Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
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परियोजना को चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ग्रांट एग्रीमेंट नंबर ६९५५५१) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (nih) कैम्ब्रिज के तहत धन प्राप्त हुआ जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र और nih अनुसंधान रक्त और प्रत्यारोपण अनुसंधान इकाई (nih btru) में अंग दान और प्रत्यारोपण विश्वविद्यालय में कैम्ब्रिज और nhs रक्त और प्रत्यारोपण के साथ साझेदारी में (nhsbt). व्यक्त विचार लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनएचएस के उन, nihr, स्वास्थ्य विभाग, या nhsbt हैं ।

1. तैयारी और डीएनए के बाहर चढ़ाना
<ol><li>सही ढंग से एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक या फ्लोरोमेट्रिक उपकरण का उपयोग कर gdna एकाग्रता यों तो.</li>
	<li>९६-अच्छी तरह से डीप-वेल प्लेट पर 4 एनजी/μl को डीएनए को पतला करें । एक ज्ञात प्रतिलिपि संख्या और एक गैर-टेंपलेट नियंत्रण के साथ कम से कम एक नियंत्रण gdna नमूना शामिल है ।</li>
	<li>९६-अच्छी तरह से 2 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर प्लेटों centrifuge ।</li>
	<li>एक तरल हैंडलिंग साधन का उपयोग करना, प्रत्येक नमूने को ३८४ पर चौगुना कर दिया जाता है-अच्छी तरह से क्यूपीसीआर प्लेटें ताकि हर अच्छी तरह से डीएनए के 10 एनजी (२.५ μl/ प्रत्येक qkat प्रतिक्रिया के लिए एक अच्छी तरह से १० ३८४-खैर प्लेटें, एक तैयार करें ।</li>
	<li>यदि gdna से अधिक १ ९६ से तिरस्कृत किया जा रहा है-अच्छी थाली, 2% ब्लीच और ultrapure पानी के साथ एक पूर्ण मात्रा धोने प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक ९६-gdna नमूनों की अच्छी तरह थाली के बीच तरल हैंडलिंग प्रणाली की सुई साफ ।</li>
	<li>वायु-शुष्क डीएनए को एक साफ क्षेत्र में ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों को न्यूनतम 24 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।</li>
</ol>2. प्राइमर्स और जांच की तैयारी
नोट: qkat दस मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के होते हैं । प्रत्येक प्रतिक्रिया तीन प्राइमर जोड़े और तीन प्रतिदीप्ति-लेबल जांच शामिल है कि विशेष रूप से दो कीर जीन और एक संदर्भ जीन बढ़ाना । जांच है कि जियांग एट अल.27 में प्रकाशित किया गया तो संशोधित किया गया है कि oligonucleotides अब atto रंजक के साथ लेबल के बाद से वे बेहतर photostability और लंबे समय संकेत जंमे की पेशकश कर रहे हैं । प्री-एलिकोटेड प्राइमर युग्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ( सामग्री तालिकादेखें) ।
<ol><li>तालिका 1में दिए गए dilutions के अनुसार प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए प्राइमर संयोजन तैयार करें ।</li>
	<li>1 तालिकाके अनुसार प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए जांच संयोजन तैयार करें । संयोजन बनाने से पहले प्रत्येक व्यक्ति की जांच का परीक्षण करें ।</li>
</ol>3. मास्टर मिक्स की तैयारी
ध्यान दें नीचे उल्लेख किया संस्करणों 10x ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों के एक सेट पर एक qkat प्रतिक्रिया प्रदर्शन के लिए कर रहे हैं ।
<ol><li>सुनिश्चित करें कि gdna ३८४ पर चढ़ाया नमूने-खैर प्लेटों पूरी तरह से शुष्क हैं । बर्फ पर सभी चरणों का संचालन और के रूप में अधिक से अधिक के रूप में संभव के रूप में प्रकाश के लिए जोखिम से कवर अभिकर्मकों रखने के बाद से प्रतिदीप्ति-लेबल जांच फोटो और थर्मो संवेदनशील हैं ।</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर क्यूपीसीआर बफर, प्राइमर, और जांच aliquots defrost ।</li>
	<li>बर्फ पर, 10x ३८४ के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार-अच्छी तरह से प्लेटों को जोड़कर १८.८६ मिलीलीटर ultrapure पानी, 20 मिलीलीटर qpcr बफर, preprepared प्राइमरी संयोजन के १,००० μl, और preprepared जांच संयोजन के १८० μl (तालिका 2).</li>
	<li>एक ९६-गहरी अच्छी तरह से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर थाली, एक अच्छी तरह से में ४१५ μl pipette के पार मास्टर मिक्स समान रूप से वितरित । इस प्लेट को हल्के से ढक कर एक आइस बॉक्स में रखें ।</li>
