Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

Il progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio di ricerca medica (MRC), del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea (grant contratto n. 695551) e il Cambridge National Institute of Health (NIH) Biomedical Research Centre e NIH ricerca sangue e trapianto di unità di ricerca (NIHR BTRU) in donazione e trapianto presso l'Università di Cambridge e in collaborazione con NHS Blood and Transplant (NHSBT). Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il Ministero della sanità o il NHSBT.

1. preparazione e placcatura fuori dal DNA
<ol><li>Quantificare con precisione la concentrazione gDNA utilizzando uno strumento spettrofotometrico o fluorometrica.</li>
	<li>Diluire il DNA a 4 ng / µ l su una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti. Includere almeno un controllo gDNA campione con un numero di copia nota e un modello di non controllo.</li>
	<li>Centrifugare le piastre da 96 pozzetti a 450 x g per 2 min.</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare ogni campione in quadruplice copia sulle piastre 384 pozzetti qPCR affinché ogni pozzo ha 10 ng di DNA (2,5 µ l/pozzetto). Preparare almeno dieci piastre da 384 pozzetti, uno per ciascuna reazione di qKAT.</li>
	<li>Se gDNA è erogato da più di una piastra a 96 pozzetti, eseguire un lavaggio di intero volume con 2% candeggina e acqua ultrapura per pulire gli aghi del liquido sistema tra ogni piastra a 96 pozzetti dei campioni gDNA manipolazione.</li>
	<li>Asciugare il DNA incubando le piastre da 384 pozzetti in un'area pulita a temperatura ambiente per almeno 24 h.</li>
</ol>2. preparazione del primer e sonde
Nota: qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex. Ogni reazione comprende tre coppie di primer e tre sonde fluorescenza-etichetta che amplificano in particolare due geni KIR e gene di un riferimento. Le sonde che sono state pubblicate in Jiang et al.27 sono state modificate affinché i oligonucleotides ora sono contrassegnati con le tinture ATTO poiché offrono una migliorata fotostabilità e segnale deve percorrere lunghe durate. Primer pre-aliquotato combinazioni sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
<ol><li>Preparare le combinazioni di primer per ogni reazione secondo le diluizioni riportati nella tabella 1.</li>
	<li>Preparare la sonda combinazioni per ogni reazione secondo la tabella 1. Ogni sonda individuo prima di effettuare la combinazione di prova.</li>
</ol>3. preparazione della Master Mix
Nota I volumi di seguito indicati sono per l'esecuzione di uno qKAT reazione su un set di piastre da 10 x 384 pozzetti.
<ol><li>Assicurarsi che i campioni di gDNA placcati sulle piastre da 384 pozzetti siano completamente asciutti. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e mantenere i reagenti coperti dall'esposizione alla luce per quanto possibile, dal momento che le sonde fluorescenza-labeled sono foto - e termo-sensibili.</li>
	<li>Sbrinare il buffer di qPCR, primer e aliquote di sonda a 4 ° C.</li>
	<li>Su ghiaccio, preparare un mix master per 10 x 384 pozzetti aggiungendo 18,86 mL di acqua ultrapura, 20 mL di buffer di qPCR, 1.000 µ l di combinazione preprepared primer e 180 µ l di combinazione preprepared sonda (tabella 2).</li>
	<li>Distribuire uniformemente il mix master su un piatto ben 96-profondo utilizzando una pipetta multicanale, pipettaggio 415 µ l in ogni pozzetto. Mantenere questo piatto in una scatola di ghiaccio coperta dalla luce.</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare 9,5 µ l di mix master in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti con gDNA secco. Sigillare la piastra con un foglio e mettere immediatamente a 4 ° C. Ripetere questo processo per le piastre rimanenti, assicurando che gli aghi del liquido sistema di movimentazione vengono lavati con acqua tra ogni piatto.</li>
	<li>Centrifugare le piastre da 384 pozzetti a 450 x g per 3 min e li Incubare a 4 ° C durante la notte o tra 6-12 h per risospendere il DNA e dissipare eventuali bolle d'aria.</li>
</ol>4. qPCR Assay
<ol><li>Dopo l'incubazione overnight, centrifugare a 450 x g per 3 min dissipare eventuali bolle d'aria rimanente.</li>
	<li>Ai fini dell'automazione, connettere la macchina qPCR (ad es., LightCycler 480) a un gestore di micropiastre (Vedi Tabella materiali). Programma per il gestore di micropiastre per inserire le piastre della macchina di qPCR da un bacino di stoccaggio refrigerato che è protetto dalla luce. Nota i saggi dovrebbero, in teoria, funzionare su altre macchine di qPCR con impostazioni ottiche compatibili.</li>
