Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
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该项目得到了医学研究理事会、欧洲联盟 "地平线 2020" 研究和创新方案 (第669 5551 号赠款协议) 下的欧洲研究理事会和剑桥国家卫生研究所的资助。与国家医疗服务体系血液和移植系统 (nhsbt) 合作, 在剑桥大学器官捐献和移植方面设立生物医学研究中心和 nih 血液和移植研究小组 (nihr btru)。所表达的观点是作者的观点, 不一定是国家医疗服务体系、国家人权研究所、卫生部或 nhsbt 的观点。

1. dna 的制备和电镀
<ol><li>使用分光光度法或荧光仪器准确量化 gdna 浓度。</li>
	<li>在96井深井板上稀释 dna 至4μμl。包括至少一个具有已知副本编号和一个非模板控件的控制 gdna 样本。</li>
	<li>以 450 x g 离心96孔板 2分钟. </li>
	<li>使用液体处理仪器, 将每个样品中的四聚一式贴在384井 qpcr 板上, 使每口井都有10纳克的 dna (2.5μl·井)。准备至少 10个384个井板, 每个 qkat 反应一个。</li>
	<li>如果从一个96孔以上的板中提取 gdna, 请使用2% 的漂白剂和超纯水进行全体积清洗, 以清洁每个96孔板之间的液体处理系统的针头。</li>
	<li>在室温下将384个井板在干净的地方孵育至少 24小时, 从而将 dna 风干。</li>
</ol>2. 底漆和探针的制备
注: qkat 由10个多重反应组成。每个反应包括三个引物对和三个荧光标记探针, 专门放大两个kir基因和一个参考基因。对在江泽民等人的第27号文件中公布的探针进行了修改, 使寡核苷酸现在被标记为 atto 染料, 因为它们提供了更好的光稳定性和较长的信号寿命。预报价底漆组合可在市场上获得 (见材料表)。
<ol><li>根据表 1中给出的稀释量, 为每个反应准备引物组合。</li>
	<li>根据表1为每个反应准备探头组合。在进行组合之前, 请先测试每个探头。</li>
</ol>3. 主混料的制备
注:下面提到的卷用于在一组 10倍384孔板上执行一个 qkat 反应。
<ol><li>确保在384个油井板上镀金的 gdna 样本完全干燥。在冰上执行所有步骤, 并尽可能防止试剂暴露在光线下, 因为荧光标记的探头是光和热敏感的。</li>
	<li>在4°c 下对 qpcr 缓冲液、底漆和探针进行除霜。</li>
	<li>在冰上, 通过添加18.86 毫升的超纯水、20毫升的 qpcr 缓冲液、1, 000μl 的预熟引物组合和180μl 的预制备探针组合, 制备 10x 384 孔板的主混合物 (表 2)。</li>
	<li>使用多通道移液器将主混料均匀地分布在96深的井板上, 将415μl 移液入每口井。把这个盘子放在一个被光线遮挡的冰盒里。</li>
	<li>使用液体处理仪器, 将主混合物的9.5μl 分配到384个井板的每口井中, 并将其干燥。用铝箔密封盘子, 并立即将其放置在4°c。对剩余的板材重复此过程, 确保液体处理系统的针头在每个板材之间用水清洗。</li>
	<li>以 450 x 克离心384孔板, 以 450 x 克离心 3分钟, 并在4°c 下隔夜或6-12小时之间孵育, 以重新悬浮 dna 并驱散任何气泡。</li>
</ol>4. qpcr 检测
<ol><li>经过隔夜孵化后, 离心机以 450 x g的速度进行3分钟的工作, 以驱散任何剩余的气泡。</li>
	<li>为了实现自动化, 请将 qpcr 机器 (例如, light cycler 480) 连接到微板处理程序 (请参见材料表)。对微板处理程序进行编程, 使其从可防止光线照射的冷却存储基座放入 qpcr 机器。 注意 从理论上讲, 该检测应在具有兼容光学设置的其他 qpcr 机器上工作。</li>
	<li>使用以下循环条件: 95°c 5分钟, 然后40个周期 95°c 15秒, 66°c, 数据收集在66°c。</li>
