Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Yazarlar Heedeok Hong'un grubu Michigan State University, Kimya Bölümü, nazikçe Escherichia coli hücreleri deneyler için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar genel tıbbi Bilimler Ulusal Enstitüsü, ulusal kurumları sağlık (NIH) Grant R01GM118470 (için X. Liu) ve Grant R01GM125991 destek (L. güneş ve X. Liu için) teşekkür ederiz.

1. ayrılık kılcal iç duvarında LPA kaplama hazırlanması
<ol><li>
Kılcal Önarıtma
	<ol>
<li>Erimiş silis kılcal (120 cm uzunluğunda, 50 µm iç çapı [kimlik], dış çapı [doz] 360 µm) art arda 500 µL 1 M sodyum hidroksit, deiyonize su, 1 M hidroklorik asit, deiyonize su ve bir şırınga pompa kullanarak LC-MS sınıf metanol ile yıkayın.</li>
		<li>Azot Gazı (10 PSI, ≥ 12 h) ile kılcal kuru ve kılcal (v/v) 3-(trimethoxysilyl) % 50 ile doldurmak propil metakrilat bir şırınga...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Electrospray+Ionization+Interface+for+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip.">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li><li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis.">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests.">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li><li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry:+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome.">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC+:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions.">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

Burada CZE-MS/MS proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Bir diyagramı CZE-ESI-MS/MS sisteminin Şekil 1' de gösterilen. İletişim kuralında dört kritik adım vardır. İlk olarak, yüksek kaliteli LPA kaplama kapiller ayrılması iç duvarda hazırlanması son derece önemlidir. Bir LPA kaplı ayrılık kılcal ...

Proteoforms bir Proteom içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) amaçlamaktadır. TDP electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (ESI-MS/MS) analizi yüksek karmaşıklık nedeniyle daha önce olduğu gibi proteinler etkili sıvı faz ayrılması ve büyük konsantrasyon Proteom1,2 dinamik aralığını kullanır ,3,4,5. Kapiller bölge Elektroforez (CZE) üzerinde onların boyutu ücret oranları6dayalı biomolecules ayrılması için güçlü bir tekniktir. CZE nispeten yalnızca bir açık borulu erimiş silis kapiller, bir arka plan elektrolit (BGE) ve bir güç kaynağı gerektiren basittir. Bir örnek olduğu gibi proteinlerin kapiller basınç veya gerilim kullanarak yüklenebilir ve ayırma her iki ucunda da BGE kılcal çeker ve bir yüksek gerilim uygulayarak başlatılır. CZE Ultra yüksek ayırma verimliliği yaklaşım (> 1 milyon teorik plakaları) biomolecules7ayrılması için. CZE-MS vardır büyük ölçüde daha yüksek bir hassasiyet daha yaygın olarak kullanılan ters fazlı sıvı kromatografi (RPLL)-analizi için MS sağlam proteinler8. CZE-MS büyük ölçekli tepeden proteomik için büyük bir potansiyele sahip olsa da, proteomik geniş kendi uygulamasında bir düşük örnek yükleme kapasitesi ve dar ayrılık pencere de dahil olmak üzere birkaç sorunu tarafından engellemiştir. Yükleme hacmi CZE içinde tipik örneğidir genellikle 100 nL9,10' a,11karşılık gelen toplam kapiller hacmi yaklaşık % 1. CZE ayrılık pencere genellikle az 30 dk güçlü electroosmotic akışı (EOF)9,10nedeniyle var. Bu sorunlar CZE-MS/MS çok sayıda proteoforms ve karmaşık bir Proteom üzerinden düşük bol proteoforms tanımlanması için sınırlayın.
