Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

הפרויקט קיבל מימון של המועצה למחקר רפואי (MRC), אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות התכנית של האיחוד האירופי (גרנט הסכם מס 695551) וקיימברידג המכון הלאומי לבריאות (NIH) ביו המרכז לחקר דם מחקר NIH והשתלת יחידת המחקר (NIHR BTRU) תרומת איברים והשתלות -מנדרינית, בשיתוף עם דם NHS השתלה (NHSBT). הדיעות הם אלה היוצרים ואלה לא בהכרח של בקופת חולים, את NIHR, מחלקת הבריאות או את NHSBT.

1. ציפוי מתוך ה-DNA והכנה
<ol><li>לכמת במדויק את הריכוז gDNA שימוש בכלי spectrophotometric או fluorometric.</li>
	<li>לדלל את הדנ א כדי ng/µL 4 על צלחת עמוקה 96-טוב-טוב. כוללים אחד לפחות שליטה מדגם gDNA עם מספר עותק הידוע ושליטה שאינם מתבנית אחת.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות 96-ובכן ב x 450 גרם למשך 2 דקות.</li>
	<li>שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על כל מדגם ב ארבע פעמים על גבי לוחות qPCR 384-ובכן כך בכל טוב יש 10 ng של DNA (2.5 µL טוב). להכין לפחות 10 צלחות 384-. ובכן, אחד עבור כל תגובה qKAT.</li>
	<li>אם הוא להיות בגליל gDNA באמצעות גלופה 96-ובכן אחד או יותר, לבצע שטיפה מלא בנפח 2% אקונומיקה ומים הנדסה גנטית כדי לנקות את המחטים של הנוזל טיפול מערכת בין כל צלחת 96-ובכן דוגמאות gDNA.</li>
	<li>מילה נהדרת ה-DNA על ידי המקננת הלוחות 384-ובכן באזור נקי בטמפרטורת החדר במשך לפחות 24 שעות.</li>
</ol>2. הכנת תחל וזונדים
הערה: qKAT מורכב תגובות מולטיפלקס עשר. כל התגובה כוללת שלושה זוגות פריימר וזונדים שלושה התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית המדגישים במיוחד שני גנים וקיר וג'ין הפניה אחת. הגששים שפורסמו בשנת ג'יאנג ואח27 שונו כך oligonucleotides מסומנות כעת עם צבעי אטו מאז הם מציעים פוטוסטביליטי משופרת ואורך זמן שידור. שילובים פריימר Pre-aliquoted הינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
<ol><li>הכנת תחל השילובים עבור כל תגובה לפי דילולים נתון בטבלה 1.</li>
	<li>להכין שילובים בדיקה עבור כל תגובה לפי טבלה 1. בדיקת כל בדיקה בודדים לפני קבלת השילוב.</li>
</ol>3. הכנת המיקס מאסטר
הערה אמצעי האחסון המוזכרים להלן הם עבור ביצוע התגובה qKAT אחד על קבוצה של 10 x 384-ובכן צלחות.
<ol><li>להבטיח כי הדגימות gDNA מצופה על לוחות 384-ובכן יבש לחלוטין. לנהל את כל השלבים על הקרח ולשמור את ריאגנטים מכוסה מחשיפה לאור ככל האפשר מאחר התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית הגששים צילום התרמו-והרגיש.</li>
	<li>מפשירים את מאגר qPCR, פריימר ולאחר בדיקה aliquots ב 4 º C.</li>
	<li>על קרח, להכין תערובת בסיס 10 x 384-ובכן הצלחות על-ידי הוספת 18.86 מ ל מים הנדסה גנטית, 20 מ"ל של מאגר qPCR, µL 1,000 שילוב פריימר preprepared µL 180 שילוב בדיקה preprepared (טבלה 2).</li>
	<li>פזר את תערובת הבסיס באופן שווה על פני צלחת 96-עמוק היטב באמצעות פיפטה של רב ערוצית, pipetting 415 µL לבאר כל. לשמור על הצלחת הזו בתיבת קרח מכוסה אור.</li>
