Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
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O projeto recebido financiamento do Conselho de pesquisa médica (MRC), o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob o programa União Europeia do Horizonte 2020 pesquisa e inovação (grant acordo n. º 695551) e a National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre e sangue de pesquisa de NIH e Transplant Research Unit (NIHR BTRU) na transplantação e na Universidade de Cambridge e em parceria com o sangue de NHS e transplante (NHSBT). As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente aqueles de NHS, o NIHR, o departamento de saúde ou o NHSBT.

1. preparação e chapeamento do DNA
<ol><li>Quantificar com precisão a concentração de gDNA usando um instrumento espectrofotométrico ou fluorométrica.</li>
	<li>Dilua o DNA a 4 ng / µ l em uma placa de 96 poços profundos-bem. Incluem pelo menos uma amostra de gDNA de controle com um número de cópia conhecida e um modelo de controle.</li>
	<li>Centrifugar as placas de 96 poços a 450 x g por 2 min.</li>
	<li>Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispensar cada amostra em quadriplicado nas chapas de qPCR 384-bem, para que cada poço tem 10 ng de DNA (2,5 µ l/poço). Prepare pelo menos dez chapas de 384-bem, uma para cada reação qKAT.</li>
	<li>Se gDNA fornecimento de mais de uma placa de 96 poços, realize uma lavagem de volume completo com 2% de lixívia e água ultrapura para limpar as agulhas do líquido sistema entre cada placa de 96 poços de gDNA amostras de manipulação.</li>
	<li>Secar o DNA por incubar as placas de 384-bem em uma área limpa, em temperatura ambiente pelo menos 24 h.</li>
</ol>2. preparação das sondas e Primers
Nota: qKAT é composto por dez reações multiplex. Cada reação inclui três pares da primeira demão e três sondas de fluorescência-etiquetada que amplificam especificamente dois genes KIR e referência de um gene. As sondas que foram publicadas no Jiang et al.27 foram modificadas para que os oligonucleotides agora são rotulados com corantes ATTO desde que eles oferecem maior fotoestabilidade e vidas sinal longo. Cartilha pré-aliquotadas combinações são comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
<ol><li>Prepare as combinações de cartilha para cada reação conforme as diluições indicado na tabela 1.</li>
	<li>Prepare sonda combinações para cada reação, conforme tabela 1. Teste cada sonda individual antes de fazer a combinação.</li>
</ol>3. preparação do Master Mix
Nota Os volumes mencionados abaixo são para a realização de uma reação de qKAT em um conjunto de placas de 10 x 384-bem.
<ol><li>Certifique-se de que as amostras de gDNA chapeadas com as placas do 384-bem estão completamente secas. Realizar todos os passos no gelo e manter os reagentes cobertos da exposição à luz tanto quanto possível, desde que as sondas de fluorescência-etiquetada são foto - e termo-sensível.</li>
	<li>Degele o buffer de qPCR, primer e alíquotas de sonda a 4 ° C.</li>
	<li>No gelo, prepare uma mistura de mestre para placas de 10 x 384-bem adicionando 18,86 mL de água ultrapura, 20 mL de tampão de qPCR, 1.000 µ l de combinação preprepared cartilha e 180 µ l de combinação de sonda preprepared (tabela 2).</li>
	<li>Distribua uniformemente a mistura de mestre através de uma placa de 96 de profundidade bem usando uma pipeta multicanal, pipetagem 415 µ l em cada poço. Manter esta placa em uma caixa de gelo coberta de luz.</li>
	<li>Usando um instrumento de manipulação de líquidos, dispense 9,5 µ l do mix mestre em cada poço da placa 384-bem com gDNA seca. Selar o prato com uma folha e coloque-o imediatamente a 4 ° C. Repita este processo para as restantes placas, garantindo que as agulhas do líquido sistema de manipulação são lavadas com água entre cada prato.</li>
	<li>Centrifugar as placas de 384 poços a 450 x g por 3 min e incube-os a 4 ° C durante a noite ou entre 6-12 h para Ressuspender o DNA e para dissipar quaisquer bolhas de ar.</li>
</ol>4. ensaio de qPCR
<ol><li>Após a incubação durante a noite, centrifugar a 450 x g durante 3 min dissipar quaisquer bolhas de ar restantes.</li>
	<li>Para efeitos de automação, ligue a máquina de qPCR (por exemplo, LightCycler 480) a um manipulador de microplaca (ver Tabela de materiais). Programa manipulador de microplacas para colocar as placas na máquina qPCR de uma doca de armazenamento refrigerado protegido da luz. Nota os ensaios devem, em teoria, trabalhar em outras máquinas de qPCR com configurações de ópticas compatíveis.</li>
	<li>Use as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 66 ° C para 50 s, com coleta de dados a 66 ° C.</li>
	<li>Uma vez concluída a execução, tem o robô recolher a placa da máquina qPCR e colocá-lo no banco do réus de descarte.</li>
</ol>5. após a execução da análise
<ol><li>Após a amplificação, calcular os valores de ciclo (Cq) de quantificação usando o segundo método de máximo derivativo ou o método de pontos de ajuste com o software da máquina qPCR (ver Tabela de materiais), seguindo os passos abaixo.</li>
	<li>Abra o software de qPCR e, na aba do navegador , abra o arquivo de experimento de reação salvos para um prato.</li>
	<li>
Para a análise usando o segundo método de máximo derivado, selecione a guia de análise e criar uma nova análise, usando o método Abs Quant/Second derivado Max.