	<li>Utilizzare le seguenti condizioni in bicicletta: 95 ° C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 66 ° C per 50 s, con raccolta di dati a 66 ° C.</li>
	<li>Una volta che viene completata l'esecuzione, è necessario avere il robot raccogliere la piastra dalla macchina qPCR e inserirlo nel dock scartare.</li>
</ol>5. post-esecuzione analisi
<ol><li>Dopo l'amplificazione, calcolare i valori di ciclo (Cq) quantificazione utilizzando il secondo metodo di massimo derivato o il metodo di punti di adattamento con il software della macchina qPCR (Vedi Tabella materiali), procedi nel seguente modo.</li>
	<li>Aprire il software di qPCR e, nella scheda Navigator , aprire il file di esperimento di reazione salvato per una piastra.</li>
	<li>
Per l'analisi utilizzando il secondo metodo di massimo derivato, selezionare la scheda di analisi e create una nuova analisi utilizzando il metodo Abs Quant/Second derivato Max.
	<ol>
<li>Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Second derivato Max, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: Rx-DFO (dove x è il numero di reazione).</li>
		<li>Selezionare Filtro pettine e scegliere VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Ciò assicura che i dati raccolti per STAT6 sono selezionati.</li>
		<li>Selezionare compensazione del colore per VIC/HEX/Yellow555(533-580). Fare clic su Calcola. Ripetere questa operazione per Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Fare clic su Salva file.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per l'analisi mediante il metodo di punti di adattamento, selezionare Abs Quant/Fit punti nella scheda analisi.
	<ol>
<li>Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Fit punti, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: RxF-DFO (dove x è il numero di reazione).</li>
		<li>Selezionare i filtri corretti e compensazioni di colore per STAT6 e ciascuno dei geni KIR (Fam/Cy5). Nella scheda Noiseband , impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo.</li>
		<li>Nella scheda analisi , impostare i punti di adattamento a 3 e selezionare che Visualizza i punti di adattamento. Fare clic su Calcola. Fare clic su Salva file.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. esportazione dei risultati
<ol><li>Nel software qPCR, aprire il navigatore scheda selezionare Risultati Batch Export.</li>
	<li>Aprire la cartella in cui i file di esperimento sono salvati e trasferire i file nella sezione destra della finestra. Fare clic su Avanti. Selezionare il nome e il percorso del file di esportazione.</li>
	<li>Selezionare il tipo di analisi Metodo Max di derivato Quant/Second Abs o Abs Quant/Fit punti. Fare clic su Avanti. Verifica che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretto e fare clic su Next per avviare il processo di esportazione.</li>
	<li>Attendere che lo Stato di esportazione è Ok. Lo schermo passa automaticamente alla fase successiva. Verifica che tutti i file selezionati sono stati esportati con successo affinché il numero di file non riusciti = 0. Fare clic su fatto.</li>
	<li>Utilizzare gli script split_file.pl e roche2sds.pl per dividere le piastre esportate in reazioni individuali per ogni piatto. Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub.</li>
</ol>7. copiare il numero di calcoli
<ol><li>Aprire il software di analisi numero copie (ad esempio, CopyCaller). Selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale e caricare file di testo creati da roche2sds.pl.</li>
	<li>Seleziona analizza e condurre l'analisi sia selezionando campione calibratore con numero di copia nota oppure selezionando numero di copia più frequente. Vedere tabella 5 per il numero più frequente di copia dei geni KIR in genere osservata in popolazioni di origine europea.</li>
</ol>8. qualità dei dati controlla
<ol><li>Utilizzare script di R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R per combinare dati di numero di copia da tutti i piatti in un foglio di calcolo. Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub.</li>
	<li>Ricontrollare i dati grezzi sul software di analisi numero di copia per i campioni non conformi per il noto squilibrio (LD) per geni KIR (tabella 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un nuovo metodo semi-automatico ad alta velocità, chiamato qKAT, che facilita la copia numero digitando dei geni KIR . Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi convenzionali come SSP-PCR, che sono basso-throughput e possono solo indicare la presenza o l'assenza di questi geni altamente polimorfici.