Yükleme hacmi CZE üzerinden online örnek toplama yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME]12,13, örnek alan Gelişmiş yığın [FESS]9 örnek geliştirmek için çok çaba yapıldığı yeri , 11 , 14ve dinamik pH kavşak15,16,17,18). FESS ve dinamik pH kavşak SPME, sadece örnek arabellek ve BGE arasında önemli bir fark iletkenlik ve pH gerektiren daha basit. FESS analitler örnek bölge ve kılcal BGE bölgesinde arasındaki sınır üzerinde istifleme için önde gelen BGE daha fazla düşük iletkenlik ile bir örnek arabelleği kullanır. Dinamik pH kavşak bir temel örnek fiş (Örneğin, 50 mM Amonyum Bikarbonat, pH 8) ve örnek tak her iki tarafında asidik bir BGE (Örneğin, [v/v] % 5 asetik asit, pH 2.4) kullanır. Kılcal enjeksiyon sonunda yüksek pozitif gerilim başvuru üzerine, titrasyon temel örnek fiş, CZE ayrılık geçiyor önce sıkı bir fiş analitler odaklanan oluşur. Son zamanlarda, Güneş Grup sistematik FESS ve dinamik pH kavşak online olduğu gibi proteinlerin istifleme için bu dinamik pH kavşak üretmek FESS sağlam proteinler çevrimiçi konsantrasyon için daha çok iyi performans gösteren göre ne zaman numune enjeksiyon hacmi toplam kılcal birim%1925'i oldu.
Yansıtmaya kaplamalı ayrılık kılcal damarlar (Örneğin, doğrusal polyacrylamide [LPA]) CZE ayrılık yavaş ve ayrılık pencere20,21genişletme EOF kılcal içinde azaltmak için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda, Dovichi grup kılcal damarlar, iç duvar üzerinde istikrarlı LPA kaplama hazırlanması için basit bir prosedür amonyum Persülfat (APS) kullanan Başlatıcı ve serbest radikal üretimi ve polimerizasyon22 için sıcaklık (50 ° C) olarak geliştirilen . Çok yakın zamanda, Güneş grup yükleme birimi ve bir 90 dk ayrılık pencere19microliter-ölçek örnek ulaşan LPA kaplı ayrılık kapiller ve dinamik pH kavşak yöntemi olduğu gibi proteinlerin CZE ayrılması için istihdam. Bu CZE sistemini CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanarak için kapıyı açar.
CZE-MS Çift CZE MS için son derece sağlam ve hassas bir arayüzü gerektirmektedir. Üç CE-MS arabirimi de gelişmiş ve CE-MS tarihinde ticari olmuştur, ve onlar koaksiyel kılıf-akış arabirimi23, gözenekli bahşiş ESI emitör24, kullanarak sheathless arayüzü ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi25,26. Elektro-kinetically pompalanan kılıf-akış arabirimi-tabanlı CZE-MS/MS düşük zeptomole peptid algılama sınırı9ulaştı, 10.000'den fazla peptid tanımlamaları (IDS) üzerinden HeLa Proteom14, hızlı bir karakterizasyonu çalıştırmak tek bir hücre sağlam proteinler11ve son derece istikrarlı ve tekrarlanabilir analizleri biomolecules26. Son zamanlarda, ayrılık LPA kaplı kılcal, dinamik pH kavşak yöntemi ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi bir Escherichia coli (e.coli) Proteom19 büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılan ,27. 500'den fazla proteoform kimlikleri tek bir19 ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) ile kaplin yaklaşık 6.000 proteoform kimlikleri üzerinden çalıştırmak CZE-MS/MS platform yaklaştı-RPLL ayırma27. Sonuçlar açıkça CZE-MS/MS yeteneği için büyük ölçekli tepeden proteomik gösterir.