	<li>एक तरल हैंडलिंग साधन का उपयोग कर, सूखे gdna के साथ ३८४-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में मास्टर मिश्रण के ९.५ μl वितरण । एक पन्नी के साथ प्लेट को सील करें और तुरंत इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर लगाएं । शेष प्लेटों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं, यह सुनिश्चित करना कि तरल हैंडलिंग प्रणाली की सुई प्रत्येक थाली के बीच पानी से धोया जाता है ।</li>
	<li>३८४-अच्छी तरह से 3 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर प्लेटें और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते या 6-12 एच के बीच डीएनए resuspend के लिए और किसी भी हवाई बुलबुले फैलने ।</li>
</ol>4. क्यूपीसीआर परख
<ol><li>रात में ऊष्मायन के बाद, किसी भी शेष हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए 3 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर अपकेंद्रिप ।</li>
	<li>स्वचालन के प्रयोजनों के लिए, qpcr मशीन कनेक्ट (उदाहरण के लिए, lightcycler ४८०) एक microplate हैंडलर के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें). कार्यक्रम microplate हेंडलर एक ठंडा भंडारण गोदी है कि प्रकाश से संरक्षित है से qpcr मशीन में प्लेटों जगह है । नोट assays सिद्धांत में, संगत ऑप्टिक सेटिंग्स के साथ अंय qpcr मशीनों पर काम करना चाहिए ।</li>
	<li>निम्नलिखित सायक्लिंग शर्तों का उपयोग करें: ९५ ° c 5 min के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस के ४० चक्र के बाद के लिए 15 s और ६६ ° c ५० s के लिए, ६६ डिग्री सेल्सियस पर डेटा संग्रह के साथ.</li>
	<li>एक बार चलाने पूरा हो गया है, रोबोट qpcr मशीन से थाली इकट्ठा और छंटे गोदी में जगह है ।</li>
</ol>5. पोस्ट-रन विश्लेषण
<ol><li>प्रवर्धन के बाद, परिमाणन चक्र (cq) या तो दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि या qpcr मशीन के सॉफ्टवेयर के साथ फिट अंक विधि का उपयोग कर मूल्यों की गणना ( सामग्री की तालिकादेखें), नीचे दिए गए चरणों का पालन.</li>
	<li>qpcr सॉफ़्टवेयर खोलें और, नेविगेटर टैब में, एक प्लेट के लिए सहेजी गई प्रतिक्रिया प्रयोग फ़ाइल खोलें ।</li>
	<li>
दूसरी व्युत्पंन अधिकतम विधि का उपयोग कर विश्लेषण के लिए, विश्लेषण टैब का चयन करें, और एक नए Abs quant का उपयोग कर विश्लेषण बनाने/
	<ol>
<li>नया विश्लेषण बनाएँ विंडो में, विश्लेषण प्रकार का चयन करें : Abs quant/दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि, सबसेट: सभी नमूने, प्रोग्राम: प्रवर्धन, नाम: Rx-dfo (जहां एक्स प्रतिक्रिया संख्या है).</li>
		<li>फ़िल्टर कंघी का चयन करें और VIC/हेक्स/Yellow555 (533-580)चुनें । यह सुनिश्चित करता है कि STAT6 के लिए एकत्रित डेटा चयनित है ।</li>
		<li>विक/हेक्स/Yellow555 (533-580)के लिए रंग क्षतिपूर्ति का चयन करें । परिकलितकरेंक्लिक करें । इस के लिए दोहराएं Fam (465-510) and Cy5/cy 5.5 (618-660) । फ़ाइल सहेजेंक्लिककरें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
फिट अंक विधि का उपयोग कर विश्लेषण के लिए, विश्लेषण टैब में Abs quant/फिट अंक का चयन करें ।
	<ol>
<li>नया विश्लेषण बनाएँ विंडो में, विश्लेषण प्रकार का चयन करें : Abs quant/फ़िट अंक विधि, सबसेट: सभी नमूने, प्रोग्राम: प्रवर्धन, नाम: rxf-dfo (जहाँ x प्रतिक्रिया संख्या है) ।</li>
		<li>सही फिल्टर और STAT6 के लिए रंग मलता है और प्रत्येक कीर जीन (Fam/Cy5) का चयन करें । noiseband टैब में, पृष्ठभूमि शोर को छोड़ने के लिए शोर बैंड सेट करें.</li>
		<li>विश्लेषण टैब में, फ़िट बिंदु को 3 पर सेट करें और फ़िट बिंदु दिखाएँका चयन करते हैं. परिकलितकरेंक्लिक करें । फ़ाइल सहेजेंक्लिककरें ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. परिणामों का निर्यात
<ol><li>qpcr सॉफ़्टवेयर में, खोलें नेविगेटर टैब का चयन करें परिणाम बैच निर्यात।</li>
	<li>वह फ़ोल्डर खोलें जिसमें प्रयोग फ़ाइलें सहेजी जाती है और फ़ाइलों को विंडो के दाईं ओर अनुभाग में स्थानांतरित करें । अगलाक्लिककरें । नाम और निर्यात फ़ाइल का स्थान का चयन करें ।</li>