La precisione dei dati numeri copia ottenuti dipende da molteplici fattori, tra cui la qualità e la concentrazione-uniformità dei campioni gDNA e la qualità dei reagenti. La qualità e la precisione dei campioni gDNA attraverso un piatto sono estremamente importanti poiché variazioni nella concentrazione su tutta la piastra possono causare errori nel calcolo del numero della copia. Poiché i dosaggi sono stati convalidati utilizzando set di campioni di origine europea, dati dalle coorti da altre parti del mondo richiedono controlli più approfonditi. Questo è per garantire che le istanze di allele dropout o associazione non specifici primer/sonda non sono interpretati erroneamente come variazione numero di copia.
Mentre i dosaggi sono stati progettati e ottimizzati per l'esecuzione come ad alta velocità, possono essere modificati per eseguire meno campioni. La metrica di fiducia nel software di analisi numero di copia è interessata quando si analizzano campioni di meno, ma questo può essere migliorato se campioni di DNA genomici di controllo con un numero di copia del gene KIR noto sono inclusi sulla piastra e repliche di esempio aggiuntivi sono incluso.
Per i laboratori senza liquido/piastra-manipolazione robot, mix master può essere distribuito utilizzando pipette multicanale e piastre possono essere caricati manualmente nello strumento qPCR.
Lo scopo principale dietro lo sviluppo di qKAT era di creare un semplice, ad alta velocità, alta risoluzione e conveniente metodo per genotipo KIRs per malattia gli studi di associazione. Questo è stato raggiunto con successo poiché qKAT è stato impiegato nell'investigare il ruolo di KIR in parecchi studi di associazione di grande malattia, compreso una gamma di malattie infettive, malattie autoimmuni e gravidanza disturbi4, 24 , 25 , 26.

In esseri umani, il recettore immunoglobulina-come assassino(KIR) locus è mappato sul braccio lungo del cromosoma 19 all'interno del complesso recettoriale del leucocita (LRC). Questo locus è circa 150 kb di lunghezza e comprende 15 KIR geni disposti testa-coda. I loci KIR che sono attualmente noti sono KIR2DL1, KIR2DL2/ KIR2DL4,KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e due pseudogeni, KIR2DP1 e KIR3DP1. I geni KIR codificano per bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) immunoglobulina-come dominio recettori con breve (S; attivazione) o lungo (L; inibitorio) Code citoplasmatiche che sono espresse da cellule natural killer (NK) e sottoinsiemi di T cellule. Copia numero variazione esposte all'interno delle forme di locus KIR diversi aplotipi con gene variabile contenuto1. La ricombinazione omologa non allelica (NAHR), facilitata da una composizione di gene di testa-coda stretta e alta-omologia, è il meccanismo proposto per essere responsabili della variabilità hanno. Oltre 100 diversi aplotipi sono stati segnalati in popolazioni in tutto il mondo1,2,3,4. Tutti questi aplotipi potrebbero essere diviso in due gruppi principali: gli aplotipi di A e B. L'aplotipo A contiene 7 geni KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, che sono inibitori KIR geni e l'attivazione KIR gene KIR2DS4. Tuttavia, fino al 70% degli individui di origine europea che sono omozigotici per KIR aplotipo A esclusivamente trasportare una forma non funzionale "eliminazione" di KIR2DS45,6. Tutte le altre combinazioni di geni KIR formano aplotipi di gruppo B, tra cui almeno uno dei geni KIR specifici KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e in genere includono due o più geni KIR d'attivazione.