	<ol>
<li>Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Second derivado Max, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: Rx-DFO (onde x é o número de reação).</li>
		<li>Selecione Filtro Comb e escolha VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Isso garante que os dados coletados para STAT6 estão selecionados.</li>
		<li>Selecione cor compensação para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Clique em calcular. Repita isto para Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Clique em salvar arquivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para a análise usando o método de pontos de ajuste, selecione Abs Quant/Fit pontos na guia de análise.
	<ol>
<li>Na janela criar nova análise , seleccione o tipo de análise: o método Abs Quant/Fit pontos, subconjunto: todas as amostras, programa: amplificação, nome: RxF-DFO (onde x é o número de reação).</li>
		<li>Selecione os filtros corretos e compensações de cor para cada um dos genes KIR (Fam/Cy5) e o STAT6 . Na guia Noiseband , defina a banda ruído para eliminar o ruído de fundo.</li>
		<li>Na guia análise , definir os pontos de ajuste para 3 e selecione que mostrar pontos de ajuste. Clique em calcular. Clique em salvar arquivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. exportação dos resultados
<ol><li>No software qPCR, abra o navegador Tab. Selecione Exportar de lote de resultados.</li>
	<li>Abra a pasta na qual os arquivos do experimento são salvos em transferir os arquivos para a seção do lado direito da janela. Clique em seguinte. Selecione o nome e o local do arquivo de exportação.</li>
	<li>Selecione o tipo de análise o método Abs Quant/Second derivado Max ou Abs Quant/Fit pontos. Clique em seguinte. Verifique se o nome do arquivo, a pasta de exportação e o tipo de análise estão correto e clique em próximo para iniciar o processo de exportação.</li>
	<li>Espere até que o Status de exportação é Okey. A tela automaticamente se moverá para o próximo passo. Verifique que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso para que o número de arquivos falhou = 0. Clique em concluído.</li>
	<li>Use scripts split_file.pl e roche2sds.pl para dividir as placas exportadas em reações individuais para cada placa. Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.</li>
</ol>7. Copie o número de cálculos
<ol><li>Abra o software de análise número da cópia (por exemplo, CopyCaller). Selecione Importar arquivo de resultados PCR em tempo real e carregar arquivos de texto criados pelo roche2sds.pl.</li>
	<li>Selecione analisar e realizar a análise ou selecionando amostra Calibrador com número de cópia conhecida ou selecionando o número mais frequente de cópia. Ver tabela 5 para o número mais frequente de cópia de genes KIR tipicamente observada em populações de origem europeia.</li>
</ol>8. qualidade dos dados verifica
<ol><li>Use script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar dados de número de cópia de todas as placas em uma planilha. Nota os scripts são fornecidos na solicitação/GitHub.</li>
	<li>Verifique novamente os dados brutos sobre o software de análise de número de cópia para amostras que não estão em conformidade com o desequilíbrio de ligação conhecida (LD) para genes KIR (quadro 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Nós descrevemos um método de alta produtividade semi-automatizadas romance, chamado qKAT, que facilita a digitação de número cópia dos genes KIR . O método é uma melhoria sobre os métodos convencionais como SSP-PCR, que são de baixo rendimento e só podem indicar a presença ou ausência destes genes altamente polimórficos.
