Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

Het project kreeg financiële steun van de medische Raad voor onderzoek (MRC), de European Research Council (ERC) kader van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (grant overeenkomst nr. 695551) en het National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedische Research Centre en NIH onderzoek bloed en transplantatie Research Unit (NIHR BTRU) in het gebied van orgaandonatie en -transplantatie aan de Universiteit van Cambridge en in partnerschap met de NHS bloed en transplantatie (NHSBT). De standpunten zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR, het ministerie van volksgezondheid of de NHSBT.

1. voorbereiding en Plating uit DNA
<ol><li>De concentratie van de gDNA met behulp van een spectrofotometrische of fluorimetrische instrument nauwkeurig te kwantificeren.</li>
	<li>Verdun DNA tot 4 ng/µL op een diep-well 96-wells-plaat. Omvatten ten minste één controlemonster gDNA met een bekende exemplaaraantal en één niet-sjabloon controle.</li>
	<li>Centrifugeer de 96-wells-platen bij 450 x g gedurende 2 min.</li>
	<li>Elk monster in viervoud op 384-well qPCR platen met behulp van een instrument van liquid handling, afzien, zodat elke goed heeft 10 ng van DNA (2,5 µL per putje). Ten minste tien 384-Wells-platen, één voor elke qKAT reactie voor te bereiden.</li>
	<li>Als gDNA is wordt afgezien van meer dan één 96-wells-plaat, voert u een volledige volumes wassen met 2% bleekwater en ultrazuiver water te reinigen van de naalden van de vloeistof handling systeem tussen elke 96-wells-plaat van gDNA monsters.</li>
	<li>Het DNA door het broeden van de 384-Wells-platen in een schone omgeving bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur drogen.</li>
</ol>2. voorbereiding van de Primers en sondes
Opmerking: qKAT bestaat uit tien multiplex reacties. Elke reactie omvat drie primerparen en drie fluorescentie-geëtiketteerden sondes die twee KIR genen en één verwijzing gene specifiek te versterken. De sondes die werden gepubliceerd in Jiang et al.27 werden gewijzigd zodat de oligonucleotides worden nu aangeduid met ATTO kleurstoffen aangezien zij verbeterde fotostabiliteit en lange signaal levensduur bieden. Pre-aliquoted primer combinaties zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Bereiden primer combinaties voor elke reactie volgens de verdunningen gegeven in tabel 1.</li>
	<li>Bereiden sonde combinaties voor elke reactie volgens tabel 1. Elke afzonderlijke sonde alvorens de combinatie test.</li>
</ol>3. voorbereiding van de Master-Mix
Opmerking De volumes die hieronder vermeld zijn voor het uitvoeren van een qKAT reactie op een set van 10 x 384-Wells-platen.
<ol><li>Ervoor zorgen dat de gDNA monsters op de 384-Wells-platen verzinkt volledig droog. Uitvoeren van alle stappen op het ijs en houden de reagentia gedekt door blootstelling aan licht zoveel mogelijk aangezien de fluorescentie-geëtiketteerden sondes en thermo-lichtgevoelig.</li>
	<li>Ontdooi de qPCR buffer, primer en sonde aliquots bij 4 ° C.</li>
	<li>Op het ijs, voorbereiden op een master mix 10 x 384-Wells-platen door toevoeging van 18.86 mL ultrazuiver water, 20 mL qPCR buffer en 1.000 µL van vraag primer combinatie 180 µL van vraag sonde combinatie (tabel 2).</li>
	<li>De master mix gelijkmatig verdelen over een goed 96-diep bord met behulp van een precisiepipet meerkanaals, pipetting 415 µL in elk putje. Houd deze plaat in een koelbox gedekt door licht.</li>
	<li>Met behulp van een instrument van liquid handling, afzien 9,5 µL van de master mix in elk putje van de plaat 384-well met gedroogde gDNA. Afdichting van de plaat met een folie en plaatst u deze onmiddellijk bij 4 ° C. Herhaal dit proces voor de resterende platen, ervoor te zorgen dat de naalden van de vloeistof handling systeem worden gewassen met water tussen elke plaat.</li>
	<li>Centrifugeer de 384-Wells-platen bij 450 x g gedurende 3 min en incubeer hen bij 4 ° C's nachts of tussen 6-12 h resuspendeer de DNA en eventuele luchtbellen te verdrijven.</li>
</ol>4. qPCR Assay
<ol><li>Na de overnachting incubatie, centrifugeer bij 450 x g gedurende 3 minuten te verdrijven van eventuele resterende luchtbellen.</li>
	<li>Voor de toepassing van de automatisering, verbinden de qPCR machine (b.v., LightCycler 480) een microplate-handler (Zie Tabel van materialen). Programma de microplate-handler de platen in de machine van de qPCR van een gekoelde opslag dok dat is beschermd tegen licht plaatsen. Opmerking de testen moeten, in theorie, werken op andere qPCR machines met compatibele optische instellingen.</li>