	<li>विश्लेषण प्रकार abs quant/दूसरा व्युत्पन्न अधिकतम विधि या abs quant/फिट अंकका चयन करें । अगलाक्लिककरें । जांचें कि फ़ाइल का नाम, निर्यात फ़ोल्डर, और विश्लेषण प्रकार सही है और निर्यात प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें ।</li>
	<li>निर्यात स्थिति ठीकहै जब तक प्रतीक्षा करें । स्क्रीन स्वचालित रूप से अगले चरण पर ले जाएगा । जांचें कि सभी चयनित फ़ाइलें सफलतापूर्वक निर्यात की गई है ताकि फ़ाइलों की संख्या विफल रही = 0 । पूर्णक्लिक करें ।</li>
	<li>का प्रयोग करें लिपियों split_file. pl और roche2sds.pl प्रत्येक थाली के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में निर्यात प्लेटों विभाजित करने के लिए । नोट स्क्रिप्ट पर अनुरोध/github प्रदान किए जाते हैं ।</li>
</ol>7. कॉपी संख्या गणना
<ol><li>प्रति संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें (उदा., copycaller). रीयल-टाइम PCR परिणाम फ़ाइल आयात करें और roche2sds.plद्वारा बनाई गई पाठ फ़ाइलों को लोड करेंका चयन करे ।</li>
	<li>विश्लेषण का चयन करें और या तो ज्ञात प्रतिलिपि संख्या के साथ अंशनित्र नमूने का चयन करके या सबसे अधिक बार प्रतिलिपि संख्याका चयन करके analysis आचरण. विशेष रूप से यूरोपीय मूल की आबादी में देखा कीर जीन की सबसे लगातार प्रतिलिपि संख्या के लिए तालिका 5 देखें ।</li>
</ol>8. डेटा गुणवत्ता की जांच
<ol><li>R स्क्रिप्ट KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 का उपयोग करें । R एक स्प्रेडशीट में सभी प्लेटों से कॉपी संख्या डेटा गठबंधन करने के लिए । नोट स्क्रिप्ट पर अनुरोध/github प्रदान किए जाते हैं ।</li>
	<li>उन नमूनों के लिए प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर अपुष्ट डेटा की पुन: जांच करें जो ज्ञात लिंकेज असंतुलन (LD) के लिए कीर जीन (तालिका 6) के अनुरूप नहीं हैं ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हम एक उपंयास अर्द्ध स्वचालित उच्च throughput विधि, qkat कहा जाता है, जो कीर जीन की नकल संख्या टाइपिंग की सुविधा का वर्णन किया। विधि एसएसपी-पीसीआर की तरह पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार है, जो कम throughput हैं और केवल उपस्थिति या इन अत्यधिक बहुरूपी जीन की अनुपस्थिति का संकेत कर सकते हैं ।
प्रतिलिपि संख्या डेटा प्राप्त की सटीकता की गुणवत्ता और एकाग्रता-gdna नमूनों की एकरूपता और अभिकर्मकों की गुणवत्ता सहित कई कारकों पर निर्भर है । एक थाली भर में gdna नमूनों की गुणवत्ता और सटीकता बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि थाली में एकाग्रता में बदलाव की प्रतिलिपि संख्या की गणना में त्रुटियों में परिणाम कर सकते हैं । चूंकि assays यूरोपीय मूल नमूना सेट का उपयोग कर मांय किया गया, दुनिया के अंय भागों से समानता रखने वाले डेटा और अधिक गहन जांच की आवश्यकता है । यह सुनिश्चित करना है कि एलील छोड़ने या गैर-विशिष्ट प्राइमर/जांच बाइंडिंग के उदाहरणों की प्रतिलिपि संख्या भिंनता के रूप में गलत व्याख्या न की जाए ।
assays डिजाइन और उच्च throughput के रूप में चलाने के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि वे कम नमूनों को चलाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । कम नमूनों का विश्लेषण करते समय प्रति संख्या विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्वास मीट्रिक प्रभावित होती है, लेकिन यह तब सुधारा जा सकता है जब एक ज्ञात कीर जीन प्रति संख्या के साथ नियंत्रण जीनोमिक डीएनए नमूनों को प्लेट पर शामिल किया जाता है और अतिरिक्त नमूना प्रतिकृति शामिल.
बिना तरल/प्लेट-हैंडलिंग रोबोटों के लिए, मास्टर मिक्स को मल्टी-चैनल पिप्ट्स और प्लेटों का उपयोग करके तिरस्कृत किया जा सकता है, जिसे मैन्युअल रूप से qpcr इंस्ट्रूमेंट में लोड किया जा सकता है ।
qkat के विकास के पीछे मुख्य उद्देश्य एक सरल, उच्च थ्रूपुट, उच्च संकल्प, और लागत प्रभावी तरीके से रोग एसोसिएशन के अध्ययन के लिए जीनोटाइप kirs बनाने के लिए बनाया गया था । यह सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था के बाद से qkat कई बड़े रोग एसोसिएशन के अध्ययन में कीर की भूमिका की जांच में कार्यरत किया गया है, संक्रामक रोगों की एक श्रृंखला सहित, स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और गर्भावस्था विकारों4, 24 , 25 , 26.