	<li>一旦运行完成, 让机器人从 qpcr 机器收集板, 并将其放置在丢弃的码头。</li>
</ol>5. 运行后分析
<ol><li>扩增后, 按照以下步骤, 使用 qpcr 机器软件的二阶导数最大值法或 "拟合点" 方法 (参见材料表) 计算定量周期 (cq) 值。</li>
	<li>打开 qpcr 软件, 然后在 "导航"选项卡中, 打开一个板的保存反应实验文件。</li>
	<li>
对于使用二阶导数最大值方法进行分析, 请选择 "分析" 选项卡, 然后使用 abs quant/第二个导数最大值方法创建新的分析。
	<ol>
<li>在 "创建新的分析" 窗口中, 选择分析类型: abs quant/j3vert倒数 max 方法, 子集:所有示例, 程序: 放大, 名称: Rx-DFO (其中x是反应编号). </li>
		<li>选择滤光片, 然后选择vicx\ hex/yl5055 (533-580)。这可确保选择为 stat6收集的数据。</li>
		<li>选择VIC/HEX/Yellow555(533-580)的颜色补偿.单击 "计算"。对 fam (465-510) 和 Cy5/Cy5.5(618-660 重复此操作)。单击 "保存文件"。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
对于使用 "拟合点" 方法进行分析, 请在 "分析" 选项卡中选择 "abs quant/fit 点"。
	<ol>
<li>在 "创建新的分析" 窗口中, 选择分析类型: abs quant-fitt 方法, 子集:所有示例, 程序: 放大, 名称: RxF-DFO (其中x是反应编号)。</li>
		<li>为stat6和每个kir基因 (famcy5) 选择正确的过滤器和颜色补偿。在 " noiseband " 选项卡中, 设置噪声带以排除背景噪声。</li>
		<li>在 "分析" 选项卡中, 将适合点设置为 3 , 然后选择 "显示适合点"。单击 "计算"。单击 "保存文件"。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 结果的导出
<ol><li>在 qpcr 软件中, 打开"导航器" 选项卡. 选择"结果批量导出"。</li>
	<li>打开保存实验文件的文件夹, 并将文件传输到窗口的右侧部分。单击"下一步"。选择导出文件的名称和位置。</li>
	<li>选择分析类型abs quant\ 第二个导数最大方法或abs quant\ fit 点。单击"下一步"。检查文件的名称、导出文件夹和分析类型是否正确, 然后单击"下一步"开始导出过程。</li>
	<li>等待, 直到导出状态确定.屏幕将自动移动到下一步。检查所有选定的文件是否已成功导出, 以便失败的文件数 = 0。单击"完成"。</li>
	<li>使用脚本拆分 _ file. pl 和 roche2sds. pl 将导出的板拆分为每个板块的单独反应。 注意 脚本在请求/github 上提供。</li>
</ol>7. 复制编号计算
<ol><li>打开拷贝数分析软件 (例如, 复制来电显示器)。选择"导入实时 pcr 结果文件"并加载由roche2sds. pl 创建的文本文件。</li>
	<li>选择"分析" 并进行分析, 方法是选择具有已知复制编号的校准器样品, 或者选择最常见的复制编号.有关通常在欧洲起源人群中观察到的最常见的 kir基因拷贝数, 请参见表 5 。</li>
</ol>8. 数据质量检查
<ol><li>KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 使用 r 脚本。r将所有印版中的复制数字数据合并到电子表格中。 注意 脚本在请求/github 上提供。</li>
	<li>对不符合kir基因已知链接不平衡 (ld) 的样品的拷贝数分析软件上的原始数据进行重新检查 (表 6)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

