Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

Проект получил финансирование от Совета медицинских исследований (СМИ), Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение № 695551) и национального института здравоохранения (НИЗ) Кембридж Биомедицинских научно-исследовательский центр и низ исследования крови и трансплантации исследовательское подразделение (NIHR BTRU) в донорства и трансплантации в Кембриджском университете и в партнерстве с NHS крови и трансплантации (NHSBT). Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR, Департамент здравоохранения, или NHSBT.

1. Подготовка и обшивка из ДНК
<ol><li>Точно подсчитать концентрация геномная ДНК с помощью спектрофотометрические или флуориметрический инструмента.</li>
	<li>Разбавляют ДНК до 4 нг/мкл на плиту 96-луночных глубокой скважины. Включать, по крайней мере один образец управления геномная ДНК с числом известных копии и один элемент управления-шаблон.</li>
	<li>Центрифуга 96-луночных пластины на 450 x g на 2 мин.</li>
	<li>С помощью инструмента обработки жидких, обойтись каждый образец в составленном на 384-ну ПЦР плиты так, что каждый хорошо имеет 10 нг ДНК (2,5 мкл/хорошо). Подготовка по меньшей мере десять 384-ну пластины, один для каждой qKAT реакции.</li>
	<li>Если геномная ДНК отказаться от более чем одной 96-луночных пластины, выполните полный объем промыть 2% отбеливателя и ультрачистая вода для очистки иглы жидкости системы между каждой пластины 96-луночных геномная ДНК образцов обработки.</li>
	<li>Просушите ДНК, инкубации и 384-ну пластины в чистой зоне при комнатной температуре в течение 24 часов.</li>
</ol>2. Подготовка грунтовки и зонды
Примечание: qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций. Каждая реакция включает в себя три пары праймера и три флуоресцировани обозначенного зондами, которые специально усиливают два Кир генов и ссылку на один ген. Датчики, которые были опубликованы в Цзян et al.27 были изменены таким образом, чтобы олигонуклеотиды теперь помечены Атто красителями, так как они предлагают улучшенный светостойкость и длинный сигнал продолжительностей жизни. Pre-aliquoted грунтовка комбинации являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).
<ol><li>Подготовьте грунт комбинации для каждой реакции согласно разведений, приведенные в таблице 1.</li>
	<li>Подготовьте зонд комбинации для каждой реакции согласно таблице 1. Каждый индивидуальный пробник до принятия комбинации.</li>
</ol>3. Подготовка Мастер микс
Примечание Томов, упомянутых ниже, для выполнения одного qKAT реакция на наборе 10 x 384-ну пластин.
<ol><li>Убедитесь, что геномная ДНК образцов покрытием на тарелках 384-ну абсолютно сухие. Провести все шаги на льду и держать реагентов, распространяется от воздействия света как можно больше, поскольку флуоресцировани обозначенного зонды чувствительны к фото - и термо.</li>
	<li>Размораживание буфер ПЦР, грунтовка и зонд аликвоты при 4 ° C.</li>
	<li>На льду Подготовьте мастер смесь для 10 x 384-ну пластин, добавив 18,86 мл ультрачистая вода, 20 мл ПЦР буфер, 1000 мкл вкладываемое грунтовка комбинации и 180 мкл вкладываемое зонд комбинации (Таблица 2).</li>
	<li>Равномерно распределяет Мастер микс по 96-глубокие хорошо пластину, используя многоканальные пипетки, закупорить 415 мкл в каждой скважине. Держите эту пластину в поле льда распространяется от света.</li>
	<li>С помощью инструмента обработки жидких, лунки 9,5 мкл мастер смесь в каждой скважине 384-ну пластины с сушеной геномная ДНК. Печать пластину с фольгой и сразу же поместить его на 4 ° C. Повторите этот процесс для оставшихся пластины, обеспечивая, что иглы жидкости системы обработки промывают водой между каждой плиты.</li>
	<li>Центрифуга 384-ну пластины на 450 x g 3 мин и инкубировать их в 4 ° C на ночь или между 6-12 ч до Ресуспензируйте ДНК и рассеивать любые воздушные пузыри.</li>
</ol>4. ПЦР анализа
<ol><li>После ночи инкубации центрифуги на 450 x g 3 мин рассеивать любые оставшиеся пузырьков воздуха.</li>
	<li>Для целей автоматизации, подключите машину ПЦР (например, LightCycler 480) Гонав обработчик (см. Таблицу материалы). Программа обработчик Гонав размещать пластины в машину ПЦР с охлаждением хранения док, который защищен от света. Примечание анализов должны в теории, работать на других машинах ПЦР с совместимых оптических параметров.</li>
	<li>Используйте следующие условия Велоспорт: 95 ° C за 5 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 s и 66 ° C 50 сек, сбора данных на 66 ° C.</li>
	<li>После завершения выполнения, у робота собрать пластину от машины ПЦР и поместите его в док отменить.</li>
</ol>5. После выполнения анализа
<ol><li>После усиления, вычислить количественная оценка цикла (ов) с помощью второй производной максимальная метода или метода определяющих точек с помощью программного обеспечения машины ПЦР (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям ниже.</li>
	<li>Откройте программное обеспечение ПЦР, на вкладке " Навигатор ", файл и открыть сохраненный реакции эксперимент для одной пластины.</li>
	<li>
Для анализа с использованием метода второй производной максимальная выберите вкладку анализ и создать новый анализ с помощью метода Abs Quant/Second производная Макс.
	<ol>