मनुष्यों में, खूनी इम्यूनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर(कीर) लोकस ल्यूकोसाइट रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स (एलआरसी) के भीतर गुणसूत्र 19 के लंबे हाथ पर मैप किया जाता है । इस लोकस लंबाई में १५० kb के आसपास है और 15 कीर जीन की व्यवस्था सिर से पूंछ भी शामिल है । वर्तमान में ज्ञात कीर loci हैं KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, और दो स्यूडोजीन, KIR2DP1 और KIR3DP1। दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) इम्युनोग्लोबुलिन की तरह डोमेन रिसेप्टर्स के लिए कीर जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना कम (एस सक्रिय) या लंबे समय (एल; निरोधात्मक) कोशिकाद्रव्यी पूंछ, जो प्राकृतिक हत्यारा द्वारा व्यक्त कर रहे हैं (nk) कोशिकाओं और टी के सबसेट कक्षों. कॉपी संख्या कीर लोकस के भीतर प्रदर्शित भिंनता चर जीन सामग्री1के साथ विविध haplotypes रूपों । गैर-विकल्पी समजात पुनर्योजन (nahr), एक करीबी सिर से पूंछ जीन व्यवस्था और उच्च अनुक्रम homology द्वारा सुविधा है, तंत्र के लिए अगुणित परिवर्तनशीलता के लिए जिंमेदार होना प्रस्तावित है । १०० से अधिक विभिंन haplotypes आबादी में रिपोर्ट किया गया है दुनिया भर में1,2,3,4। इन सभी हप्पप्रकारों को दो प्रमुख समूहों में बांटा जा सकता है: ए और बी हैप्लोटाइप । एक haplotype 7 कीर जीन शामिल हैं: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1, और KIR3DL2, जो निरोधात्मक कीर जीन हैं, और सक्रिय कीर जीन KIR2DS4. हालांकि, अप करने के लिए ७०% यूरोपीय मूल के व्यक्तियों को जो कर रहे हैं के लिए homozygous कीर haplotype एक विशेष रूप से ले जाने के एक गैर कार्यात्मक "विलोपन" फार्म KIR2DS45,6. अन्य सभी कीर जीन संयोजन के रूप में समूह बी haplotypes, विशिष्ट कीर जीन KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2में से कम एक सहित, और KIR2DL5, और आम तौर पर दो या अधिक सक्रिय कीर जीन शामिल हैं ।
hla वर्ग मैं अणु कुछ निरोधात्मक रिसेप्टर्स (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, और KIR3DL1) के लिए लाइगैंडों के रूप में पहचान की गई है, रिसेप्टर्स को सक्रिय (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, और KIR3DS1), और KIR2DL4के लिए है, जो एक अद्वितीय कीर है कि अंय निरोधात्मक कीर रिसेप्टर्स की तरह एक लंबी कोशिकाद्रव्यी पूंछ शामिल है, लेकिन यह भी extracellular डोमेन के पास एक सकारात्मक आरोप अवशेष है जो एक आम है अन्य सक्रिय कीर रिसेप्टर्स की सुविधा । कीर जीन और hla जीन के भीतर वेरिएंट का संयोजन व्यक्तिगत स्तर7,8पर संभावित nk सेल प्रतिसादिता आकार कि रिसेप्टर संलग्नी बातचीत को प्रभावित करता है । आनुवंशिक एसोसिएशन के अध्ययनों से सबूत संकेत दिया है कि कीर वायरल प्रतिरोध में एक भूमिका निभाताहै (जैसे, मानव इम्यूनो वायरस [एचआईवी]9 और हेपेटाइटिस सी वायरस [hcv]10), प्रत्यारोपण की सफलता 11, गर्भावस्था विकारों और प्रजनन सफलता के जोखिम12,13, allogeneic हेमटोपोइटिक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन (hsct) के बाद पतन के खिलाफ संरक्षण14,15, 16, और कैंसर का खतरा17।
