Name: qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00
Duration: 7 min 58 s
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El proyecto recibido financiamiento del Consejo de investigación médica (MRC), el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo no. 695551 de la subvención) y el Instituto Nacional de salud (NIH) de Cambridge Biomédica centro de investigación y NIH investigación sangre y trasplante de unidad de investigación (NIHR BTRU) en donación de órganos y trasplante en la Universidad de Cambridge y en colaboración con sangre de NHS y trasplante (NHSBT). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR, el Departamento de salud o la NHSBT.

1. preparación y galjanoplastia de ADN
<ol><li>Cuantificar con precisión la concentración del gDNA utilizando un instrumento de lectura espectrofotométrico o fluorométrico.</li>
	<li>Diluir el DNA a 4 ng/μL en una placa de 96 pozos pozos profundos. Incluyen al menos un control gDNA muestra con un número de copia conocido y un control no es de plantilla.</li>
	<li>Centrifugue las placas de 96 pocillos en 450 x g durante 2 minutos.</li>
	<li>Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar cada muestra por cuadruplicado en placas de 384 pozos qPCR para que cada bien tiene 10 ng de ADN (2,5 μL/pocillo). Preparar por lo menos diez placas de 384 pozos, uno para cada reacción de qKAT.</li>
	<li>Si gDNA es ser despachado desde más de una placa de 96 pocillos, realice un lavado completo volumen con 2% de blanqueador y agua ultrapura para limpiar las agujas del sistema entre cada placa de 96 pocillos de gDNA muestras para manejo de líquidos.</li>
	<li>Secar el ADN por las placas de 384 pozos en un área limpia a temperatura ambiente durante al menos 24 h de incubación.</li>
</ol>2. preparación de los cebadores y sondas
Nota: qKAT consta de diez reacciones multiplexores. Cada reacción incluye tres pares de cartilla y tres sondas marcadas con fluorescencia que amplifican específicamente dos genes KIR y una referencia gene. Los sondeos publicados en Jiang et al.27 fueron modificados para que los oligonucleótidos están marcados ahora con tintes ATTO ya que ofrecen mayor fotoestabilidad y vida larga de la señal. Combinaciones de cartilla pre-alícuotas están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Preparar combinaciones de cartilla para cada reacción según las diluciones dado en la tabla 1.</li>
	<li>Preparar la sonda combinaciones para cada reacción según la tabla 1. Prueba de cada prueba individual antes de hacer la combinación.</li>
</ol>3. preparación del Master Mix
Nota Los volúmenes que se mencionan a continuación son para realizar una reacción de la qKAT en un conjunto de placas 10 x 384 pocillos.
<ol><li>Asegurar que las muestras del gDNA plateadas en las placas de 384 pozos estén completamente secas. Realizar todos los pasos en el hielo y mantenga los reactivos de exposición a la luz tanto como sea posible ya que las sondas marcadas con fluorescencia son foto y termo-sensibles.</li>
	<li>Descongelar el búfer de qPCR, cartilla y sonda alícuotas a 4 º C.</li>
	<li>En el hielo, preparar una mezcla maestra para placas de 10 x 384 pocillos añadiendo 18,86 mL de agua ultrapura, 20 mL de tampón de qPCR, 1000 μl de combinación de confeccionar la cartilla y 180 μl de combinación de confeccionar sonda (tabla 2).</li>
	<li>Distribuir uniformemente la mezcla principal a través de una placa de 96 de profundidad bien usando una pipeta multicanal, pipeteo 415 μL en cada pocillo. Mantenga esta placa en una caja de hielo cubierta de la luz.</li>
	<li>Utilizando un instrumento de manejo de líquidos, dispensar 9,5 μl de la mezcla principal en cada pocillo de la placa de 384 pozos con gDNA seco. Sellar la placa con una hoja y colóquelo inmediatamente a 4 ° C. Repita este proceso para las placas restantes, asegurando que las agujas del sistema de manejo de líquido se lavan con agua entre cada placa.</li>
	<li>Centrifugue las placas de 384 pozos a 450 x g durante 3 min e incúbelos a 4 ° C durante la noche o entre 6-12 h para Resuspender el ADN y para disipar cualquier burbuja de aire.</li>
</ol>4. Análisis de qPCR
<ol><li>Después de la incubación durante la noche, centrifugar a 450 x g durante 3 min disipar las burbujas de aire restante.</li>
	<li>Para efectos de la automatización, conectar la máquina de qPCR (p. ej., el LightCycler 480) a un controlador de microplacas (véase Tabla de materiales). Programa el controlador de microplacas para colocar las placas en la máquina de qPCR de un muelle de almacenamiento refrigerado protegido de la luz. Nota los ensayos deberían, en teoría, trabajar en otras máquinas de qPCR con configuración óptica compatible.</li>
	<li>Utilice las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C por 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s y 66 ° C para 50 s, con recogida de datos a 66 ° C.</li>