	<li>שימוש בכלי טיפול בנוזלים, לוותר על µL 9.5 של המיקס מאסטר לבאר כל צלחת 384-טוב עם gDNA מיובשים. לאטום את הצלחת בנייר ולמקם אותו מיד ב 4 º C. חזור על תהליך זה עבור לוחות הנותרים, המבטיח כי המחטים של הנוזל טיפול מערכת נשטפים במים בין כל צלחת.</li>
	<li>Centrifuge הלוחות 384-ובכן ב 450 x g למשך 3 דקות, דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בין 6-12 שעות כדי resuspend את ה-DNA וכדי להפיג כל בועות האוויר.</li>
</ol>4. qPCR Assay
<ol><li>בעקבות הדגירה לילה, צנטריפוגה ב x 450 גרם במשך 3 דקות לפרוק את כל בועות האוויר הנותרים.</li>
	<li>למטרות של אוטומציה, לחבר את המכונה qPCR (למשל, LightCycler 480) מלווה microplate (ראה טבלה של חומרים). תוכנית המטפל microplate כדי למקם את הצלחות לתוך המכונה qPCR מן מזח אחסון מקורר זה מוגן מפני אור. הערה מבחני צריך, בתיאוריה, לעבוד על מכונות אחרות qPCR עם הגדרות אופטיים תואם.</li>
	<li>השתמש אופניים התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- C ° 66 תמורת 50 s, עם איסוף נתונים ב 66 º C.</li>
	<li>לאחר סיום ההפעלה, יש את הרובוט לאסוף את הצלחת מהמכונה qPCR ולמקם אותו לרציף להשליך.</li>
</ol>5. פוסט-לרוץ לניתוח
<ol><li>לאחר הגברה, לחשב את הערכים כימות מחזור (סי) באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות או השיטה מתאימה נקודות עם התוכנה של המכונה qPCR (ראה טבלה של חומרים), ביצוע השלבים הבאים.</li>
	<li>פתח את תוכנת qPCR, בכרטיסייה ' ניווט ', פתח את הקובץ ניסוי התגובה שנשמרו עבור לוח אחד.</li>
	<li>
על הניתוח באמצעות השיטה השניה המרבי נגזרות, בחר בכרטיסיה ניתוח, וליצור ניתוח חדש בשיטת Abs Quant/Second נגזרת מקס.
	<ol>
<li>בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: Rx-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).</li>
		<li>בחר מסנן מסרק ובחר הקס/ויק/Yellow555 (533-580). פעולה זו מבטיחה כי הנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרה.</li>
		<li>בחר צבע פיצוי עבור VIC/HEX/Yellow555(533-580). לחץ על חשב. חזור על הפעולה עבור המשפחה (465-510) ו- Cy5/Cy5.5(618-660). לחץ על שמור קובץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לניתוח בשיטת נקודות מתאים, בחר נקודות חשבים/Fit Abs בכרטיסיה ניתוח.
	<ol>
<li>בחלון ' יצירת ניתוח חדש ', בחר סוג ניתוח: נקודות חשבים/Fit Abs שיטה, משנה: כל דגימות, תוכנית: הגברה, שם: RxF-DFO (כאשר x הוא מספר התגובה).</li>
		<li>בחר את המסננים הנכונה ואת צבע פיצויים עבור STAT6 וכל אחת של גנים "קיר" (Fam/Cy5). בכרטיסייה ' Noiseband ', הגדר את להקת רעש כדי לא לכלול את רעשי הרקע.</li>
		<li>בכרטיסייה ' ניתוח ', הגדר את הנקודות מתאים ל- 3 ובחר שהצג מתאים נקודות. לחץ על חשב. לחץ על שמור קובץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ייצוא של תוצאות
<ol><li>בהתוכנה qPCR, פתח את הנווט בכרטיסיית לבחור לייצא את התוצאות אצווה.</li>
	<li>פתח את התיקייה שבה הקבצים ניסוי נשמרות, להעביר את הקבצים לתוך המקטע מצד ימין של החלון. לחץ על הבא. בחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.</li>