उच्च अनुक्रम समजातता और विकल्पी और haplotypic विविधता का संयोजन सही genotyping कीर जीन के कार्य में चुनौतियां प्रस्तुत करता है । कीर जीन टाइप करने के लिए पारंपरिक तरीकों अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर (एसएसपी) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)18,19,20, अनुक्रम-विशिष्ट oligonucleotide जांच (ssop) पीसीआर21, और मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर विशोषण ionization-उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री के समय (माल्डी-tof एमएस)22। इन तकनीकों की कमियां है कि वे केवल एक व्यक्ति whilst के जीनोटाइप में भी श्रमसाध्य प्रदर्शन करने के लिए आंशिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । हाल ही में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (ngs) को विशेष रूप से कीर लोकस टाइप करने के लिए लागू किया गया है । हालांकि यह विधि बहुत शक्तिशाली है, इसे चलाने के लिए महंगा हो सकता है, और यह गहराई से विश्लेषण और डेटा जांच के संचालन के लिए समय लेने वाला है ।
qkat एक उच्च throughput मात्रात्मक पीसीआर विधि है । जबकि परम्परागत पद्धतियां श्रमसाध्य और समय लेने वाली होती हैं, इस विधि से पाँच दिनों में लगभग १,००० जीनोमिक डीएनए (जीडीआई) के नमूनों को चलाना संभव बनाता है और कीर जीणोटाइप देता है, साथ ही जीन की प्रतिलिपि संख्या भी. qkat दस मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के होते हैं, जिनमें से प्रत्येक दो कीर loci और एक संदर्भ जीनोम में एक निश्चित प्रतिलिपि संख्या के जीन (STAT6) कीर जीन की प्रतिलिपि संख्या23के सापेक्ष परिमाणन के लिए इस्तेमाल लक्ष्य । इस परख सफलतापूर्वक इस तरह के hcv के रूप में संक्रामक रोगों पर बड़ी आबादी पैनलों और रोग साथियों को शामिल अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, प्रकार 1 मधुमेह की तरह स्व-प्रतिरक्षित शर्तों, और preeclampsia जैसे गर्भावस्था विकारों, साथ ही एक आनुवंशिक प्रदान nk सेल समारोह1,4,24,25,26को समझने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए underpinning ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर्स (kirs) निरोधात्मक और सक्रिय प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का एक सेट कर रहे हैं, प्राकृतिक हत्यारा (nk) और टी कोशिकाओं, पर जीन के एक बहुरूपी क्लस्टर द्वारा इनकोडिंग गुणसूत्र 19. उनकी सबसे अच्छी विशेषता लाइगैंडों मानव ल्यूकोसाइट antigen (hla) अणुओं है कि प्रमुख हिस्टोसंगतता परिसर के भीतर इनकोडिंग कर रहे हैं (mhc) गुणसूत्र पर लोकस 6. वहां पर्याप्त सबूत है कि वे प्रतिरक्षा, प्रजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और प्रत्यारोपण, यह महत्वपूर्ण तकनीकों है कि उंहें सही जीनोटाइप कर सकते है बनाने के लिए । हालांकि, उच्च अनुक्रम होमोलॉजी, साथ ही विकल्पी और प्रतिलिपि संख्या भिन्नता, यह मुश्किल है कि सही ढंग से और कुशलता से सभी कीर जीन जीनोटाइप कर सकते हैं डिजाइन करने के लिए बनाने के लिए । पारंपरिक तरीकों आमतौर पर प्राप्त डेटा के संकल्प में सीमित कर रहे हैं, throughput, लागत प्रभावशीलता, और समय की स्थापना और प्रयोगों को चलाने के लिए लिया. हम मात्रात्मक कीर अर्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) नामक एक विधि का वर्णन करते हैं, जो एक उच्च-थ्रॉपुट मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम पॉलीमरस चेन रिएक्शन विधि है जो कीर लोकस में सभी जीन के लिए जीन कॉपी संख्या निर्धारित कर सकता है । qkat एक सरल उच्च-थ्रॉपुट विधि है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन कीर कॉपी संख्या डेटा प्रदान कर सकती है, जिसे आगे चलकर संरचनात्मक रूप से पॉलीमोर्फिक हप्लोटाइप में भिन्नता का अनुमान लगाया जा सकता है जो उन्हें शामिल करता है । यह प्रति संख्या और haplotype डेटा बड़े पैमाने पर रोग संघों, जनसंख्या आनुवंशिकी पर अध्ययन के लिए फायदेमंद हो सकता है, साथ ही साथ अभिव्यक्ति और कीर और hlaके बीच कार्यात्मक बातचीत पर जांच ।