<li>В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Quant/Second производная Макс, подмножества: все образцы, программа: усиление, имя: Rx-ДФО (где x является номером реакции).</li>
		<li>Выберите Фильтр расческу и выберите Вик/HEX/Yellow555 (533-580). Это гарантирует, что данные, собранные для STAT6 установлен.</li>
		<li>Выберите Цвет компенсации для VIC/HEX/Yellow555(533-580). Нажмите кнопку вычислить. Повторите это действие для Fam (465-510) и Cy5/Cy5.5(618-660). Нажмите кнопку сохранить файл.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Для анализа с использованием метода определяющих точек выберите Abs Квант/Fit точки на вкладке анализ.
	<ol>
<li>В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Квант/определяющих точек, подмножества: все образцы, программа: усилители, имя: RxF-ДФО (где x является номером реакции).</li>
		<li>Выберите правильные фильтры и цвет компенсации для STAT6 и каждый из генов Кир (Fam/Cy5). В Noiseband на вкладке установите шума группу, чтобы исключить фоновый шум.</li>
		<li>На вкладке анализ равным 3 определяющих точек и выберите Показать определяющих точек. Нажмите кнопку вычислить. Нажмите кнопку сохранить файл.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Экспорт результатов
<ol><li>В программном обеспечении ПЦР, откройте Навигатор tab. Выберите Экспорт пакетов результаты.</li>
	<li>Откройте папку, в которой эксперимент файлы сохраняются и передачи файлов в правой части окна. Нажмите кнопку Далее. Выберите имя и расположение файла экспорта.</li>
	<li>Выберите тип анализа, метода Abs Quant/Second производная Макс или Abs Квант/определяющие точки. Нажмите кнопку Далее. Проверьте, что имя файла, папку экспорта и тип анализа являются правильными и нажмите кнопку следующий чтобы начать процесс экспорта.</li>
	<li>Подождите, пока Состояние экспорта ОК. Экран автоматически перейдет к следующему шагу. Проверьте, что все выбранные файлы были успешно экспортированы тем, что количество файлов не = 0. Нажмите кнопку Готово.</li>
	<li>Использовать скрипты split_file.pl и roche2sds.pl разделить экспортируемый пластины на индивидуальных реакций для каждой пластины. Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.</li>
</ol>7. Скопируйте число вычислений
<ol><li>Открываете копию номером анализ программного обеспечения (например, CopyCaller). Выберите файл результатов в реальном времени PCR импорта и загрузить текстовые файлы, созданные roche2sds.pl.</li>
	<li>Выберите анализировать и проводить анализ, либо выбрав образец калибратор с числом известных копии или выбрав наиболее частого копирования номер. Смотрите в таблице 5 для наиболее частых копии количество генов Кир , обычно наблюдается в населения европейского происхождения.</li>
</ol>8. качество данных проверяет
<ol><li>Используйте сценарий R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R объединить копирования данных из всех плит в электронную таблицу. Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.</li>
	<li>Проверьте исходные данные на копию номером анализ программного обеспечения для образцов, которые не соответствуют известных связей неравновесия (LD) для Кир генов (Таблица 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы описали Роман полуавтоматические высок объём метод, называемый qKAT, который облегчает копирование номер ввода Кир генов. Этот метод является улучшением по сравнению традиционными методами как SSP-PCR, низкой пропускной способностью и может только указать наличие или отсутствие этих весьма полиморфных генов.
Точность копирования число полученных данных зависит от нескольких факторов, включая качество и концентрации единообразие геномная ДНК образцов и качество реагентов. Качество и точность геномная ДНК образцов через тарелку чрезвычайно важны для различия в концентрации через пластины может привести к ошибкам при расчете числа копирования. После анализов были проверены с использованием комплектов образцов европейского происхождения, данные из когорты из других частей мира требуют более тщательной проверки. Это необходимо для того, что экземпляры аллеля отсева или неспецифических праймер/зонд привязки не истолкованы как копирование количество вариантов.
В то время как анализы были разработаны и оптимизированы для работы в качестве высокой пропускной способности, они могут быть изменены для запуска меньшее количество образцов. Метрику уверенность в копии номер анализ программного обеспечения пострадавших при анализе образцов меньше, но это можно улучшить, если управления геномной ДНК образцов с известный номер копии гена Кир включены на плите и реплицирует дополнительные примеры включены.
Для лабораторий без жидкости/плита обработки роботы мастер смесь можно обойтись с помощью многоканальных пипеток и пластины могут загружаться вручную в ПЦР инструмент.
Основная цель за развитие qKAT было создание простой, высокой пропускной способности, с высоким разрешением и экономически метод генотип Кирс болезни ассоциации исследований. Это была успешно достигнута, поскольку qKAT был нанят в расследовании роли Кир в нескольких крупных болезни ассоциации исследований, включая широкий спектр инфекционных заболеваний, аутоиммунные условий и беременность расстройств4, 24 , 25 , 26.