	<li>בחר סוג ניתוח Abs Quant/Second נגזרת מקס שיטה או Abs חשבים/Fit נקודות. לחץ על הבא. בדוק השם של הקובץ, התיקיה לייצא את סוג ניתוח הן נכונות, לחץ על הבא כדי להתחיל את תהליך הייצוא.</li>
	<li>המתן עד מצב ייצוא הוא בסדר. המסך יעבור אוטומטית לשלב הבא. . תבדוק את כל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה כך מספר הקבצים נכשל = 0. לחץ על לעשות.</li>
	<li>להשתמש בקבצי script split_file.pl roche2sds.pl כדי לפצל את הצלחות מיוצא תגובות בודדות עבור כל צלחת. הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.</li>
</ol>7. העתק מספר חישובים
<ol><li>פתח את מספר ניתוח התוכנה להעתיק (לדוגמה, CopyCaller). בחר ייבוא קובץ תוצאות ה-PCR בזמן אמת , לטעון קבצי טקסט שנוצר על-ידי roche2sds.pl.</li>
	<li>בחרו נתח , לערוך את הניתוח על-ידי גם בחירת כיל לדוגמה עם עותק הידוע מספר או על-ידי בחירת מספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר. ראה טבלה 5 עבור המספר עותק בתדירות הגבוהה ביותר של גנים "קיר" בדרך כלל נצפתה באוכלוסיות ממוצא אירופי.</li>
</ol>8. איכות הנתונים בודק
<ol><li>להשתמש בקובץ script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R לשלב העתק נתונים מספר הצלחות לתוך גיליון אלקטרוני. הערה קבצי ה-script מסופקים על פי בקשה/GitHub.</li>
	<li>בדוק מחדש את הנתונים הגולמיים על התוכנה ניתוח מספר עותק עבור דגימות לא תואמות הידוע תאחיזה לא שוויונית (LD) עבור קיר גנים (טבלה 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

אנו המתואר הרומן חצי אוטומטיות תפוקה גבוהה בשיטה, הנקראת qKAT, אשר מקלה על הקלדת מספר עותק של "קיר" גנים. השיטה היא שיפור על פני שיטות קונבנציונליות כמו SSP-PCR, תפוקה נמוכה והם יכולים רק להצביע על נוכחות או היעדרות של גנים אלה מאוד רב שלבית.
הדיוק של הנתונים מספר עותק שהושג תלויה גורמים רבים, כולל את האיכות ואת ריכוז-אחידות של הדגימות gDNA והאיכות של ריאגנטים. האיכות והדיוק של הדגימות gDNA על פני צלחת חשובים ביותר מאז וריאציות בריכוז על פני הצלחת עלולה לגרום לשגיאות בחישוב של המספר עותק. מאז מבחני היו מאומת באמצעות ערכות המדגם האירופי-מקור, נתונים גדודים משאר חלקי העולם דורשות בדיקות יסודית יותר. זו היא להבטיח כי מקרים של נשירת אלל או שאינם ספציפיים פריימר/בדיקה איגוד הם לא טעו לחשוב כמו העתק מספר וריאציות.
בעוד מבחני היו מעוצבות וממוטבות לרוץ כמו תפוקה גבוהה, ניתן לשנותן כדי להפעיל פחות דגימות. מדד ביטחון בתוכנת ניתוח מספר עותק מושפע בעת ניתוח דגימות פחות, אבל זה יכול להשתפר אם בקרת דגימות די אן איי גנומית עם מספר ידוע של עותק הגן וקיר כלולים בצלחת נוספים דוגמת משכפל כלל.
עבור מעבדות ללא נוזל/צלחת-טיפול רובוטים, מיקס מאסטר יכול ובשמפו באמצעות פיפטות רב ערוצית, צלחות ניתן לטעון ידנית לתוך הכלי qPCR.
המטרה העיקרית מאחורי התפתחות qKAT הייתה ליצור פשוטה, תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, וחסכונית שיטה גנוטיפ KIRs למחלה האגודה מחקרים. דבר זה הושג בהצלחה מאז qKAT ננקטה חוקרים את התפקיד של "קיר" במספר מחקרים האגודה מחלה גדולה, כולל מגוון של מחלות זיהומיות, מחלות אוטואימוניות הריון הפרעות4, 24 , 25 , 26.

