펙트럼 수준 옆에 있는 드롭다운 메뉴에서 잘못된 검색률을 선택합니다. 스펙트럼 수준에서 잘못된 검색 속도를 0.01로 설정합니다.생성 함수를 선택 취소하고 오류 허용 오차를 백만 개당 15개 부품으로 설정합니다. 프로테오폼 수준에서 잘못된 검색 률을 0.05로 설정합니다. 고급 매개 변수에서 드롭다운 메뉴의 최대 질량 이동 수에 대해 두 개를 선택합니다.알 수 없는 수정의 최대 질량 이동을 500 달톤으로 설정합니다. 다른 모든 매개 변수를 기본 값에 두고 그래픽 사용자 인터페이스의 오른쪽 하단에 있는 시작 단추를 클릭합니다. 표준 단백질 혼합물에 대한 대표적인 전기페로그램이 도시된다.표준 단백질 혼합물은 전형적으로 시스템의 분리 효율 및 재현성을 평가하기 위해 적어도 복제하여 실행된다. 분리 효율은 일부 단백질의 이론적 플레이트 수로 평가될 수 있다. 재현성은 단백질 강도 및 이동 시간의 상대적 표준 편차에 의해 평가될 수 있다.CZE MS/MS 플랫폼은 다양한 복합 프로테오옴에서 프로테오폼의 대규모 특성화에 사용될 수 있으며, 높은 확신을 가진 단일 실행에서 대장균 프로테오메에서 500개 이상의 프로테오폼과 190가지 단백질을 식별합니다. 여기서, 전기페로그램의 확대된 보기를 사용하여 시스템의 분리 창을 평가할 수 있다. 매우 낮은 E-값 및 스펙트럼 FDR은 프로테오폼 ID의 높은 자신감을 시사합니다.일치하는 조각 이온의 높은 수는 ID의 높은 자신감을 더 나타냅니다.이 절차를 시도하는 동안 에칭 분리 모세관을 전자 스프레이 방출기로 천천히 부드럽게 스레드하는 것이 중요합니다.안정적인 동위원소 라벨링 또는 라벨프리 메서드는 CZE MS 절차에 통합되어 다양한 조건에서 세포에서 프로테오폼 풍부가 어떻게 변하는지 확인할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 세포에 있는 각종 생물학 프로세스를 통제에 있는 proteoforms의 역할을 탐구하기 위하여 하향식 proteomics의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 수력 불소산과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취하고 이 절차를 수행 할 때 비상 절차를 밟아야한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

연구

화학

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

고 분해능 질량 분석을 결합 하는 보조 Nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간 호흡 분석

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

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단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

철 레독스 종(Fe(II), Fe(III)의 정량화를 위한 모세관 전기포고증-유도 결합된 혈장 질량 분광법(CE-ICP-MS)의 설정

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

나노 물질에 의해 획득 된 단백질과 대사 산물 코로나특성화를위한 모세관 전기 전구 질량 분광법 접근법

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

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MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...