A precisão dos dados cópia números obtidos é dependente de vários fatores, incluindo a qualidade e uniformidade-concentração de amostras gDNA e a qualidade dos reagentes. A qualidade e a precisão das amostras gDNA através de uma placa são extremamente importantes, uma vez que as variações na concentração do outro lado da placa podem resultar em erros no cálculo do número de cópia. Desde os ensaios foram validados utilizando conjuntos de exemplo de origem europeia, dados de coortes de outras partes do mundo exigem verificações mais minuciosa. Isto é para garantir que instâncias do abandono do alelo ou ligação não-específica da primeira demão/sonda não são mal interpretadas como variação de número de cópia.
Enquanto os ensaios foram projetados e otimizados para rodar como alta produtividade, eles podem ser modificados para executar amostras menos. A métrica de confiança no software de análise do número cópia é afectada quando analisando amostras de menos, mas isso pode ser melhorado se amostras de DNA genômicas controle com um número de cópia de gene conhecido do KIR estão incluídas na placa e repetições de exemplo adicionais são incluído.
Para os laboratórios sem líquido/placa-manipulação de robôs, mistura de mestre pode ser dispensada usando pipetas multicanais e chapas podem ser carregadas manualmente dentro do instrumento qPCR.
O principal objetivo por trás do desenvolvimento de qKAT foi criar um simples, alta produtividade, alta resolução e econômica método genótipo KIRs para doença estudos de associação. Isto foi conseguido com sucesso desde que qKAT tem sido empregado em investigar o papel do KIR em vários estudos de associação grande doença, incluindo uma variedade de doenças infecciosas, doenças auto-imunes e distúrbios de gravidez4, 24 , 25 , 26.

Em humanos, os receptores de imunoglobulina-como assassino(KIR) locus é mapeado no braço longo do cromossomo 19 dentro o leucócitos do receptor complexo (LRC). Esse locus é cerca de 150 kb de comprimento e inclui 15 KIR genes arranjados cabeça a cauda. Os loci KIR que é atualmente conhecidos são KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e dois pseudogenes, KIR2DP1 e KIR3DP1. Os genes KIR codificam para bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) domínio de imunoglobulina-como receptores com short (S; ativando) ou longa (L; inibitório) cauda citoplasmática, que é expressos por células assassinas naturais (NK) e subconjuntos de T células. Variação de número de cópia exibiu dentro das formas de locus KIR diversos haplótipos com gene variável conteúdo1. Recombinação homóloga não-alélica (NAHR), facilitada por um arranjo de gene de cabeça-de-cauda estreita e sequência de alta homologia, é o mecanismo proposto para ser responsável para a variabilidade de haplotypic. Mais de 100 diferentes haplótipos foram relatados em populações em todo o mundo1,2,3,4. Todos estes haplótipos podiam ser divididos em dois grandes grupos: A e B haplótipos. O haplótipo A contém 7 genes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, que são inibitórios genes KIR e a activação KIR gene KIR2DS4. No entanto, até 70% de indivíduos de origem europeia que são homozigotos para KIR haplótipo A exclusivamente levar para uma forma de "exclusão" não-funcional de KIR2DS45,6. Todas as outras combinações de genes KIR formam grupo B haplótipos, incluindo pelo menos um dos genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e tipicamente incluem dois ou mais genes KIR ativando.
Moléculas de HLA classe I foram identificados como ligantes para determinados receptores inibitórios (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), ativando os receptores (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e para KIR2DL4, que é um exclusivo KIR que contém um longo citoplasmático rabos como outros receptores KIR inibitórios, mas também tem um resíduo de carga positiva perto o domínio extracelular, que é um comum característica de outros receptores KIR ativando. A combinação de variantes dentro dos genes KIR e os genes HLA influencia a interação do ligante do receptor que formas potencial NK célula capacidade de resposta a nível individual7,8. Evidências de estudos genéticos Associação indicou que KIR desempenha um papel na resistência viral (ex.., vírus de imunodeficiência humana [HIV]9 e hepatite C vírus [HCV]10), o sucesso do transplante de 11, o risco de gravidez transtornos e sucesso reprodutivo12,13, a proteção contra a recaída após células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH)14,15, 16e o risco de cancros17.