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qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qkat: मात्रात्मक अर्द्ध-हत्यारा सेल immunoglobulin की तरह रिसेप्टर जीन की स्वचालित टाइपिंग

मात्रात्मक हत्यारा सेल इम्युनोग्लोबुलिन की तरह रिसेप्टर (कीर) अर्द्ध स्वचालित टाइपिंग (qkat) एक सरल, उच्च थ्रॉपुट, और लागत प्रभावी तरीका संख्या प्रकार कीर जीन जनसंख्या और रोग एसोसिएशन के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए कॉपी करने के लिए है ।

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

इस विधि एनके सेल रिसेप्टर आनुवंशिकी जैसे हैप्टोटाइप विविधता के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब दे सकते हैं और यह कैसे बीमारी से संबंधित है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन आपकी प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल सेट करने में मदद करेगा, जिसमें स्वचालन प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण शामिल है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि, पारंपरिक तरीकों के विपरीत, क्यूकैट, जो मात्रात्मक कीर स्वचालित टाइपिंग के लिए खड़ा है, उच्च थ्रूपुट है और यह जीन कॉपी नंबर प्रदान करता है।qKAT रोग संघ में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस तकनीक के निहितार्थ एचआईवी और हेपेटाइटिस सी जैसे वायरल संक्रमण के लिए चिकित्सा के लिए उपयोगी हो सकते हैं, कैंसर में, स्टेम सेल प्रत्यारोपण में, और गर्भावस्था विकारों । क्यूकैट को जनसंख्या आनुवंशिकी का अध्ययन करने के साथ-साथ कीर और एचएलए अणुओं के बीच अभिव्यक्ति और कार्यात्मक बातचीत की खोज में भी लागू किया जा सकता है।qKAT में 10 मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाएं होती हैं जो विशेष रूप से दो कीर जीन और एक संदर्भ जीन के exons को लक्षित करती हैं। इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट प्राइमर को दिए गए जीन के एलील्स का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है और पीसीआर परिणाम कम एम्प्लिकोन में हैं। इसके बाद, वास्तविक समय में पीसीआर प्रवर्धन की निगरानी के लिए दोहरे लेबल वाले विशिष्ट हाइड्रोलिसिस जांच का उपयोग किया जाता है।कॉपी संख्या विश्लेषण एक संदर्भ जीन के लिए लक्ष्य KIR जीन के सापेक्ष मात्राकरण का उपयोग करता है । qKAT को एक उच्च-थ्रूपुट तकनीक के रूप में डिज़ाइन और सेट किया गया है। इसलिए, प्रत्येक प्रतिक्रिया सिर्फ 1, 000 नमूनों के तहत किया जा सकता है।निम्नलिखित कदम तैयारी में शामिल कदम और प्रत्येक ९६-अच्छी तरह से डीएनए प्लेट से बाहर चढ़ाना दिखा । शुरू करने के लिए, डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के बाद, एक ९६ अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली में डीएनए पतला । एक ज्ञात कॉपी नंबर और एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण के साथ कम से कम एक नियंत्रण नमूना शामिल करें।दो मिनट के लिए 450 जीएस पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। फिर, प्रत्येक नमूने को चौगुनी में 384-वेल क्यूपीसीआर प्लेटों में वितरित करें। इसके बाद, हवा 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक साफ क्षेत्र में डीएनए सूखी ।10 384-वेल प्लेटों के लिए एक क्यूकैट प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, सबसे पहले, क्यूपीसीआर बफर, प्राइमर और जांच एलिकॉट को चार डिग्री सेल्सियस पर डिफ्रॉस्ट करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार बर्फ पर मास्टर मिक्स तैयार करें। फिर, एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए एक ९६-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली भर में समान रूप से मास्टर मिश्रण वितरित ।सूखे gDNA नमूनों के साथ प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिश्रण के 9.5 माइक्रोलीटर वितरित करें। इसके बाद, पन्नी के साथ प्लेट को सील करें और तुरंत इसे चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि एक 384-अच्छी तरह से डीएनए प्लेट पर मास्टर मिश्रण वितरित करते हैं तो तरल हैंडलिंग सिस्टम की सुइयों को साफ करने के लिए एक छोटा पानी धोने का प्रदर्शन करना याद रखें।