В организме человека, убийца рецептора иммуноглобулина как(Кир) локус сопоставляется на длинном плече хромосомы 19 в рамках комплекс рецептор лейкоцитов (LRC). Этот локус в длину около 150 КБ и включает в себя 15 Кир гены расположены головы до хвоста. Кир локусов, которые известны в настоящее время являются KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, и два pseudogenes, KIR2DP1 и KIR3DP1. Кир гены кодировать для двумерного (2D) и трехмерных (3D) домен иммуноглобулина подобных рецепторов с короткими (S; активации) или длинным (L; тормозящее) цитоплазматических хвосты, которые выражаются в естественных киллеров (НК) и подмножество T клетки. Номер варианта копирования выставлены в Кир локуса формы различных гаплотипов с переменной ген содержание1. Non аллельные гомологичная рекомбинация (НАХР), способствовало тесное голова хвост гена договоренности и высокой последовательности гомологии, является механизм, предложенный отвечает за haplotypic изменчивости. Более 100 различных гаплотипов были зарегистрированы в населения во всем мире1,2,3,4. Все эти гаплотипов можно разделить на две основные группы: A и B гаплотипов. Гаплотип A содержит 7 Кир генов: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1и KIR3DL2, которые ингибирующее Кир генов и активации Кир гена KIR2DS4. Однако до 70% лиц европейского происхождения, которые гомозиготных для Кир гаплотип А исключительно несут нефункциональные «удаление» форма KIR2DS45,6. Все другие комбинации генов Кир формируют группы B гаплотипов, включая по крайней мере один из конкретных генов Кир , KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, и KIR2DL5и обычно включают в себя два или более Активация Кир генов.
HLA класса I молекулы были названы лигандов для определенных рецепторов ингибирующих (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3и KIR3DL1), активируя рецепторы (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5и KIR3DS1), и для KIR2DL4, который является уникальный Кир , который содержит долго цитоплазматических хвосты, как других рецепторов ингибирующих Кир, но также имеет положительно заряженных остатков вблизи внеклеточного домена, которая является общей особенность других активирующий рецепторы Кир . Сочетание вариантов внутри Кир генов и HLA генов влияет взаимодействия лигандов рецепторов потенциал клеток отзывчивость НК что фигуры на индивидуальный уровень7,-8. Доказательства из исследований генетических ассоциации указал, что Кир играет определенную роль в вирусной устойчивости (например,., вирус иммунодефицита человека [ВИЧ]9 и гепатит C вирус [гепатита с]10), успех трансплантации 11, риск беременности расстройств и репродуктивный успех12,13, защиты от рецидивов после аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (ТГСК)14,15, 16и риск рака17.
Сочетание высокой последовательности гомологии и аллельные и haplotypic разнообразие представляет проблемы в задаче точно генотипирования Кир генов. Обычные методы типа Кир генов включают последовательности специфического праймера (SSP) полимеразной цепной реакции (ПЦР)18,19,20, специфичные для последовательности олигонуклеотида зонд PCR (SSOP)21, и Матрица помощь лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS)22. Недостатки этих методов являются, что они только обеспечивают частичное понимание генотип человека, а также трудоемкий для выполнения. Недавно секвенирование нового поколения (НГС) был применен к типу Кир Локус специально. Хотя этот метод является очень мощным, он может быть дорогим для запуска, и это требует много времени для проведения углубленного анализа и данных проверок.
qKAT является методом высок объём количественного PCR. В то время как обычные методы трудоемким и длительным, этот метод позволяет запускать почти 1000 образцов геномной ДНК (геномная ДНК) в течение пяти дней и дает Кир генотипа, а также номер копии гена. qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций, каждая из которых ориентирована на две Кир локусов и один ген ссылки Фиксированная копия числа в геноме (STAT6) используется для относительной квантификация гена Кир скопировать номер23. Этот assay успешно используется в исследованиях с участием большого числа панелей и когорты болезни на инфекционные заболевания, как гепатит с, аутоиммунные заболевания, как диабета типа 1 и беременность расстройств, таких как преэклампсия, а также предоставление генетических основу для исследований, направленных на понимание NK клеток функция1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