	<li>Una vez finalizado el plazo, tiene el robot recoge la placa de la máquina de qPCR y colocarlo en el dock de descarte.</li>
</ol>5. la ejecución de análisis
<ol><li>Después de la amplificación, calcular los valores de ciclo (Cq) de cuantificación usando el segundo método máximo derivado o el método de puntos de ajuste con el software de la máquina de qPCR (véase Tabla de materiales), siguiendo los pasos siguientes.</li>
	<li>Abra el software de qPCR y, en la pestaña del navegador , abra el archivo de experimento de reacción guardados para una placa.</li>
	<li>
Para el análisis el método segundo derivado máximo, seleccione la ficha de análisis y crear un nuevo análisis mediante método Abs Quant/Second derivado máximo.
	<ol>
<li>En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de Abs Quant/Second derivado de Max, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: Rx-DFO (donde x es el número de reacción).</li>
		<li>Seleccione Filtro peine y elija VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Esto asegura que los datos recogidos para STAT6 está seleccionados.</li>
		<li>Seleccione Compensación cromática para VIC/HEX/Yellow555(533-580). Haga clic en calcular. Repetir este proceso para Fam (465-510) y Cy5/Cy5.5(618-660). Haga clic en Guardar archivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para el análisis mediante el método de puntos de ajuste, seleccione Abs Quant/ajuste puntos en la ficha de análisis.
	<ol>
<li>En la ventana de crear un nuevo análisis , seleccionar tipo de análisis: método de puntos de ajuste de Quant Abs, subconjunto: todas las muestras, programa: amplificación, nombre: RxF DFO (donde x es el número de reacción).</li>
		<li>Seleccione los filtros correctos y compensaciones color de STAT6 y cada uno de los genes KIR (Fam/Cy5). En la ficha de Noiseband , ajuste la banda de ruido para excluir el ruido de fondo.</li>
		<li>En la ficha de análisis , establecer los puntos de ajuste a 3 y seleccione que mostrar puntos de ajuste. Haga clic en calcular. Haga clic en Guardar archivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. exportación de los resultados
<ol><li>En el software de la qPCR, abrir el navegador ficha seleccionar Resultados por lotes de exportación.</li>
	<li>Abra la carpeta en la que los archivos del experimento se guardan y transferir los archivos en la sección derecha de la ventana. Haga clic en siguiente. Seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.</li>
	<li>Seleccione el tipo de análisis método Abs Quant/Second derivado de Max o Abs Quant/ajuste puntos. Haga clic en siguiente. Compruebe que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correcto y haga clic en siguiente para iniciar el proceso de exportación.</li>
	<li>Espere hasta que el Estado de exportación es aceptable. La pantalla se moverá automáticamente al paso siguiente. Compruebe que todos los archivos seleccionados se han exportado con éxito para que el número de archivos de error = 0. Haga clic en hecho.</li>
	<li>Utilizar secuencias de comandos split_file.pl y roche2sds.pl para dividir las placas exportadas en reacciones individuales para cada plato. Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub.</li>
</ol>7. copiar el número de cálculos
<ol><li>Abra el software de análisis número de copia (por ejemplo, CopyCaller). Seleccione Importar archivo de resultados PCR en tiempo real y carga archivos de texto creados por roche2sds.pl.</li>
	<li>Seleccione analizar y realizar el análisis por cualquier selección muestra calibrador con número de copia conocido o seleccionando el número de copia más frecuente. Vea la tabla 5 para el número más frecuente de la copia de genes KIR típicamente observados en las poblaciones de origen europeo.</li>
</ol>8. calidad de los datos verifica
<ol><li>Utilizar el script de R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R para combinar datos del número de copia de todas las placas en una hoja de cálculo. Nota las secuencias de comandos se incluyen en la solicitud/GitHub.</li>
	<li>Vuelva a verificar los datos sin procesar en el software de análisis número de copia para las muestras que no cumplen con el conocido ligamiento (LD) de los genes KIR (tabla 6).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors.">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li><li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+++HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa.">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li><li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+(HLA)+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+(KIR)+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans.">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+(KIR)+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population.">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li><li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+killer+cell+immunoglobin-like+receptors+genes+in+the+Italian+Caucasian+population.">