我们描述了一种新的半自动高通量方法, 称为 qkat, 它有利于kir基因的拷贝数分型.与 ssp-pcr 等传统方法相比, 该方法是一种改进, 后者是低吞吐量的, 只能表明这些高度多态性基因的存在或不存在。
所获得的拷贝数数据的准确性取决于多种因素, 包括 gdna 样品的质量和浓度均匀性以及试剂的质量。板上 gdna 样本的质量和准确性极其重要, 因为板上浓度的变化会导致复制编号的计算错误。由于检测是使用欧洲来源的样本集进行验证的, 来自世界其他地区的队列数据需要进行更彻底的检查。这是为了确保等位基因丢失或非特异性引物探针绑定的情况不会被误解为拷贝数的变化。
虽然检测的设计和优化是为了以高通量的方式运行, 但可以对其进行修改, 以运行较少的示例。在分析较少的样本时, 复制数量分析软件中的置信度指标会受到影响, 但如果在平板上包含具有已知kir基因复制号的控制基因组 dna 样本, 并且在平板上包含额外的样本复制, 则可以改进这种情况。包括。
对于没有液体/板处理机器人的实验室, 可以使用多通道移液器进行主混料, 也可以手动将板材加载到 qpcr 仪器中。
开发 qkat 的主要目的是创建一种简单、高吞吐量、高分辨率和具有成本效益的方法, 用于疾病关联研究的基因型 kir 。这是成功地实现的, 因为 qkat 已被用于调查kir的作用, 在几个大型疾病协会研究, 包括一系列传染病, 自身免疫性条件, 和妊娠疾病4,24,25,26岁

在人类中, 杀手免疫球蛋白样受体 (kir) 位点被映射在白细胞受体复合体 (lrc) 内19号染色体的长臂上。这个位点的长度约为 150 kb, 包括从尾部排列的 15个kb基因。目前已知的kir位点是kr2dl1, kir2dl2/kir2dl3, KIR2DL1,kir2dl5a, KIR2DL1, kir3dl1/kir3ds1 , KIR3DL1, 和两个伪基因, kir2dp1和kir3dp1。kir基因编码二维 (2d) 和三维 (3d) 免疫球蛋白样域受体, 具有短 (s; 激活) 或长 (l; 抑制) 细胞质尾, 由自然杀伤细胞和 t 亚群表达细胞。在 kir位点中表现出的拷贝数变异形成了基因含量可变的不同单倍型。非等位基因同源重组 (nahr), 由紧密的头尾基因排列和高序列同源性促成, 是提出的负责单倍型变异的机制。据报道, 全世界1、2、3、4的人群中有100多个不同的单倍型。所有这些单倍型可分为两大组: a 和 b 单倍型。a 单倍型包含 7个kir基因: kir3dl3、 kir2dl1、 KIR2DL1、 kr2dl4、KIR3DL3和KIR3DL3, 它们是抑制kir 基因和激活 kir 的基因基因 kir2ds4。然而, 多达70% 的欧洲起源的个体谁是纯合为 kir 单倍型 a 完全携带一个非功能的 "删除" 形式的kir2ds45,6。所有其他kir基因组合形成 b 组单倍型, 包括至少一个特定的kir基因kir2ds1, kir2ds2, kir2ds3, kr2ds5, kir3ds1, kir2dl2, 和kir2dl5, 通常包括两个或多个激活kir基因。
hla i 类分子已被确定为某些抑制受体 (kir2dl1、 KIR2DL1、 kr2dl3和kir3dl1) 的配体, 激活受体 (kr2ds1、 KIR2DL1、KIR2DL1、 kir2ds5和kl3ds1), 以及kir2dl4,这是一个独特的kir , 包含一个长的细胞质尾巴, 像其他抑制 kir 受体, 但也有一个带正电的残留附近的细胞外域, 这是一个常见的其他激活kir受体的特征。kir 基因和 hla 基因中的变异组合影响受体配体相互作用, 在个体7,8水平上塑造潜在的 nk 细胞反应能力。基因关联研究的证据表明, kir在病毒抗性 (例如人体免疫缺陷病毒 [hiv] 9 和丙型肝炎病毒 [hcv]10 ) 中发挥着重要作用, 移植的成功11、妊娠期疾病的风险和生殖成功12,13, 防止异基因造血干细胞移植 (hsct)后复发14, 15, 1 6日, 癌症风险17日。
高序列同源性以及等位基因和单倍型多样性的结合对准确基因分型kir基因的任务提出了挑战。kir 基因类型的传统方法包括序列特异性引物 (ssp) 聚合酶链反应 (pcr)18、19、20、序列特异性寡核苷酸探针 (ssop) pcr21, 以及矩阵辅助激光解吸电离-飞行质谱法 (aldi-tof ms)的时间22。这些技术的缺点是, 他们只提供部分洞察个人的基因型, 同时也是费力的执行。最近, 下一代测序 (ngs) 被特别应用于kir位点的类型。虽然此方法非常强大, 但运行成本可能很高, 并且进行深入分析和数据检查非常耗时。
qkat 是一种高通量定量 pcr 方法。虽然传统的方法是费力和耗时的, 这种方法可以运行近 1, 000个基因组 dna (gdna) 样本在五天内, 并给出kir基因型, 以及基因复制的数字。qkat 由10个多重反应组成, 每个反应的目标是两个kir位点和一个用于kir基因副本编号23的基因组 (stat6) 中固定拷贝数的参考基因.该检测方法已成功地应用于涉及大量人口面板和疾病队列的研究, 涉及传染性疾病, 如 hcv、1型糖尿病等自身免疫性疾病和先兆子宫炎等妊娠疾病, 并提供了遗传研究的基础, 旨在了解 nk 细胞功能1,4,24,25,26。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