Molecole HLA di classe I sono stati identificati come i ligandi per determinati recettori inibitori (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), attivando i recettori (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e per KIR2DL4, che è un unico KIR che contiene un citoplasmico lunghe code come altri recettori inibitori KIR, ma ha anche un residuo di caricato positiva vicino il dominio extracellulare che è un comune caratteristica di altri recettori KIR d'attivazione. La combinazione di varianti all'interno dei geni KIR e i geni HLA influenza interazione ligando del recettore che reattività potenziali forme NK cella al livello individuale7,8. La prova dagli studi di associazione genetica ha indicato che KIR svolge un ruolo nella resistenza virale (ad es.., virus dell'immunodeficienza umana [HIV]9 ed epatite C [HCV] virus10), il successo del trapianto 11, il rischio di gravidanza disturbi e successo riproduttivo12,13, la protezione contro la ricaduta dopo trapianto ematopoietico allogeneic della cellula formativa (HSCT) trapianto14,15, 16e il rischio di cancri17.
La combinazione di alta-omologia e allelica e hanno diversità presenta sfide nel compito di accuratamente geni KIR di genotipizzazione. I metodi convenzionali di geni KIR tipo comprendono primer sequenza-specifici (SSP) polimerasi reazione a catena (PCR)18,19,20, oligonucleotide sequenza-specific sonda (SSOP) PCR21, e aghi laser assistita desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS)22. Gli svantaggi di queste tecniche sono che essi forniscono solo parziale spaccato il genotipo di un individuo pur essendo anche laborioso da eseguire. Recentemente il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata applicata per digitare il locus KIR specificamente. Mentre questo metodo è molto potente, può essere costoso per l'esecuzione, ed è tempo di effettuazione di verifiche approfondite analisi e dati.
qKAT è un metodo PCR quantitativo ad alta produttività. Mentre i metodi convenzionali sono laboriosa e che richiede tempo, questo metodo rende possibile eseguire quasi 1.000 campioni di DNA (gDNA) genomici in cinque giorni e dà il genotipo KIR , così come il numero di copie del gene. qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex, ciascuno dei quali destinato a due KIR loci e copia di un gene di riferimento di un numero fisso copia nel genoma (STAT6) utilizzato per la relativa quantificazione del gene di KIR numero23. Questo test è stato utilizzato con successo negli studi che coinvolgono la popolazione grandi pannelli e coorti di malattia malattie infettive come HCV, patologie autoimmuni come il diabete di tipo 1, e disturbi della gravidanza come la preeclampsia, così come fornire una genetica alla base di studi volti a comprendere le NK cell funzione1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

Recettori di immunoglobulina-come delle cellule killer (KIRs) sono un insieme di ricevitori immuni inibitori e d'attivazione, il natural killer (NK) e le cellule di T, codificate da un cluster polimorfico di geni sul cromosoma 19. Loro ligandi meglio caratterizzate sono le molecole (HLA) l'antigene umano del leucocita che sono codificate all'interno il locus di istocompatibilità complex (MHC) sul cromosoma 6. Vi sono prove concrete che giocano un ruolo significativo nell'immunità, riproduzione e trapianto, rendendo fondamentale avere tecniche che possono misurare con precisione il genotipo li. Tuttavia, alta omologia, anche come allelica e variazione numero di copia, rendono difficile al genotipo ed efficientemente i metodi di progettazione che possono misurare con precisione tutti i geni KIR . Metodi tradizionali sono solitamente limitati nella risoluzione dei dati ottenuti, velocità effettiva, rapporto costo-efficacia e il tempo impiegato per l'impostazione e l'esecuzione degli esperimenti. Descriviamo un metodo chiamato quantitativa KIR semi-automatico digitando (qKAT), che è un metodo di reazione a catena multipla della polimerasi in tempo reale di alto-rendimento che può determinare i numeri di copia del gene per tutti i geni del locus di KIR . qKAT è un semplice metodo di alto-rendimento che può fornire dati ad alta risoluzione KIR copia numeri, che possono essere ulteriormente utilizzati per dedurre le variazioni negli aplotipi strutturalmente polimorfici che li comprendono. Questi dati di numero e aplotipo di copia possono essere utili per gli studi su associazioni di malattia su larga scala, genetica delle popolazioni, nonché indagini sull'espressione e interazioni funzionali tra KIR e HLA.