तीन मिनट के लिए 450 जीएस पर जीडीएनए नमूनों के साथ प्लेट को सेंट्रलाइज करें। फिर, डीएनए को फिर से खर्च करने और किसी भी हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, किसी भी हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए अपकेंद्री दोहराएं।इसके बाद प्लेट को कूल्ड स्टोरेज डॉक में रखें। क्यूपीसीआर मशीन को माइक्रोप्लेट हैंडलर से कनेक्ट करें। फिर, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार माइक्रोप्लेट हैंडलर प्रोग्राम करें।एक बार रन पूरा हो जाने के बाद रोबोट क्यूपीसीआर मशीन से प्लेट इकट्ठा कर के डिस्कार्ड कटघरे में रख दें । प्रवर्धन पूरा करने के बाद क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर खोलें। नेविगेटर टैब के तहत, प्लेट के लिए सेव किए गए रिएक्शन एक्सपेरिमेंट फाइल को खोलें।इसके बाद, बनाएं नई विश्लेषण विंडो खोलें और 2 डेरिवेटिव मैक्स विधि के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का चयन करें। फिर फ़िल्टर कंघी का चयन करें और यह सुनिश्चित करें कि STAT6 के लिए एकत्र किए गए डेटा का चयन किया गया है। उचित रंग मुआवजे का चयन करें।गणना पर क्लिक करें, और फिर सेव फ़ाइल पर क्लिक करें। फिट पॉइंट्स विधि के साथ डेटा का विश्लेषण करने के लिए, नई विश्लेषण विंडो बनाएं और फिट पॉइंट्स विधि के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का चयन करें। फिर, STAT6 के लिए सही फिल्टर और रंग मुआवजे का चयन करें।पृष्ठभूमि शोर को बाहर करने के लिए शोर बैंड सेट करें। इसके बाद, विश्लेषण टैब खोलें और फिट अंकों को तीन सेट करें, और शो फिट पॉइंट्स का चयन करें। परिवर्तनों को सहेजें और कीर जीन के लिए फिट पॉइंट और दूसरा व्युत्पन्न विश्लेषण के लिए उपयुक्त सेटिंग्स के साथ चरणों को दोहराएं।क्यूपीसीआर सॉफ्टवेयर में नेविगेटर टैब खोलें और परिणाम बैच निर्यात का चयन करें। फिर, प्रयोग फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर को खोलें और उन्हें खिड़की के दाईं ओर स्थानांतरित करें। आगे क्लिक करें, और निर्यात फ़ाइल का नाम और स्थान चुनें।इसके बाद, विश्लेषण प्रकार की रुचि का चयन करें और नेक्स्ट पर क्लिक करें। निर्यात प्रक्रिया शुरू करने के लिए अगले क्लिक करने से पहले फ़ाइल का नाम, निर्यात फ़ोल्डर, और विश्लेषण प्रकार सही हैं सुनिश्चित करें। जब निर्यात स्थिति ठीक हो जाती है, तो स्क्रीन स्वचालित रूप से अगले चरण में चली जाएगी।सुनिश्चित करें कि चयनित फ़ाइलों के सभी सफलतापूर्वक निर्यात किया गया है और किया क्लिक करें। फिर निर्यात की गई प्लेटों को व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में विभाजित करने और कॉपी नंबर विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा पठनीय सॉफ्टवेयर में फाइलों को परिवर्तित करने के लिए टेक्स्ट प्रोटोकॉल में लिपियों का उपयोग करें। इसके बाद, कॉपी नंबर विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और स्क्रिप्ट द्वारा बनाई गई टेक्स्ट फाइलों को लोड करने के लिए आयात वास्तविक समय पीसीआर परिणाम फ़ाइल का चयन करें।अंत में, विश्लेषण का चयन करें, और सबसे लगातार नमूना प्रतिलिपि संख्या का चयन करके विश्लेषण का संचालन करें। इस प्रोटोकॉल में सेमी ऑटोमेटेड टाइपिंग या क्यूकैट का इस्तेमाल नंबर टाइप कीर जीन कॉपी करने के लिए किया जाता था । KIR2DL4 के लिए सबसे अधिक बार कॉपी नंबर दो प्रतियां थीं जबकि KIR3DS1 के लिए सबसे अधिक बार कॉपी नंबर शून्य था।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है कि डीएनए को सही ढंग से निर्धारित किया जाए, बर्फ पर सभी चरणों का संचालन किया जाए, और यह सुनिश्चित किया जाए कि अभिकर्दक प्रकाश से ढके हुए हैं । यह भी नमूनों के लिए कच्चे डेटा पर पूरी तरह से जांच करना महत्वपूर्ण है कि कीर जीन के लिए ज्ञात एलडी नियमों के अनुरूप नहीं है । इस प्रक्रिया के बाद, अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए अनुक्रमण जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संलयन जीन की उपस्थिति, या उपन्यास एलील्स की पहचान।इसके विकास के बाद, इस विधि ने इम्यूनोजेनेटिक्स के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एनके सेल जीव विज्ञान, रोग प्रतिरोध और मानव प्रजनन में कीर की भूमिका का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