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li><li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A*11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C.">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li><li>B&#233;ziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology.">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li><li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans.">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li><li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS.">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li><li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection.">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation.">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li><li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage.">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li><li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia.">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li><li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model.">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li><li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation.">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li><li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia.">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li><li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR2DS1,+2DS5,+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians.">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li><li>Vilches, C., Casta&#241;o, J., G&#243;mez-Lozano, N., Estefan&#237;a, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments.">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li><li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling.">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li><li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+locus+polymorphisms:+genotyping+and+disease+association+analysis.">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li><li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+(KIR)+gene+sequence+repertoires.">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li><li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles.">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families.">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li><li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection:+Evidence+for+discrete+immunological+pathways.">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li><li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2DL1,+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells.">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qKAT:+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination.">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos un nuevo método semiautomático de alto rendimiento, llamado qKAT, que facilita la copia número tipificación de genes KIR . El método es una mejora sobre los métodos convencionales como SSP-PCR, que son de bajo rendimiento y sólo pueden indicar la presencia o ausencia de estos genes altamente polimórficos.
La exactitud de los datos del número de copia obtenidas depende de múltiples factores, incluyendo la calidad y uniformidad de la concentración de las muestras del gDNA y la calidad de los reactivos. La calidad y precisión de las muestras del gDNA a través de una placa son muy importantes ya que las variaciones en la concentración a través de la placa pueden resultar en errores en el cálculo del número de copia. Puesto que los análisis se validaron utilizando conjuntos de muestra de origen Europea, datos de cohortes de otras partes del mundo requieren controles más a fondo. Esto es para asegurar que casos de deserción del alelo o atascamiento no específico primer punta de prueba no son malinterpretados como variación en número de copias.
Mientras que los ensayos fueron diseñados y optimizados para funcionar como alto rendimiento, puede ser modificados para ejecutar menos ejemplos. La métrica de confianza en el software de análisis número de copia es afectada cuando se analizan menos muestras, pero esto puede mejorarse si se incluyen muestras de ADN genómicas de control con un conocido número de copia de genes KIR en la placa y muestra más repeticiones incluido.
Laboratorios sin líquido y placa-manipulación de robots, mezcla principal puede dispensar utilizando pipetas de varios canales y placas pueden cargarse manualmente en el instrumento de la qPCR.
El objetivo principal detrás del desarrollo de qKAT fue crear un método de alto rendimiento, alta resolución y rentable simple, genotipo IIC para enfermedad estudios de asociación. Esto fue alcanzado con éxito ya que qKAT se ha empleado en la investigación sobre el papel de KIR en varios estudios de Asociación de enfermedad grande, incluyendo una gama de enfermedades infecciosas, condiciones autoinmunes y embarazo trastornos4, 24 , 25 , 26.