בבני אדם, הקולטן בנוגדנים כמו רוצח("קיר") לוקוס ממופה על הזרוע הארוכה של כרומוזום 19 בתוך הקולטן ליקוציט מורכבים (LRC). לוקוס זה בסביבות 150 kb אורך וכוללת 15 וקיר הגנים מסודרים ראש זנב. לוקוסים וקיר הידועות כיום הם KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, שני pseudogenes, KIR2DP1 ו- KIR3DP1. הגנים וקיר קידוד עבור דו מימדי (2D) ואת רצפטורים תלת מימדי (3D) בנוגדנים כמו תחום עם קצר (S; הפעלת) או ארוכים (L; מעכבות) cytoplasmic זנבות, הבאים לידי ביטוי על ידי תאים הרוצח הטבעיים (NK) קבוצות משנה של T תאים. וריאציה מספר עותק הציג בתוך הצורות לוקוס וקיר haplotypes מגוונת עם תוכן משתנה ג'ין1. Non-allelic רקומבינציה הומולוגית (לבנון), בהנחייתם של סידור הגן ראש זנב קרוב והומולוגיה גבוהה-רצף, הוא המנגנון המוצע להיות אחראי על ההשתנות haplotypic. מעל 100 haplotypes שונות דווחו אוכלוסיות ברחבי העולם1,2,3,4. כל haplotypes האלה יכול להיות מחולק לשתי קבוצות עיקריות: A ו- B haplotypes. A haplotype מכיל גנים קיר 7: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR3DL2, ואשר הינם גנים וקיר מעכבות, את הפעלת "קיר" ג'ין KIR2DS4. עם זאת, למעלה עד 70% של אנשים ממוצא אירופי homozygous על קיר haplotype A באופן בלעדי לשאת צורה פונקציונלי "מחיקת" של5, KIR2DS46. כל השילובים גנים אחרים וקיר בצורת haplotypes קבוצה B, כולל לפחות באחד מהגנים קיר מסוים KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, KIR2DL5, וכוללים בדרך כלל שניים או יותר גנים "קיר" הפעלת.
הלע מחלקה אני מולקולות זוהו על ליגנדים עבור מסוימים רצפטורים מעכבים (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1), הפעלת קולטנים (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, ו KIR3DS1), KIR2DL4, אשר הוא ייחודי קיר מכיל של זנב ארוך cytoplasmic כמו אחרים קולטנים וקיר מעכבות, אך גם יש משקע הטעון חיובית ליד המחשבים חוץ-תאית אשר נפוצה תכונה של אחרים הפעלת קולטני "קיר" . השילוב של משתנים בתוך הגנים "קיר", הגנים הלע משפיע על האינטראקציה ליגנד לקולטן הזה צורות אפשריות NK תא תגובתיות-ברמת הפרט7,8. עדויות ממחקרים שיוך גנטי ציין כי וקיר משחק תפקיד ההתנגדות ויראלי (למשל., וירוס הכשל החיסוני האנושי [HIV]9 ו הפטיטיס C וירוס [בזכות]10), ההצלחה של השתלת 11, הסיכון של הפרעות הריון12,הצלחה הרבייה13, הגנה מפני נסיגה לאחר14,(HSCT) השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic15, 16, את הסיכון של סרטן17.
השילוב של high-רצף הומולוגיה, allelic ואתגרים haplotypic גיוון מתנות במשימה של מדויק genotyping וקיר גנים. שיטות קונבנציונליות כדי להקליד "קיר" הגנים כוללים רצף ספציפי פריימר (SSP) פולימראז תגובת שרשרת (PCR)18,19,20, רצף ספציפי oligonucleotide בדיקה PCR (SSOP)21, ו לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS)22. החסרונות של טכניקות אלה הן רק הם מספקים תובנה חלקית גנוטיפ של הפרט אך גם מפרך כדי לבצע. לאחרונה הוחל הדור הבא רצפי (הגדרות) כדי להקליד את לוקוס וקיר במיוחד. בעוד ששיטה זו היא רבת עוצמה, זה יכול להיות יקר כדי להפעיל, וזה זמן רב כדי לערוך בדיקות מעמיקה בניתוח ונתונים.