杀手细胞免疫球蛋白样受体 (kir) 是一组抑制和激活免疫受体, 对自然杀伤细胞 (nk) 和 t 细胞, 编码的多态性基因群在染色体19。他们最典型的配体是人类白细胞抗原 (hla) 分子, 这些分子被编码在6号染色体上的主要组织相容性复合体 (mhc) 位点内。有大量证据表明, 它们在免疫、生殖和移植中发挥着重要作用, 因此拥有能够准确对它们进行基因型的技术至关重要。然而, 高序列同源性, 以及等位基因和拷贝数的变化, 使得很难设计出能够准确和有效地基因型所有kir基因的方法。传统方法在获得的数据的分辨率、吞吐量、成本效益以及设置和运行实验所需的时间方面通常受到限制。我们描述了一种称为定量kir半自动分型 (qkat) 的方法, 这是一种高通量多重实时聚合酶链反应方法, 可以确定kir位点中所有基因的基因复制数。qkat 是一种简单的高吞吐量方法, 可以提供高分辨率的 kir拷贝数数据, 可进一步用于推断包含这些数据的结构多态型单倍型中的变化。这个拷贝数和单倍型数据可以有利于研究大规模疾病关联、群体遗传学, 以及调查 kir和hla之间的表达和功能相互作用。

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qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qkat: 杀手细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

定量杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (kir) 半自动分型 (qkat) 是一种简单、高通量、经济高效的方法, 用于复制数字型kir基因, 用于人群和疾病关联研究。