A combinação de sequência de alta homologia e alélica e haplotypic diversidade apresenta desafios na tarefa de genes KIR com precisão genotipagem. Métodos convencionais para digitar genes KIR incluem a primeira demão de sequência-específica (SSP) do polymerase reação em cadeia (PCR)18,19,20, sequência específica oligonucleotide sonda PCR (SSOP)21, e laser assistida matriz desorção ionização-tempo de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS)22. As desvantagens dessas técnicas são que eles só fornecem visão parcial sobre o genótipo de um indivíduo enquanto também ser trabalhoso executar. Recentemente, sequenciamento de próxima geração (NGS) tem sido aplicado para digitar o locus KIR especificamente. Enquanto este método é muito poderoso, pode ser caro executar, e é demorado para realizar verificações de dados e análise em profundidade.
qKAT é um método PCR quantitativo elevado-throughput. Enquanto os métodos convencionais são laborioso e demorado, este método torna possível executar quase 1.000 amostras de DNA (gDNA) genômicas em cinco dias e dá o genótipo KIR , bem como o número de cópia do gene. qKAT é composto por dez reações multiplex, cada um dos quais metas dois loci KIR e um gene de referência de um número fixo de cópia no genoma (STAT6) utilizado para a quantificação relativa do gene KIR copiar número23. Este ensaio tem sido usado com sucesso em estudos envolvendo painéis de grande população e doença coortes sobre doenças infecciosas como HCV, doenças auto-imunes, como diabetes tipo 1 e transtornos da gravidez como pré-eclâmpsia, bem como fornecendo uma genética na base de estudos que visa compreender o NK celular função1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

Receptores de imunoglobulina-like da pilha de assassino (KIRs) são um conjunto de receptores imunes inibitórios e ativando, assassinas naturais (NK) e células T, codificadas por um cluster polimórfico de genes no cromossomo 19. Seus ligantes mais bem caracterizadas são as moléculas de antigénios (HLA) de leucócito humano que são codificadas dentro o locus de (MHC) complexo principal de histocompatibilidade no cromossomo 6. Não há evidências substanciais de que desempenham um papel significativo na imunidade, reprodução e transplante de órgãos, tornando-se crucial ter técnicas que podem com precisão genótipo-los. No entanto, sequência de alta homologia, também como alélica e variação do número de cópia, dificultam ao genótipo e, eficientemente, métodos de projeto que podem com precisão todos os genes KIR . Os métodos tradicionais são geralmente limitados a resolução dos dados obtidos, produtividade, rentabilidade e o tempo necessário para configurar e executar os experimentos. Nós descrevemos um método chamado quantitativo KIR digitação semi-automática (qKAT), que é um método de reação em cadeia de polimerase em tempo real multiplex do elevado-throughput que pode determinar o número de cópias do gene para todos os genes no locus do KIR . qKAT é um método simples de alto rendimento que pode fornecer dados de alta resolução KIR cópia números, que podem ser mais usados para inferir as variações nos haplótipos estruturalmente polimórficas que eles englobam. Dados de número e haplótipo esta cópia podem ser benéficos para estudos sobre associações de doença em grande escala, genética de populações, bem como investigações sobre a expressão e interações funcionais entre KIR e HLA.

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qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: quantitativa coeficiente digitação de assassino-célula Genes de receptores de imunoglobulina-como

Pilha de assassino quantitativa imunoglobulina-como receptor (KIR) semi-automático digitação (qKAT) é um método simples, alto rendimento e baixo custo para copiar números genes KIR de tipo para sua aplicação em estudos de associação de população e a doença.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Este método pode responder a perguntas-chave sobre a genética do receptor de células NK, como a diversidade do haplotipo e como isso se relaciona com a doença. A demonstração visual deste método ajudará a definir o protocolo em seu laboratório, incluindo o processo de automação e análise de dados. As principais vantagens dessa técnica são que, ao contrário dos métodos convencionais, o qKAT, que significa digitação automatizada kir quantitativa, é de alto rendimento e fornece número de cópia genética.qKAT pode fornecer insights sobre associação de doenças. As implicações dessa técnica podem ser úteis para a terapia para infecções virais como HIV e hepatite C, no câncer, no transplante de células-tronco e distúrbios da gravidez. qKAT também pode ser aplicado no estudo da genética populacional, bem como na exploração da expressão e interações funcionais entre moléculas kir e HLA.qKAT consiste de 10 reações multiplex que visam especificamente exons dos dois genes KIR e um gene de referência. Neste protocolo, primers específicos são projetados para detectar os alelos do gene dado e os resultados do PCR em amplicons curtos. Depois disso, sondas de hidrólise específicas de dupla rotulagem são usadas para monitorar a amplificação do PCR em tempo real.A análise de números de cópia usa quantificação