Burada, CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanmanın ayrıntılı bir yordam açıklanır. CZE-MS/MS sistem EOF kılcal, proteinler, MS, bir orbitrap CZE kaplin için elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi çevrimiçi konsantrasyon için dinamik pH kavşak yöntemi içinde azaltmak için LPA kaplı kılcal istihdam kitle Spektrometre proteinlerin ve proteoform kimliği ile veritabanı arama için a sendelemek (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform kimlik ve karakterizasyonu) bilgisayar yazılımı MS ve MS/MS spectra koleksiyonu için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

Kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) karmaşık proteomes proteoforms karakterize amaçlamaktadır tepeden proteomik için yararlı bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, CZE-MS/MS uygulama için büyük ölçekli tepeden proteomik düşük örnek yükleme kapasitesi ile engelledi ve CZE ayrılık pencere dar. Burada, bir protokol CZE-MS/MS microliter ölçekli örnek yükleme hacmi ve bir 90 dk ayrılık pencere ile büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılarak açıklanmıştır. Bir doğrusal polyacrylamide (LPA) tabanlı CZE-MS/MS platformu-kaplamalı ayırma ile son derece düşük electroosmotic akışı, protein istifleme, pH-kavşak tabanlı dinamik online örneği konsantrasyon yöntemi yüksek verimlilik ile kılcal bir Elektro-kinetically pompalanan kılıf akışı CE-MS arayüzü ile son derece yüksek hassasiyet ve bir iyon kapanı kütle spektrometre ile yüksek çözünürlük kitle ve hız tarayın. Platform, basit sağlam protein örnekleri yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms çeşitli karmaşık proteomes içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir. Örneğin, bir standart protein karışımı son derece verimli bir ayrılması ve son derece hassas bir platform kullanılarak birçok yabancı maddelerin tespiti gösterilmiştir. Başka bir örnek olarak, bu platform 500'den fazla proteoform üretebilir ve 190 protein tanımlamaları bir Escherichia coli Proteom bir tek CZE-MS/MS üzerinden çalıştırın.

Şekil 1 bir diyagram deneyde kullanılan dinamik pH Kavşağı-tabanlı sisteminin CZE-ESI-MS gösterir. Temel bir arabellek örnekte uzun bir fiş bir asidik BGE ile dolu bir LPA kaplı ayrılık kılcal damar içine enjekte edilir. Yüksek voltaj uygulandıktan sonra ı ve II, örnek bölge içindeki analitler konsantre yolu ile dinamik pH kavşak yöntemi olacaktır. CZE-MS sistem performansını değerlendirmek için bir standart protein karış...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Bu yöntem, hücrelerde protein izoformlarının ve protein post-translational değişikliklerinin büyük ölçekli ve yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunun geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kılcal bölge elektroforez kütle spektrometresi yüksek verimli ayırma ve bozulmamış proteinlerin son derece hassas tespiti sunuyor olmasıdır. Kılcal damarı önceden tedavi etmek için, en az 12 saat boyunca 10 psi azot gazı ile kurulayın.Sonra, bir şırınga pompası kullanarak metanol% 50 hacim-by-volume 3-propil metakrilat ile kılcal doldurun. Kılcal damarın her iki ucunu silika kauçukla kapatın. En az 24 saat oda sıcaklığında kuluçkadan sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi ayırma kılcal iç duvarında doğrusal poliakrilamid kaplama ile devam edin.Kapiller bir ucundan yaklaşık dört santimetre uzaklıkta poliamid dış kaplama kaldırmak için nazik bir alev kullanarak kapiller bir kısmını yakmak. Poliamid kaplamayı tamamen çıkarmak için silerek kılcal damarın yanmış kısmını nazikçe temizleyin. Bu delikten