जीन और प्रमोटरों लकड़ी संरचना और माध्यमिक स्टेम विकास में शामिल अध्ययन के लिए प्रेरित दैहिक क्षेत्र के विश्लेषण (आईएसएसए) का प्रयोग करें

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

माउस दिलों में overexpress को rAAV9 की तैयारी या पछाड़ना जीन

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

पेप्टाइड व्युत्पन्न विधि पौधों में सेलुलर के उस पार जीन और प्रोटीन और Organellar बाधाओं को परिवहन करने के लिए

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

एक GFP टैग TMEM184A का प्रयोग हेपरिन रिसेप्टर पहचान की पुष्टि के लिए निर्माण

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

लक्षित<em&gt; बगल में</emनवोदित खमीर में&gt; mutagenesis Histone के जीन

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

क्वांटिटेटिव रीयल-टाइम पीसीआर का प्रयोग करके चूहे के पेरिटोनियल झिल्ली में माइक्रोआरएनए एक्सप्रेशन का पता लगाना

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए कीट कोशिकाओं (sf9) में विदेशी जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Thromboxane A2 रिसेप्टर जीन के C924T Polymorphism अध्ययन करने के लिए एक विधि

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

ट्यूमर कोशिकाओं में MicroRNA स्तर, कार्यों, और एसोसिएटेड लक्ष्य जीन का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो प्रोटोकॉल

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

विवो फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर में उपन्यास न्यूरोप्रोटेक्टिव जीन की पहचान करने के लिए

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...