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qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: Quantitative sulla tipizzazione di assassino-cellula immunoglobulina-come geni del ricevitore

Quantitativa delle cellule di assassino immunoglobulina-come recettore (KIR) semi-automatica digitando (qKAT) sono un metodo semplice, ad alta velocità e costi contenuto per copiare il numeri geni KIR di tipo per la loro applicazione negli studi di associazione di popolazione e la malattia.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla genetica dei recettori cellulari NK come la diversità dell'aplotipo e su come questo si relaziona con la malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo aiuterà a impostare il protocollo in laboratorio, incluso il processo di automazione e l'analisi dei dati. I principali vantaggi di questa tecnica sono che, a differenza dei metodi convenzionali, qKAT, che sta per tipizzazione automatica KIR quantitativa, è ad alta produttività e fornisce il numero di copia genica.qKAT può fornire informazioni sull'associazione delle malattie. Le implicazioni di questa tecnica possono essere utili per la terapia per infezioni virali come HIV ed epatite C, nel cancro, nel trapianto di cellule staminali e nei disturbi della gravidanza. qKAT può anche essere applicato nello studio della genetica delle popolazioni, nonché nell'esplorazione dell'espressione e delle interazioni funzionali tra molecole KIR e HLA.qKAT consiste di 10 reazioni multiplex che prendono specificamente di mira gli esoni dei due geni KIR e un gene di riferimento. In questo protocollo, i primer specifici sono progettati per rilevare gli alleli del gene dato e i risultati della PCR in ampliconi brevi. Successivamente, le sonde di idrolisi specifiche a doppia etichetta vengono utilizzate per monitorare l'amplificazione PCR in tempo reale.L'analisi del numero di copia utilizza la quantificazione relativa dei geni KIR bersaglio in un gene di riferimento. qKAT è progettato e impostato per essere una tecnica ad alta produttività. Quindi, ogni reazione può essere eseguita su poco meno di 1.000 campioni.I seguenti passaggi mostrano i passaggi coinvolti nella preparazione e nella placcatura da ogni piastra di DNA a 96 porvi. Per iniziare, dopo aver quantificato il DNA, diluire il DNA in una piastra profonda 96 pozzi. Includere almeno un esempio di controllo con un numero di copia noto e un controllo non modello.Centrifugare la piastra a 450 g per due minuti. Quindi, distribuire ogni campione in quadruplicate in piastre qPCR da 384 pozzi. Dopo questo, asciugare all'aria il DNA in un'area pulita a temperatura ambiente per 24 ore.Per impostare una reazione qKAT per piastre da 10 384 pozzi, in primo luogo, scongelare le aliquote qPCR buffer, primer e probe a quattro gradi Celsius. Preparare il mix master sul ghiaccio secondo il protocollo di testo. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire il mix principale in modo uniforme su una piastra a pozzo profondo 96 po '.Distribuire 9,5 microlitri del master mescolare in ogni pozzo della piastra con i campioni di gDNA essiccati. Dopo questo, sigillare il piatto con un foglio e conservarlo immediatamente a quattro gradi Celsius. Ricordarsi di eseguire un lavaggio corto dell'acqua per pulire gli aghi del sistema di movimentazione dei liquidi se si eroga la miscela principale su più di una piastra di DNA da 384 porsi.Centrifugare la piastra con i campioni di gDNA a 450 g per tre minuti. Quindi, incubare la piastra a 4 gradi Celsius per rimescolare il DNA e dissipare eventuali bolle d'aria. Dopo aver incubato la piastra durante la notte, ripetere la centrifugazione per dissipare eventuali bolle