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

此方法可以回答有关NK细胞受体遗传学的关键问题，如单体型多样性，以及这与疾病的关系。此方法的可视化演示将有助于在实验室中设置协议，包括自动化过程和数据分析。这种技术的主要优点是，与传统方法不同，qKAT代表定量KIR自动打字，是高通量，它提供基因拷贝数。qKAT 可以提供对疾病关联的认识。这项技术对艾滋病毒和丙型肝炎、癌症、干细胞移植和妊娠疾病等病毒感染的治疗可能有用。qKAT还可用于研究种群遗传学，以及探索KIR和HLA分子之间的表达和功能相互作用。qKAT由10种多路复用反应组成，这些反应特别针对两个KIR基因和一个参考基因的外向。在此协议中，特定底基因被设计为检测给定基因的等位基因，PCR结果在短孔中。在此之后，使用双标记特定水解探头实时监控 PCR 扩增。拷贝数分析使用目标KIR基因的相对定量来参考基因。qKAT 被设计并设置为高通量技术。因此，每种反应都可以在1000个样本上进行。以下步骤显示了每个 96 井 DNA 板的制备和电镀所涉及的步骤。首先，在量化DNA后，稀释96井深井板中的DNA。至少包括一个包含已知副本编号的控件示例和一个非模板控件。以 450 gs 离心板两分钟。然后，将四分之一酸的每个样品分配到 384 孔 qPCR 板中。之后，在室温下将DNA在清洁区域干燥24小时。要为 10 个 384 孔板设置一个 qKAT 反应，首先在 4 摄氏度下解冻 qPCR 缓冲液、引头和探针等分。根据文本协议在冰上准备主混合。然后，使用多通道移液器将主混合均匀地分布到 96 井深井板上。将主的 9.5 微升与干燥的 gDNA 样品混合到板的每个井中。在此之后，用铝箔密封板，并立即将其存放在摄氏四度。如果点胶主混合在多个 384 井 DNA 板上，请记住进行短水洗涤以清洁液体处理系统的针头。将板与gDNA样品在450克离心3分钟。然后，在4摄氏度下孵育板，以重新消耗DNA并消散任何气泡。孵育板过夜后，重复离心以消散任何气泡。然后，将板放在冷却的存储坞中。将 qPCR 机器连接到微孔板处理程序。然后，根据文本协议对微孔板处理程序进行编程。运行完成后，让机器人从 qPCR 机器收集板并将其放在丢弃的扩展坞中。完成放大后，打开 qPCR 软件。在"导航器"选项卡下，打开已保存的板的反应实验文件。接下来，打开"创建新分析"窗口，为第二个派生 Max 方法选择适当的设置。然后选择"滤芯"，确保为 STAT6 收集的数据被选中。选择适当的颜色补偿。单击"计算"，然后单击"保存文件"。要使用拟合点方法分析数据，请打开"创建新分析"窗口，然后为"拟合点"方法选择适当的设置。然后，为 STAT6 选择正确的滤镜和颜色补偿。设置杂色带以排除背景杂色。在此之后，打开"分析"选项卡，将拟合点设置为三个，然后选择"显示拟合点"。保存更改并重复与适合点的适当设置和 KIR 基因的第二个衍生分析的步骤。打开 qPCR 软件中的"导航器"选项卡，然后选择结果批处理导出。然后，打开包含实验文件的文件夹，然后将它们传输到窗口的右侧。单击"下一步"，然后选择导出文件的名称和位置。在此之后，选择兴趣的分析类型，然后单击"下一步"。在单击"下一步"开始导出过程之前，请确保文件、导出文件夹和分析类型的名称正确。当导出状态更改为"确定"时，屏幕将自动移动到下一步。确保所有选定的文件已成功导出，然后单击"完成"。然后使用文本协议中的脚本将导出的板拆分为单个反应，并将文件转换为可通过复制编号分析软件可读的软件。接下来，打开复制编号分析软件并选择导入实时 PCR 结果文件以加载脚本创建的文本文件。最后，选择"分析"，然后通过选择最频繁的样本拷贝编号进行分析。在此协议中，半自动键入或 qKAT 用于复制数字类型 KIR 基因。KIR2DL4 最常见的副本编号是两个副本，而 KIR3DS1 最常见的副本编号为零。在尝试此程序时，确保精确量化DNA、执行冰上的所有步骤以及确保试剂被光覆盖是极其重要的。对于不符合 KIR 基因已知 LD 规则的样本，对原始数据进行彻底检查也很重要。按照这个程序，可以执行其他方法，如测序，以回答其他问题，例如，融合基因的存在，或新的等位基因的识别。该方法开发后，为免疫遗传学领域的研究人员探索KIR在NK细胞生物学、抗病性和人类生殖中的作用铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

诱导体细胞行业分析（ISSA）的为研究木材形成和二次开发茎相关基因和推动者使用

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

科研

遗传学

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

在小鼠心脏rAAV9的制备过表达或敲除基因

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

肽衍生的方法在运输跨越植物细胞的基因和蛋白质和细胞器障碍

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

用GFP标记TMEM184A构建肝素受体身份确认

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

目标<em&gt;原位</em&gt;组蛋白突变的基因在芽殖酵母

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

使用定量实时PCR检测大鼠腹膜中的微小RNA表达

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

昆虫细胞 (sf9) 外源基因在蛋白质功能检测中的瞬态表达

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

血栓烷 A2 受体基因 C924T 多态性的研究方法

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

用于评估肿瘤细胞中的微RNA水平、功能和相关靶基因的体外协议

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

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在Vivo前向遗传屏幕识别新的神经保护基因在果蝇黑色素

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...