	<li>De volgende fietsen gebruiksvoorwaarden: 95 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 66 ° C gedurende 50 s, met het verzamelen van de gegevens bij 66 ° C.</li>
	<li>Zodra de run voltooid is, hebben de robot verzamelen de plaat van de qPCR machine en plaats deze in het Gooi-dock.</li>
</ol>5. na uitvoering analyse
<ol><li>Na versterking, het berekenen van de kwantificering cyclus (Cq) waarden met behulp van de tweede afgeleide maximale methode of de methode van Fit-punten met de software van de qPCR machine (Zie Tabel of Materials), de onderstaande stappen.</li>
	<li>Open de software van de qPCR en open het bestand experiment opgeslagen reactie voor één plaat in het tabblad Navigator .</li>
	<li>
Voor de analyse met behulp van de tweede afgeleide maximale methode, selecteer het tabblad analyse en maken een nieuwe analyse methode Abs Quant/Second derivaat Max.
	<ol>
<li>Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Second derivaat Max methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: Rx-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).</li>
		<li>Selecteer Filter kam en kies van VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dit zorgt ervoor dat de verzamelde gegevens voor STAT6 is geselecteerd.</li>
		<li>Selecteer kleur compensatie voor VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klik op berekenen. Herhaal dit voor Fam (465-510) en Cy5/Cy5.5(618-660). Klik op bestand opslaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor de analyse met behulp van de methode van Fit-punten, door Abs Quant/Fit punten te selecteren op het tabblad analyse.
	<ol>
<li>Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Fit punten methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: RxF-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).</li>
		<li>Selecteer de juiste filters en kleur compensaties voor de STAT6 en elk van de KIR genen (Fam/Cy5). Stel in het tabblad Noiseband de lawaai-band uit te sluiten van de achtergrondgeluiden.</li>
		<li>In het tabblad analyse de fit punten ingesteld op 3 en selecteer dat Toon past punten. Klik op berekenen. Klik op bestand opslaan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. de uitvoer van de resultaten
<ol><li>In de qPCR-software, open de Navigator tab. Selecteer Resultaten Batch exporteren.</li>
	<li>Open de map waarin de bestanden van het experiment worden opgeslagen en de bestanden overbrengen naar de sectie van de rechterkant van het venster. Klik op volgende. Selecteer de naam en de locatie voor het exportbestand.</li>
	<li>Selecteer het soort analyse Abs Quant/Second derivaat Max methode of Abs Quant/Fit punten. Klik op volgende. Controleer of de naam van het bestand, de map exporteren en het soort analyse correct zijn en klik op volgende om te beginnen het exportproces.</li>
	<li>Wacht totdat het Exporteren Status Ok is. Het scherm gaat automatisch naar de volgende stap. Controleer dat alle geselecteerde bestanden met succes zijn uitgevoerd zodat het aantal bestanden mislukt = 0. Klik op gereed.</li>
	<li>Gebruik scripts split_file.pl en roche2sds.pl de geëxporteerde platen gesplitst individuele reacties voor elke plaat. Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.</li>
</ol>7. Kopieer numerieke berekeningen
<ol><li>Open de kopie nummer analysesoftware (bijvoorbeeld CopyCaller). Selecteer real-time PCR importeren bestand met resultaten en laden van tekstbestanden die zijn gemaakt door roche2sds.pl.</li>
	<li>Selecteer analyseren en uitvoeren van de analyse door beide selecteren kalibrator monster met bekende exemplaaraantal of door het selecteren van de meest voorkomende exemplaaraantal. Zie tabel 5 voor de meest voorkomende exemplaaraantal van KIR genen meestal waargenomen in Europese oorsprong populaties.</li>
</ol>8.-kwaliteit van de gegevens controleert
<ol><li>R script KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 gebruiken. R gegevens wilt combineren kopie nummer uit alle platen in een spreadsheet. Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.</li>
	<li>Controleer opnieuw de onbewerkte gegevens op de kopie nummer-analysesoftware voor monsters die niet aan de bekende koppeling onevenwicht (LD) voor KIR genen (tabel 6 voldoen).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschreven een nieuwe semi-automatische high-throughput methode, genaamd qKAT, dat vergemakkelijkt het nummer typen van het exemplaar van KIR genen. De methode is een verbetering ten opzichte conventionele methoden zoals SSP-PCR, die laag-doorvoer en kunnen alleen wijzen op de aanwezigheid of afwezigheid van deze zeer polymorfe genen.