qKAT היא שיטת ה-PCR כמותי תפוקה גבוהה. בעוד שיטות קונבנציונליות מפרך וצורך, שיטה זו מאפשרת להפעיל כמעט 1,000 דגימות דנ א (gDNA) גנומית בחמישה ימים ונותן של גנוטיפ "קיר" , כמו גם את מספר עותק גנטי. qKAT מורכב עשר תגובות מולטיפלקס, שכל אחד מהם מטרות שני לוקוסים וקיר והעתק אחד הגנים הפניה של מספר עותק קבוע של הגנום (STAT6) משמש כימות היחסי של הגן וקיר מספר23. Assay הזה שימש בהצלחה בלימודי מעורבים לוחות אוכלוסייה גדולה לבין המחלה המפחידה על מחלות זיהומיות כגון בזכות, מחלות אוטואימוניות כמו בסוכרת מסוג 1, הריון הפרעות כגון רעלת, וכן מתן גנטי לגורם המרכזי עליו מושתתת על מחקרים להבנת NK תא פונקציה1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

תא הרג בנוגדנים דמוי קולטנים (KIRs) הם קבוצה של רצפטורים מעכבות, הפעלת המערכת החיסונית, על הרוצח הטבעיים (NK) ותאי T, מקודד על ידי מקבץ רב שלבית של גנים על כרומוזום 19. ליגנדים מאופיין ביותר שלהם הם מולקולות אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים מקודדים בתוך histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) לוקוס על כרומוזום 6. יש עדויות משמעותיות כי הם לשחק תפקיד משמעותי חסינות, רבייה, ההשתלה, שהופך אותו מכריע יש טכניקות יכולים במדויק גנוטיפ אותם. עם זאת, הומולוגיה גבוהה-רצף, כמו גם כמו allelic, וריאציה מס העתק, להקשות על שיטות עיצוב יכול בצורה מדויקת ויעילה גנוטיפ כל הגנים "קיר" . שיטות מסורתיות מוגבלים בדרך כלל את הרזולוציה של נתונים שהושגו, תפוקה, משתלמת, הזמן שנדרשו עבור התקנה והפעלה הניסויים. אנו מתארים שיטה הנקראת כמותיות וקיר חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT), אשר היא שיטה תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת מולטיפלקס תפוקה גבוהה שיכול לקבוע את מספרי עותק ג'ין עבור כל הגנים במיקומה "קיר" . qKAT היא שיטה פשוטה תפוקה גבוהה שיכול לספק ברזולוציה גבוהה וקיר עותק מספר נתונים, אשר יכול לשמש עוד יותר להסיק הווריאציות haplotypes רב-צורתיות מבנית, שמעבירים אותם. מספר זה העתק נתונים haplotype יכול להועיל במחקרים על עמותות המחלה בקנה מידה גדול, גנטיקה של אוכלוסיות, כמו גם חקירות על הביטוי ואינטראקציות פונקציונלי בין קיר הלע.

Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים "קיר" סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח על גנטיקה קולטן תא NK כגון מגוון haplotype וכיצד זה קשור למחלות. הדגמה חזותית של שיטה זו תסייע להגדיר את הפרוטוקול במעבדה שלך, כולל תהליך האוטומציה וניתוח הנתונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם, שלא כמו שיטות קונבנציונליות, qKAT, אשר מייצג הקלדה אוטומטית KIR כמותית, הוא תפוקה גבוהה והוא מספק מספר עותק גנים.qKAT יכול לספק תובנה על שיוך מחלות. ההשלכות של טכניקה זו יכולות להיות שימושיות לטיפול בזיהומים ויראליים כמו HIV והפטיטיס C, בסרטן, בהשתלת תאי גזע והפרעות הריון. qKAT יכול להיות מיושם גם בחקר גנטיקה האוכלוסייה, כמו גם לחקור ביטוי אינטראקציות תפקודיות בין מולקולות KIR ו HLA.qKAT מורכב 10 תגובות מולטיפלקס כי במיוחד למקד exons של שני גנים KIR גן התייחסות אחד. בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים נועדו לזהות את אללים של הגן נתון תוצאות PCR אמפילונים קצרים. לאחר מכן, בדיקות הידרוליזה ספציפיות עם תווית כפולה משמשות לניטור הגברה של PCR בזמן אמת.ניתוח מספר העתקה משתמש לכמות יחסי של גנים KIR היעד לגן ייחוס. qKAT מתוכנן ומוגדר כטכניקת תפוקה גבוהה. לפיכך, כל תגובה יכולה להתבצע על קצת פחות מ 1, 000 דגימות.השלבים הבאים מראים את השלבים הכרוכים בהכנה וציפוי מתוך כל צלחת DNA של 96 באר. כדי להתחיל, לאחר כימות ה-DNA, לדלל את ה-DNA בצלחת 96 היטב עמוק היטב. כלול דוגמת פקד אחת לפחות עם מספר עותק מוכר ופקד אחד שאינו של תבנית.צנטריפוגה הצלחת ב 450 gs במשך שתי דקות. לאחר מכן, מחלקים כל דגימה ברביעייה לתוך 384 גם צלחות qPCR. לאחר מכן, האוויר מייבש את הדנ"א באזור נקי בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.