relativa dos genes KIR alvo para um gene de referência. qKAT é projetado e configurado para ser uma técnica de alta produtividade. Assim, cada reação pode ser realizada em pouco menos de 1.000 amostras.As etapas a seguir mostram os passos envolvidos na preparação e revestimento de cada placa de DNA de 96 poços. Para começar, depois de quantificar o DNA, diluir o DNA em uma placa de poço de 96 poços profundos. Inclua pelo menos uma amostra de controle com um número de cópia conhecido e um controle não-modelo.Centrifugar a placa a 450 gs por dois minutos. Em seguida, dispense cada amostra em quadruplicação em placas qPCR de 384 poços. Depois disso, o ar seca o DNA em uma área limpa à temperatura ambiente por 24 horas.Para configurar uma reação qKAT para 10 placas de 384 poços, primeiro, descongele o buffer qPCR, primer e alíquotas de sonda a quatro graus Celsius. Prepare a mistura mestre no gelo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use uma pipeta multicanal para distribuir a mistura mestre uniformemente através de uma placa de 96 poços profundos.Distribua 9,5 microliters da mistura mestre em cada poço da placa com as amostras de gDNA secas. Depois disso, sele a placa com papel alumínio e armazene-a imediatamente a quatro graus Celsius. Lembre-se de realizar uma lavagem de água curta para limpar as agulhas do sistema de manuseio líquido se dispensar a mistura mestre em mais de uma placa de DNA de 384 poços.Centrifugar a placa com as amostras de gDNA a 450 gs por três minutos. Em seguida, incubar a placa a 4 graus Celsius para resuspensar o DNA e dissipar quaisquer bolhas de ar. Depois de incubar a placa durante a noite, repita a centrifugação para dissipar quaisquer bolhas de ar.Em seguida, coloque a placa na doca de armazenamento refrigerado. Conecte a máquina qPCR a um manipulador de microplacão. Em seguida, programe o manipulador de microplacões de acordo com o protocolo de texto.Uma vez que a corrida esteja completa, peça ao robô para coletar a placa da máquina qPCR e colocá-la na doca de descarte. Após concluir a amplificação, abra o software qPCR. Sob a guia Navegador, abra o arquivo de experimento de reação salvo para uma placa.Em seguida, abra a janela Criar novas análises e selecione as configurações apropriadas para o método 2º Derivative Max. Em seguida, selecione Filter Comb e certifique-se de que os dados coletados para STAT6 sejam selecionados. Selecione a compensação de cores apropriada.Clique em Calcular e, em seguida, clique em salvar arquivo. Para analisar os dados com o método Ajustar pontos, abra a nova janela de análise e selecione as configurações apropriadas para o método Fit Points. Em seguida, selecione os filtros corretos e compensações de cores para STAT6.Defina a faixa de ruído para excluir o ruído de fundo. Depois disso, abra a guia Análise e defina os pontos de ajuste para três e selecione Mostrar pontos de ajuste. Salve as alterações e repita as etapas com configurações apropriadas para fit point e análise 2ª Derivada para os genes KIR.Abra a guia Navegador no software qPCR e selecione Exportação em lote de resultados. Em seguida, abra a pasta contendo os arquivos de experimento e transfira-os para o lado direito da janela. Clique em A seguir e selecione o nome e a localização do arquivo de exportação.Depois disso, selecione o tipo de análise de interesse e clique em Seguir. Certifique-se de que o nome do arquivo, da pasta de exportação e do tipo de análise estão corretos antes de clicar em "Próximo" para iniciar o processo de exportação. Quando o status de exportação mudar para OK, a tela passará automaticamente para a próxima etapa.Certifique-se de que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso e clique em "Feito". Em seguida, use os scripts no protocolo de texto para dividir as placas exportadas em reações individuais e converter os arquivos em um software legível pelo software de análise de números de cópia. Em seguida, abra o software de análise de números de cópia e selecione Importar arquivo de resultados pcr em tempo real para carregar os arquivos de texto criados pelos scripts.Por fim, selecione Analisar e realizar a análise selecionando o número de cópia da amostra mais frequente. Neste protocolo, a digitação semi-automatizada, ou qKAT, foi usada para copiar genes kir tipo número. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4 foi de duas cópias, enquanto o número de cópia mais frequente para KIR3DS1 era zero.Ao tentar este procedimento, é extremamente importante garantir que o DNA seja quantificado com precisão, para conduzir todos os passos no gelo e para garantir que os reagentes estejam cobertos de luz. Também é importante realizar verificações minuciosas sobre os dados brutos para amostras que não estão de acordo com as regras LD conhecidas para genes KIR. Após esse procedimento, outros métodos como sequenciamento podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, por exemplo, presença de genes de fusão, ou identificação de novos alelos.Após seu desenvolvimento, este método abriu caminho para pesquisadores do campo da imunogenética explorarem o papel do KIR na biologia celular NK, resistência a doenças e reprodução humana.

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