De juistheid van de verkregen kopie aantal gegevens is afhankelijk van meerdere factoren, met inbegrip van de kwaliteit en concentratie-uniformiteit van de gDNA monsters en de kwaliteit van de reagentia. De kwaliteit en nauwkeurigheid van de gDNA monsters over een plaat zijn uitermate belangrijk, aangezien verschillen in concentratie over de plaat in fouten in de berekening van het exemplaaraantal resulteren kunnen. Aangezien de testen zijn gevalideerd met behulp van Europese oorsprong sample sets, vereisen gegevens van cohorten uit andere delen van de wereld meer grondige controles. Dit is om ervoor te zorgen dat instanties van allel dropout of aspecifieke primer/sonde bindende kopie nummer variatie niet worden geïnterpreteerd.
Terwijl de tests werden ontworpen en geoptimaliseerd voor het uitvoeren als high-throughput, kunnen ze worden gewijzigd voor het uitvoeren van minder monsters. De metriek van het vertrouwen in de kopie nummer analysesoftware wordt beïnvloed als minder monsters te analyseren, maar dit kan worden verbeterd als besturingselement genomic DNA-monsters met een bekende KIR gene exemplaaraantal zijn opgenomen op de plaat en extra monster wordt gerepliceerd zijn opgenomen.
Voor laboratoria zonder vloeistof/plaat-handling-robots, master mix kan worden afgezien van elke gebruik van meerkanaals pipetten en platen handmatig in het qPCR-instrument kunnen worden geladen.
Het voornaamste doel achter de ontwikkeling van qKAT was om een eenvoudige, hoge-doorvoer, met een hoge resolutie en kosteneffectieve methode om genotype KIRs voor ziekte vereniging studies. Dit werd met succes bereikt aangezien qKAT is werkzaam bij het onderzoeken van de rol van KIR in verschillende grote ziekte vereniging studies, met inbegrip van een aantal infectieziekten, auto-immune voorwaarden en zwangerschap stoornissen4, 24 , 25 , 26.

Bij de mens, de moordenaar immunoglobuline-achtig receptor(KIR) locus is toegewezen op de lange arm van chromosoom 19 binnen de leukocyten receptor complex (LRC). Deze locus is ongeveer 150 kb in lengte en omvat 15 KIR genen gerangschikt hoofd-tot-staart. De KIR loci die momenteel bekend zijn zijn KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, en twee pseudogenes, KIR2DP1 en KIR3DP1. De KIR genen coderen voor tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) domein van de immunoglobuline-achtige receptoren met korte (S; activeren) of lange (L; remmende) cytoplasmatische staarten, die zijn uitgedrukt door natural killer (NK) cellen en deelverzamelingen van T cellen. Kopie nummer variatie tentoongesteld in de KIR locus vormen diverse haplotypes met de inhoud van de variabele gen1. Non-allèlique homologe recombinatie (NAHR), vergemakkelijkt door een nauwe hoofd-tot-staart gene regeling en hoge-sequence homologie, is het mechanisme voorgesteld dat de variabiliteit van de haplotypic wordt belast. Meer dan 100 verschillende haplotypes zijn gemeld in populaties wereldwijd1,,2,,3,4. Alle deze haplotypes kunnen worden onderverdeeld in twee grote groepen: A en B haplotypes. De A-haplotype bevat 7 KIR genen: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1en KIR3DL2, die remmende KIR genen en de activerende KIR zijn gen KIR2DS4. Echter tot 70% van Europese oorsprong personen die homozygoot voor KIR haplotype A uitsluitend voeren een vorm van niet-functionele "verwijdering" van KIR2DS45,6. Alle andere KIR gene combinaties vormen groep B haplotypes, met inbegrip van ten minste één van de specifieke genen van KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, en KIR2DL5, en bevatten meestal twee of meer activerende KIR -genen.