כדי להגדיר תגובת qKAT אחת עבור 10 לוחות 384 באר, הראשון, להפשיר את מאגר qPCR, פריימר, ו aliquots בדיקה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את תערובת האב על הקרח בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמשו בפיגט רב-ערוצי כדי להפיץ את תערובת המאסטר באופן שווה על פני צלחת עמוקה של 96 בארות.לוותר על 9.5 microliters של תערובת האב לתוך כל באר של הצלחת עם דגימות gDNA מיובשות. לאחר מכן, לאטום את הצלחת עם נייר כסף ומיד לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. זכור לבצע שטיפת מים קצרה כדי לנקות את המחטים של מערכת הטיפול בנוזל אם מחלקים את תערובת האב על יותר מצלחת DNA אחת של 384 באר.צנטריפוגה הצלחת עם דגימות gDNA ב 450 gs במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס כדי להשתמש שוב את ה-DNA ולפזר את כל בועות האוויר. לאחר הדגירה של הצלחת בן לילה, חזור על הצנטריפוגה כדי לפזר את כל בועות האוויר.לאחר מכן, מניחים את הצלחת ברציף האחסון מקורר. חבר את מחשב ה- qPCR למטפל במיקרו-לוחית. לאחר מכן, תכנת את המטפל במיקרופלסטיק בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לאחר השלמת הריצה, יש הרובוט לאסוף את הצלחת ממכונת qPCR ולמקום אותו ברציף להשליך. לאחר השלמת ההגברה, פתח את תוכנת qPCR. תחת הכרטיסיה נווט, פתח את קובץ ניסוי התגובה שנשמר עבור לוח.לאחר מכן, פתח את החלון יצירת ניתוח חדש ובחר את ההגדרות המתאימות עבור פעולת השירות 2 Derivative Max. לאחר מכן בחרו 'מסרק סינון' ודאו שהנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרו. בחר את פיצוי הצבע המתאים.לחץ על חשב ולאחר מכן לחץ על שמור קובץ. לניתוח הנתונים בעזרת השיטה Fit Points, פתחו את החלון 'צור ניתוח חדש' ובחרו בהגדרות המתאימות לפעולת השירות Fit Points. לאחר מכן, בחר את המסננים ופיצוי הצבע הנכונים עבור STAT6.הגדר את רצועת הרעש כך שלא תכלול את רעשי הרקע. לאחר מכן, פתחו את הכרטיסיה 'ניתוח' והגדירו את נקודות התאמה לשלוש ובחרו 'הצג נקודות התאמה'. שמור שינויים וחזור על השלבים עם ההגדרות המתאימות עבור Fit Point וניתוח נגזרת שנייה עבור הגנים KIR.פתח את הכרטיסיה נווט בתוכנת qPCR ובחר ייצוא אצווה תוצאות. לאחר מכן, פתח את התיקיה המכילה את קבצי הניסוי והעבר אותם לצד הימני של החלון. לחץ על הבא ובחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.לאחר מכן, בחר את סוג הניתוח של עניין ולחץ על הבא. ודא ששמו של הקובץ, תיקיית הייצוא וסוג הניתוח נכונים לפני שתלחץ על הבא כדי להתחיל בתהליך הייצוא. כאשר מצב הייצוא ישתנה ל'אישור', המסך יעבור באופן אוטומטי לשלב הבא.ודא שכל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה ולחץ על בוצע. לאחר מכן השתמש בקבצי ה- Script בפרוטוקול הטקסט כדי לפצל את הלוחות המיוצאים לתגובות בודדות ולהמיר את הקבצים לתוכנה הניתנת לקריאה על-ידי תוכנת ניתוח מספר העתקה. לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח מספר ההעתקה ובחר יבא קובץ תוצאות PCR בזמן אמת כדי לטעון את קבצי הטקסט שנוצרו על-ידי קבצי ה- Script.לבסוף, בחר נתח ונהל את הניתוח על-ידי בחירה במספר העותק לדוגמה השכיח ביותר. בפרוטוקול זה, הקלדה אוטומטית למחצה, או qKAT, שימשה להעתקת גנים KIR מסוג מספר. מספר העותק השכיח ביותר עבור KIR2DL4 היה שני עותקים בעוד שמספר העותק השכיח ביותר עבור KIR3DS1 היה אפס.בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לוודא כי ה-DNA הוא כימת במדויק, כדי לנהל את כל השלבים על הקרח, ולוודא כי reagents מכוסים מן האור. חשוב גם לבצע בדיקות יסודיות על הנתונים הגולמיים עבור דגימות שאינן תואמות את הכללים הידועים LD עבור גנים KIR. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו רצף על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל, נוכחות של גנים היתוך, או זיהוי של אללים הרומן.לאחר התפתחותה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונוגנטיקה לחקור את תפקידה של KIR בביולוגיה של תאי NK, עמידות למחלות ורבייה אנושית.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...