d'aria.Quindi, posizionare la piastra nel dock di stoccaggio raffreddato. Collegare la macchina qPCR a un gestore di micropiatte. Quindi, programmare il gestore di micropiatte in base al protocollo di testo.Una volta completata la corsa, fare in modo che il robot riscuota la piastra dalla macchina qPCR e la posizionare nel dock degli scarti. Dopo aver completato l'amplificazione, aprire il software qPCR. Nella scheda Navigatore aprire il file dell'esperimento di reazione salvato per una piastra.Aprire quindi la finestra Crea nuova analisi e selezionare le impostazioni appropriate per il secondo metodo Derivative Max. Quindi selezionare Filtro pettine e assicurarsi che i dati raccolti per STAT6 siano selezionati. Selezionare la compensazione del colore appropriata.Fare clic su Calcola e quindi su Salva file. Per analizzare i dati con il metodo Fit Points, aprite la finestra Crea nuova analisi e selezionate le impostazioni appropriate per il metodo Fit Points. Selezionare quindi i filtri e le compensazioni di colore corretti per STAT6.Impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo. Successivamente, aprite la scheda Analisi e impostate i punti di adattamento su tre e selezionate Mostra punti di adattamento. Salvare le modifiche e ripetere i passaggi con le impostazioni appropriate per l'analisi Fit Point e 2nd Derivative per i geni KIR.Aprire la scheda Navigatore nel software qPCR e selezionare Esporta batch risultati. Quindi, aprire la cartella contenente i file dell'esperimento e trasferirli sul lato destro della finestra. Fare clic su Avanti e selezionare il nome e il percorso del file di esportazione.Successivamente, selezionare il tipo di interesse di analisi e fare clic su Avanti. Verificare che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretti prima di fare clic su Avanti per avviare il processo di esportazione. Quando lo stato di esportazione passa a OK, lo schermo passa automaticamente al passaggio successivo.Assicurate che tutti i file selezionati siano stati esportati correttamente e fate clic su Fatto (Done). Quindi utilizzare gli script nel protocollo di testo per dividere le piastre esportate in singole reazioni e per convertire i file in un software leggibile dal software di analisi del numero di copia. Aprire quindi il software di analisi dei numeri di copia e selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale per caricare i file di testo creati dagli script.Infine, selezionare Analizza e condurre l'analisi selezionando Il numero di copia di esempio più frequente. In questo protocollo, la tipizzazione semi-automatizzata, o qKAT, è stata usata per copiare i geni kir di tipo numerico. Il numero di copia più frequente per KIR2DL4 era di due copie, mentre il numero di copia più frequente per KIR3DS1 era zero.Durante il tentativo di questa procedura, è estremamente importante assicurarsi che il DNA sia quantificato con precisione, condurre tutti i passaggi sul ghiaccio e assicurarsi che i reagenti siano coperti dalla luce. È anche importante eseguire controlli approfonditi sui dati grezzi per campioni non conformi alle regole LD note per i geni KIR. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento possono essere eseguiti al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio la presenza di geni di fusione o l'identificazione di nuovi alleli.Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunogenetica per esplorare il ruolo di KIR nella biologia cellulare NK, nella resistenza alle malattie e nella riproduzione umana.

Research

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Genetics

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Genetica

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