HLA klasse I moleculen zijn geïdentificeerd als de liganden voor bepaalde receptoren van inhiberende (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3en KIR3DL1), activerende receptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, en KIR3DS1), en voor KIR2DL4, die een unieke KIR die bevat een lange cytoplasmatische staarten als andere remmende KIR-receptoren maar heeft ook een positief geladen residu in de buurt van de extracellulaire domein, dat een gemeenschappelijk is functie van andere activerend KIR -receptoren. De combinatie van varianten binnen de KIR genen en de HLA-genen invloeden receptor-ligand interactie die vormen potentiële NK cel reactievermogen in het individuele niveau7,-8. Bewijs van genetische vereniging studies heeft aangegeven dat KIR speelt een rol in virale weerstand (bijvoorbeeld., humaan immunodeficiëntie virus [HIV]9 en hepatitis C virus [HCV]10), het succes van transplantatie 11, het risico op zwangerschap stoornissen en reproductieve succes12,13, de bescherming tegen terugval na Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (HSCT)14,15, 16, en het risico van kanker17.
De combinatie van hoge-sequence homologie, allèlique en haplotypic verscheidenheid presenteert uitdagingen in de taak van nauwkeurig genotypering KIR genen. Conventionele methoden typt KIR genen omvatten sequentie-specifieke primer (SSP) polymerase kettingreactie (PCR)18,19,20, reeks-specifieke oligonucleotide probe (SSOP) PCR21, en matrix geassisteerde laser desorptie ionisatie-time van de vlucht de Spectrometrie van de massa (MALDI-TOF MS)22. De nadelen van deze technieken zijn dat ze alleen gedeeltelijke inzicht geven in het genotype van een individu terwijl ook moeizaam om uit te voeren. Volgende-generatie sequencing (NGS) is onlangs de KIR locus specifiek typt u toegepast. Terwijl deze methode zeer krachtig is, kan het duur om uit te voeren, en het is tijdrovend diepgaande analyse en data controles te verrichten.
qKAT is een high-throughput kwantitatieve PCR methode. Terwijl conventionele methoden moeizaam en tijdrovend zijn, deze methode maakt het mogelijk in te voeren bijna 1.000 genomic DNA (gDNA)-monsters vijf dagen en geeft het genotype KIR , evenals de gene exemplaaraantal. qKAT bestaat uit tien multiplex reacties, die elk twee KIR loci richt en één gen van de verwijzing van een vaste exemplaaraantal in het genoom (STAT6) gebruikt voor relatieve kwantificering van het gen KIR kopiëren nummer23. Deze bepaling is met succes gebruikt in studies waarbij grote populatie panelen en ziekte cohorten op infectieziekten zoals HCV, auto-immune aandoeningen zoals type 1 diabetes, en zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie, evenals het verstrekken van een genetische onderbouwing aan studies gericht op het begrijpen van de NK-cel functie1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

Killer cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIRs) zijn een reeks van remmende en activerend immuun receptoren, natural killer (NK) en T-cellen, gecodeerd door een polymorfe cluster van genen op het chromosoom 19. Hun best gekarakteriseerd liganden zijn de menselijke leukocyten antigeen (HLA) moleculen die zijn gecodeerd in de grote histocompatibility complex (MHC) locus op chromosoom 6. Er is aanzienlijk bewijs dat ze een belangrijke rol in de immuniteit, de voortplanting, en de transplantatie spelen, waardoor het cruciale technieken die nauwkeurig genotype kunnen hebben hen. Echter hoge-sequence homologie, zo goed als allèlique en kopie nummer variatie, maken het moeilijk tot ontwerpmethoden die nauwkeurig kunnen en efficiënt genotype alle KIR genen. Traditionele methoden zijn meestal beperkt in de resolutie van gegevens die zijn verkregen, doorvoer, kosteneffectiviteit en de termijnen voor het instellen en uitvoeren van de experimenten. Beschrijven we een methode genaamd kwantitatieve KIR semi-geautomatiseerde te typen (qKAT), die is een high-throughput multiplex real-time polymerase kettingreactie methode die de gene kopie nummers van alle genen in de KIR locus kunt bepalen. qKAT is een eenvoudige high-throughput methode die hoge resolutie KIR nummer gegevens kopiëren, die verder kan worden gebruikt voor het afleiden van de variaties in het structureel polymorfe haplotypes die omvatten van hen kan bieden. Deze kopie nummer en haplotype gegevens kan goed zijn voor studies over grootschalige ziekte verenigingen, populatie genetica, evenals onderzoek naar expressie en functionele interacties tussen KIR en HLA.

Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen

Kwantitatieve killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIR) semi-automatische te typen (qKAT) is een eenvoudige high-throughput en kosteneffectieve methode kopiëren nummer type KIR genen voor hun toepassing in de bevolking en ziekte vereniging studies.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen over NK celreceptorgenetica zoals haplotypediversiteit en hoe dit zich verhoudt tot ziekte. Visuele demonstratie van deze methode zal helpen om het protocol in uw laboratorium in te stellen, inclusief het automatiseringsproces en data-analyse. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat qKAT, in tegenstelling tot conventionele methoden, staat voor kwantitatieve KIR geautomatiseerde typen, een hoge doorvoer is en het genexemplaarnummer biedt.qKAT kan inzicht geven in de associatie van ziekten. De implicaties van deze techniek kunnen nuttig zijn voor therapie voor virale infecties zoals HIV en hepatitis C, bij kanker, bij stamceltransplantatie en zwangerschapsstoornissen. qKAT kan ook worden toegepast bij het bestuderen van populatiegenetica en het verkennen van expressie en functionele interacties tussen KIR- en HLA-moleculen.qKAT bestaat uit 10 multiplexreacties die specifiek gericht zijn op exonen van de twee KIR-genen en één referentiegen. In dit protocol zijn specifieke primers ontworpen om de allelen van het gegeven gen en PCR-resultaten in korte amplicons te detecteren. Hierna worden tweegelabelde specifieke hydrolysesondes gebruikt om de PCR-versterking in realtime te monitoren.Copy number analyse maakt gebruik van relatieve kwantificering van de doel KIR genen om een referentie gen. qKAT is ontworpen en opgezet om een hoge doorvoertechniek te zijn. Vandaar dat elke reactie kan worden uitgevoerd op iets minder dan 1.000 monsters.De volgende stappen tonen de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding en beplating van elke 96-put DNA-plaat. Om te beginnen, na het kwantificeren van DNA, verdun het DNA in een 96-goed diep-goed plaat. Neem ten minste één besturingselementvoorbeeld op met een bekend kopienummer en één niet-sjabloonbesturingselement.Centrifuge de plaat op 450 gs gedurende twee minuten. Dan, doe elk monster in viervoudige in 384-well qPCR platen. Daarna droogt de lucht het DNA 24 uur lang op kamertemperatuur in een schone ruimte.Om één qKAT-reactie op te zetten voor 10 384-putplaten, ontdooit u eerst eerst de qPCR-buffer, primer en sonde aliquots bij vier graden Celsius. Bereid de master mix op ijs volgens het tekstprotocol. Gebruik vervolgens een multi-channel pipet om de master mix gelijkmatig over een 96-well deep-well plaat te verdelen.Doe 9,5 microliter van de master mix in elke put van de plaat met de gedroogde gDNA monsters. Sluit hierna de plaat af met folie en bewaar deze onmiddellijk op vier graden Celsius. Vergeet niet om een korte waterwas uit te voeren om de naalden van de vloeibare handling systeem schoon te maken als het afgeven van master mix op meer dan een 384-well DNA-plaat.Centrifugeren de plaat met de gDNA monsters op 450 gs gedurende drie minuten. Vervolgens, incubeer de plaat op 4 graden Celsius om het DNA opnieuw op te zetten en alle luchtbellen te verdrijven. Na het uitbroeden van de plaat 's nachts, herhaal de centrifugatie om eventuele luchtbellen te verdrijven.Plaats vervolgens de plaat in het gekoelde opslagdok. Sluit de qPCR-machine aan op een microplate-handler. Programmeer vervolgens de microplate-handler volgens