Иммуноглобулин подобные рецепторы клеток-киллеров (Кирс) представляют собой набор тормозящее и активация иммунных рецепторов, на природные убийца (НК) и Т-клеток, кодируемых кластер полиморфных генов на хромосоме 19. Их наиболее характерны лигандов являются человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) молекулы, которые кодируются в комплекс (MHC) локуса гистосовместимости на хромосоме 6. Есть существенные доказательства того, что они играют значительную роль в иммунитет, воспроизводства и трансплантации, что делает его крайне важно иметь методы, которые можно точно генотип их. Однако, высокий последовательности гомологии, а также аллельных и копии номер изменения, затрудняют методов проектирования, которые можно точно и эффективно генотип все гены Кир . Традиционные методы обычно ограничены в резолюции полученных данных, пропускная способность, эффективности затрат и времени для настройки и выполнения экспериментов. Мы описываем метод, называемый количественных Кир полуавтоматические ввода (qKAT), который является высок объём Мультиплекс в реальном времени полимеразной цепной реакции метод, который можно определить номера копии гена для всех генов в локусе Кир . qKAT представляет собой простой метод высокой пропускной способности, которая может обеспечить высоким разрешением Кир копирования числовые данные, которые могут в дальнейшем использоваться для выведения вариации в структурно полиморфных гаплотипов, что охватить их. Эта копия номер и гаплотип данные могут быть полезными для исследований на крупномасштабных болезни ассоциаций, популяционной генетики, а также расследований на выражение и функционального взаимодействия между Кир и HLA.

Watch this Scientific Journal Video about qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes at JoVE.com