geçirildikten sonra kılcal damarı yeterince yerinde tutmak için kılcal dış çapile aynı boyutta 200 mikrolitrelik bir tüpün ucunda küçük bir delik aç.Yanmış kısmı tüpiçinde olana kadar yanmış kısmına yakın olan kılcal damarın ucunu delikten geçirin. Daha sonra, 200 mikrolitrelik tüpe yaklaşık 150 mikrolitre HF ekleyin, böylece HF çözeltisi kılcal damardaki yanmış kısmın yarısına kadar dır. HF çözeltisindeki kılcal damarı oda sıcaklığında 90-100 dakika kuluçkaya yatırın.Metin protokolünde açıklandığı gibi standart protein karışımını ve E.coli örneğini hazırlayın. Kapiller bölge elektroforezini veya CZE sistemini kurmak için numuneyi, arka plan elektrolitini ve ayırma kılcal damarını CZE otomatik örnekleyicisine yükleyin. CZE otomatik örnekleyicinin manuel kontrol sayfasında örnek yükü seçin.Arka plandaki elektrolit şişesini otomatik numunenin tampon tepsisine yükleyin ve tampon tepsideki konumunu belirtin. Daha sonra, numune şişesini örnek tepsideki konumunu belirterek, oto örnekleyicinin numune tepsisine yükleyin. Manuel kontrolü kullanarak otomatik örnekleyiciyi hizalama konumuna getirin.Şimdi, kapiller olmayan kazınması ucunu kullanarak CZE otomatik örnekleyici içine ayırma kapiller yükleyin. Numune hacmi 50 mikrolitreden düşükse kılcal damarın enjeksiyon ucunun yüksekliğini ayarlayın. Manuel kontrolü kullanarak otomatik örnekleyiciyi beklemeye geçin.Sisteme örnek konumunu yazın ve kılcal damarı numuneye taşıyın. Örnek şişenin altına ulaşmak için kılcal damarın enjeksiyon ucunu daha da aşağı doğru itin. Manuel kontrolü kullanmaya devam ederek, 20 psi basınç kullanarak 20 dakika arka plan elektroliti ile kılcal yıkama.Şimdi, kütle spektrometresinin önüne elektrokinetik olarak pompalanmış bir kılıf akış arabirimi monte edin. Kılıf tampon haznesini LCMS dereceli suda %10 hacimli metanol ve %0,2 hacim hacmi formik asit içeren bir tamponla doldurun. Bir şırınga ile manuel basınç uygulayarak kılıf tampon ile arayüz Içinde T Flush.Bir elektrosprey yayıcının bir milimetre dış çapıucunu bir kollu borudan geçirin ve yayıcıyı bir montaj yoluyla T'nin bir portuile bağlayın. Yayıcıyı kılıf tamponuyla doldurmak için T'yi bir şırınga ile tekrar elle yıkamanız yeterlidir. Arabirimle birlikte gelen kamera yardımı ile yayımlayıcının deliği ile kütle spektrometresinin girişi arasındaki mesafeyi yaklaşık iki milimetreye ayarlayın.Elektrosprey için kılıf tampon şişesine 2 ila 2,2 kilovolt voltaj uygulayın. Daha sonra, kararlı bir elektrosprey ulaşmak için sprey voltajı ayarlayın. Bu işlem sırasında kılcal damarda kabarcık olmadığından emin olmak için kılcal damarın enjeksiyon ucunda düşük basınç uygulayın.Püskürtme gerilimini kapatın ve ayırma kılcal damarının kazınmış ucunu t yayıcısı niçin daha fazla itilene kadar hafifçe geçirin. Kılcal damar enjeksiyon ucunda düşük basınç durduktan sonra, kılıf tampon ile emitter biraz floş. Yine, sprey test etmek için sprey voltaj 2 ila 2,2 kilovolt uygulayın.Ana enstrüman ekranındaki dosya açılır menüsü altında yeni bir yöntem seçin. Burada, başlangıç numunesi şişesi, bitirme numune şişesi, numune olarak tepsi, beş psi olarak basınç, sıfır olarak kilovolt ve numune enjeksiyonu için 95 saniye olarak giriş seçeneğini belirleyin. Daha sonra giriş şişesi, arabellek olarak tepsi, sıfır psi olarak basınç, 30 olarak kilovolt ve standart protein karışımı örneğinin ayrılması için 4, 200 saniye olarak süresi ayarlayın.E.coli proteome numunesinin ayrılması için giriş şişesi, arabellek olarak tepsi, sıfır psi olarak basınç, 20 olarak kilovolt ve 6,600 saniye olarak süresi ayarlayın. Son olarak, giriş şişesi olarak giriş, tampon olarak