het tekstprotocol.Zodra de run is voltooid, laat de robot de plaat van de qPCR-machine verzamelen en in het teruggooidok plaatsen. Na het voltooien van de versterking, open de qPCR software. Open onder het tabblad Navigator het opgeslagen reactieexperimentbestand voor een plaat.Open vervolgens het venster Nieuwe analyse maken en selecteer de juiste instellingen voor de methode 2e afgeleid max. Selecteer vervolgens Filter Comb en zorg ervoor dat de gegevens die voor STAT6 zijn verzameld, zijn geselecteerd. Selecteer de juiste kleurcompensatie.Klik op Berekenen en klik vervolgens op Bestand opslaan. Als u de gegevens wilt analyseren met de methode Geschikte punten, opent u het venster Nieuwe analyse maken en selecteert u de juiste instellingen voor de methode Geschikte punten. Selecteer vervolgens de juiste filters en kleurcompensaties voor STAT6.Stel de ruisband in om het achtergrondgeluid uit te sluiten. Open hierna het tabblad Analyse en stel de paspunten in op drie en selecteer Fit-punten weergeven. Sla wijzigingen op en herhaal de stappen met de juiste instellingen voor Fit Point en 2nd Derivative-analyse voor de KIR-genen.Open het tabblad Navigator in de qPCR-software en selecteer Batch exporteren. Open vervolgens de map met de experimentbestanden en breng deze over naar de rechterkant van het venster. Klik op Volgende en selecteer de naam en locatie van het exportbestand.Selecteer hierna het analysetype interesse en klik op Volgende. Controleer of de naam van het bestand, de exportmap en het analysetype correct zijn voordat u op Naast klikken om het exportproces te starten. Wanneer de exportstatus verandert in OK, wordt het scherm automatisch naar de volgende stap verplaatst.Controleer of alle geselecteerde bestanden zijn geëxporteerd en klik op Gereed. Gebruik vervolgens de scripts in het tekstprotocol om de geëxporteerde platen op te splitsen in individuele reacties en om de bestanden om te zetten in een software die leesbaar is door analysesoftware voor kopienummer. Open vervolgens de analysesoftware voor kopienummeranalyse en selecteer Realtime PCR-resultatenbestand importeren om de tekstbestanden te laden die door de scripts zijn gemaakt.Selecteer ten slotte Analyseren en voer de analyse uit door het meest voorkomende voorbeeldkopienummer te selecteren. In dit protocol werd semi-geautomatiseerd typen, of qKAT, gebruikt om nummertype KIR-genen te kopiëren. Het meest voorkomende exemplaarnummer voor KIR2DL4 was twee exemplaren, terwijl het meest voorkomende kopienummer voor KIR3DS1 nul was.Tijdens het proberen van deze procedure, is het uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat het DNA nauwkeurig wordt gekwantificeerd, om alle stappen op ijs uit te voeren, en ervoor te zorgen dat de reagentia zijn bedekt met licht. Het is ook belangrijk om grondige controles uit te voeren op de ruwe gegevens voor monsters die niet voldoen aan de bekende LD-regels voor KIR-genen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals sequencing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld de aanwezigheid van fusiegenen of de identificatie van nieuwe allelen.Na de ontwikkeling maakte deze methode de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van immunogenetica om de rol van KIR in NK celbiologie, ziekteresistentie en menselijke voortplanting te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Een methode om te studeren het C924T polymorfisme van het Thromboxaan A2-Receptor gen

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...