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов

Количественные клеток-киллеров иммуноглобулина подобный рецептор (KIR) полуавтоматические ввод (qKAT) является простой, высокой пропускной способности и экономически метод, чтобы скопировать номер типа Кир генов для их применения в ассоциации исследований населения и болезней.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Этот метод может ответить на ключевые вопросы о генетике рецепторов НК-клеток, таких как разнообразие гаплотипа и как это связано с болезнью. Визуальная демонстрация этого метода поможет установить протокол в лаборатории, включая процесс автоматизации и анализ данных. Основными преимуществами этого метода являются то, что, в отличие от обычных методов, qKAT, который выступает за количественный KIR автоматизированного ввода, является высокой пропускной способностью и обеспечивает номер копии гена.qKAT может дать представление об ассоциации болезней. Последствия этого метода могут быть полезны для терапии вирусных инфекций, таких как ВИЧ и гепатит С, при раке, при трансплантации стволовых клеток и нарушениях беременности. qKAT также может быть применен при изучении генетики популяции, а также в изучении экспрессии и функциональных взаимодействий между молекулами KIR и HLA.qKAT состоит из 10 мультиплексных реакций, которые специально нацелены на экзоны двух генов KIR и одного эталонного гена. В этом протоколе, конкретные грунтовки предназначены для обнаружения аллелей данного гена и PCR результаты в коротких ампликонов. После этого для мониторинга усиления ПЦР в режиме реального времени используются специальные гидролизные зонды с двойной маркировкой.Анализ числа копий использует относительную количественную оценку целевых генов KIR для эталонного гена. qKAT разработан и настроен как высокая пропускная способность. Таким образом, каждая реакция может быть выполнена на чуть менее 1000 образцов.Следующие шаги показывают шаги, участвующие в подготовке и покрытие из каждого 96-хорошо пластины ДНК. Для начала, после количественной оценки ДНК, разбавить ДНК в 96-ну глубокой пластины. Включите по крайней мере один образец управления с известным номером копии и один элемент управления без шаблона.Центрифуга пластины на 450 г в течение двух минут. Затем, обойтись каждый образец в четыре раза в 384-хорошо qPCR пластин. После этого воздух высушит ДНК в чистом месте при комнатной температуре в течение 24 часов.Чтобы настроить одну реакцию qKAT для 10 пластин 384-колодец, во-первых, разморозить буфер qPCR, грунтовка, и зонд aliquots на четыре градуса по Цельсию. Подготовь мастер-микс на льду в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте многоканаражную пипету для равномерного распределения мастер-микса по 96-ну глубокой пластине.Выпределите 9,5 микролитров мастер-микса в каждый колодец пластины с высушенными образцами ГДНК. После этого, печать пластины с фольгой и сразу же хранить его при четырех градусах по Цельсию. Не забудьте выполнить короткую промывку воды, чтобы очистить иглы жидкой системы обработки, если дозирование мастер смеси на более чем одной 384-хорошо пластины ДНК.Центрифуга пластины с образцами ГДНК на 450 г в течение трех минут. Затем инкубировать пластину при 4 градусах по Цельсию, чтобы повторно использовать ДНК и рассеять любые пузырьки воздуха. После инкубации пластины на ночь, повторите центрифугу, чтобы рассеять любые пузырьки воздуха.Затем поместите тарелку в охлажденный док для хранения. Подключите машину qPCR к обработчику микроплатформ. Затем запрограммировать обработчик микроплатформ в соответствии с текстовым протоколом.После завершения пробега, закажите робота, соберите пластину из машины qPCR и поместите ее в док-станцию. После завершения усиления откройте программное обеспечение qPCR. Под вкладкой Navigator откройте файл эксперимента сохраненной реакции для пластины.Затем откройте окно Create New Analysis и выберите подходящие настройки для второго метода производного Max. Затем выберите Гребень фильтра и убедитесь, что данные, собранные для STAT6, выбраны. Выберите соответствующую цветовую компенсацию.Нажмите Рассчитайте, а затем нажмите сохранить файл. Для анализа данных с помощью метода Fit Points откройте новое окно анализа и выберите подходящие настройки для метода Fit Points. Затем выберите правильные фильтры и цветовые компенсации для STAT6.Установите шумовую полосу, чтобы исключить фоновый шум. После этого откройте вкладку Анализ и установите подходящие точки до трех, а также выберите Show Fit Points. Сохранить изменения и повторить шаги с соответствующими настройками для Fit Point и 2-й производный анализ для генов KIR.Откройте вкладку Navigator в программном обеспечении qPCR и выберите результаты экспорта пакетов. Затем откройте папку, содержащую файлы эксперимента, и перенесите их на правую сторону окна. Нажмите далее и выберите имя и местоположение экспортного файла.После этого выберите тип анализа интереса и нажмите Далее. Убедитесь, что имя файла, экспортная папка и тип анализа являются правильными, прежде чем нажать Далее, чтобы начать процесс экспорта. Когда статус экспорта изменяется до OK, экран автоматически переходит к следующему шагу.Убедитесь, что все выбранные файлы были успешно экспортированы и нажмите Готово. Затем используйте скрипты в текстовом протоколе, чтобы разделить экспортируемые пластины на отдельные реакции и преобразовать файлы в программное обеспечение, читаемое программным обеспечением для анализа номеров копий. Затем откройте программное обеспечение для анализа номеров копий и выберите файл результатов Import в режиме реального времени для загрузки текстовых файлов, созданных скриптами.Наконец, выберите анализ и проведем анализ, выбрав наиболее частый номер копии образца. В этом протоколе для копирования генов KIR был использован полуавтоматический тип ввода, или qKAT. Наиболее частым номером копии KIR2DL4 было два экземпляра, в то время как наиболее частый номер копии для KIR3DS1 был нулевым.При попытке этой процедуры, крайне важно убедиться, что ДНК количественно точно, провести все шаги на льду, и убедиться, что реагенты покрыты от света. Важно также провести тщательную проверку необработанных данных для образцов, которые не соответствуют известным правилам LD для генов KIR. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, наличие генов синтеза или идентификация новых аллелей.После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммуногенетики, чтобы исследовать роль KIR в биологии клеток НК, устойчивость к болезням, и воспроизводства человека.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Подготовка rAAV9 к гиперэкспрессией или Нокдаун Гены в мышиных сердец

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Использование GFP-меченый TMEM184A Построить подтверждения гепарин Receptor идентичности

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Метод для изучения полиморфизма C924T гена рецептора тромбоксана А2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

В Vivo Вперед генетический экран для выявления новых нейропротекторных генов в Drosophila меланогастер

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...