tepsi, 10 psi olarak basınç, 30 olarak kilovolt ve kapiller kızarma için 600 saniye olarak süresi seçin. Şimdi, dört iyon tuzak maskesi spektrometresi kullanarak bozulmamış protein analizi için MS ve MS/MS parametrelerini hazırla.Ayar dosyası ayarlarını ayarlamak için bozulmamış protein modunu açın ve 0,2'lik bir bindirme basıncı kullanın. Iyon transfer kapiller sıcaklığını 320 santigrat dereceye, S-lens RF seviyesini ise 55 dereceye ayarlayın. CZE MS/MS denemesini gerçekleştirmek için, önce çalıştırma sırasını seçerek kütle spektrometre bilgisayarında veri toplama yöntemini başlatın.Daha sonra, kapiller elektroforez otomatik örnekleyici bilgisayarda kapiller elektroforez dizisini başlatın. TopPIC paketinde ve TopPIC grafik kullanıcı arabiriminde TopPIC ile veritabanı araması yapın. Veritabanı dosyasına tıklayın ve arama için uygun bir veritabanı seçin.Spektrum dosyasına tıklayın ve oluşturulan ms2'yi seçin. giriş olarak oluşturulan msalign dosya. MS1 özellik dosyasını seçin ve oluşturulan özellik dosyasını seçin.Set sistein karbamidomethyl C57 sabit bir değişiklik iodoacetamide tedavisi nedeniyle. Yem veritabanı özelliğini seçin ve kesme ayarlarının altında, spektrum düzeyinin yanındaki açılır menüde yanlış bulma oranını seçin. Yanlış bulma oranını spektrum düzeyinde 0,01 olarak ayarlayın.Oluşturma işlevini seçilmeden bırakın ve hata toleransını milyonda 15 parçaya ayarlayın. Yanlış bulma oranını proteoform düzeyinde 0,05 olarak ayarlayın. Gelişmiş parametreler altında, açılır menüdeki maksimum kütle kayması sayısı için iki sini seçin.Bilinmeyen modifikasyonların maksimum kütle değişimini 500 dalton'a ayarlayın. Diğer tüm parametreleri varsayılan değerlerine bırakın ve grafik kullanıcı arabiriminin sağ alt kısmındaki başlat düğmesini tıklatın. Standart protein karışımı için temsili elektropherogram gösterilir.Standart protein karışımı genellikle ayırma verimliliği ve sistemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için en az yinelenen çalıştırılır. Ayırma verimi bazı proteinlerin teorik plaka sayısı ile değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik protein yoğunluğu ve göç süresinin göreceli standart sapmaları ile değerlendirilebilir.CZE MS/MS platformu, çeşitli kompleks proteomlarda proteoformların büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir ve yüksek güven le tek bir çalıştırmada bir E.coli proteomdan 500'den fazla proteoform ve 190 protein tanımlanır. Burada, elektropherogram görünümünde yakınlaştırılmış bir sistemin ayırma penceresi değerlendirmek için kullanılabilir. Çok düşük E-değeri ve spektral FDR proteoform ID.The matched parça iyonlarının yüksek sayıda daha fazla ID'nin yüksek güven gösterir.Bu yordamı çalışırken, yavaş ve yavaşça içine kazınmış ayırma kılcal iplik hatırlamak önemlidir.Kararlı izotop etiketleme veya etiketsiz yöntemler çeşitli koşullar arasında hücrelerde proteoform bolluk değişiklikleri belirlemek için CZE MS yordamı dahil edilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra yukarıdan aşağıya proteomik alanında araştırmacıların hücrelerdeki çeşitli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde proteoformların rollerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Hidroflorik asitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun kişisel koruyucu ekipman ve acil durum prosedürlerinin uygulanması gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

İkincil Nanoelectrospray iyonlaşma kullanarak gerçek zamanlı nefes analiz için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi birleştiğinde

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...