En los seres humanos, el asesino inmunoglobulina-como receptor(KIR) lugar geométrico se mapea en el brazo largo del cromosoma 19 en el complejo receptor del leucocito (LRC). Este lugar geométrico es alrededor de 150 kb de longitud e incluye 15 KIR genes dispuestos cabeza a cola. Los loci KIR que actualmente se conocen son KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3 KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, 5 KIR2DS1, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1. Los genes KIR codifican para dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) dominio de inmunoglobulina-como los receptores con poco (S; activar) o largo (L; inhibitorio) colas citoplasmáticas, que son expresadas por las células asesinas naturales (NK) y los subconjuntos de T células. Variación en número de copias expuestas dentro de las formas de locus KIR diversos haplotipos con gen variable contenido1. Recombinación homóloga no alélica (NAHR), facilitado por un arreglo cerca gene de cabeza a la cola y la secuencia de alta homología, es el mecanismo propuesto para ser responsable de la variabilidad haplotypic. Han reportado más de 100 diferentes haplotipos en las poblaciones en todo el mundo1,2,3,4. Estos haplotipos se pueden dividir en dos grandes grupos: los haplotipos A y B. El haplotipo A contiene 7 genes KIR : KIR3DL3 KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1y KIR3DL2, que son genes KIR inhibitorios y la activación KIR gen KIR2DS4. Sin embargo, hasta 70% de individuos de origen europeo que son homocigotos para el haplotipo KIR A exclusivamente llevar una forma no funcional "eliminación" de KIR2DS45,6. Todas otras combinaciones de genes KIR forman haplotipos del grupo B, incluyendo al menos uno de los genes KIR específicos KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, y KIR2DL5y por lo general incluyen dos o más genes KIR activadoras.
Las moléculas HLA de clase I han sido identificados como ligandos para ciertos receptores inhibitorios (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3y KIR3DL1), activando Receptores (KIR2DS1 KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5y KIR3DS1), y para KIR2DL4, que es un único KIR que contiene una cola citoplásmico largo como otros receptores KIR inhibitorios, pero también tiene un residuo cargado positivamente cerca del dominio extracelular que es común característica de otros receptores KIR activadoras. La combinación de variantes dentro de los genes KIR y los genes HLA influye en la interacción del ligando del receptor formas potenciales NK célula capacidad de respuesta en el nivel individual7,8. Evidencia de los estudios de asociación genética ha indicado que KIR desempeña un papel en la resistencia viral (por ejemplo., virus de la inmunodeficiencia humana [VIH]9 y hepatitis C [VHC] de virus10), el éxito del trasplante 11, el riesgo de trastornos del embarazo y de éxito reproductivo12,13, la protección contra la recaída después de alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) del trasplante14,15, 16y el riesgo de cáncer17.
La combinación de secuencia de alta homología y alélicas y haplotypic diversidad presenta desafíos en la tarea de con precisión los genes KIR genotyping. Métodos convencionales para escribir genes KIR incluyen cartilla de secuencia específica (SSP) polimerasa reacción en cadena (PCR)18,19,20, sonda de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSOP) PCR21, y láser asistida por matriz desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS)22. Los inconvenientes de estas técnicas son que sólo proporcionan información parcial sobre el genotipo de un individuo mientras que también siendo laborioso realizar. Recientemente se ha aplicado secuenciación de próxima generación (NGS) para escribir el locus KIR específicamente. Mientras que este método es muy potente, puede ser costoso de ejecutar y es desperdiciador de tiempo para llevar a cabo controles de datos y análisis profundo.
qKAT es un método cuantitativo de PCR de alto rendimiento. Mientras que los métodos convencionales son laborioso y desperdiciador de tiempo, este método hace posible ejecutar casi 1.000 muestras genomic de la DNA (gDNA) en cinco días y le da el genotipo KIR , así como el número de copias del gen. qKAT consiste en diez reacciones múltiplexes, cada una de ellas apunta a dos loci KIR y un gen de referencia de un número fijo de copia en el genoma (STAT6) utilizado para la cuantificación relativa de los genes KIR Copiar número23. Este análisis se ha utilizado con éxito en estudios que involucran población paneles y cohortes de enfermedad en enfermedades infecciosas como el VHC, condiciones autoinmunes como la diabetes tipo 1 y trastornos del embarazo como preeclampsia, así como proporcionar una genética apoyo a estudios dirigidos a entender el NK célula función1,4,24,25,26.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probes labelled with ATTO dyes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>SEQUENCES: Listed in Table 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-86020</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
			<td>&#8722;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with a swinging bucket rotor</td>
			<td>Eppendorf(or equivalent)</td>
			<td>Eppendorf 5810R or equivalent system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuBit Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Hydra</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>109611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05015243001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister II Microplate Handler with M&#233;Cour Thermal Plate Stacker (M&#233;Cour)</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>204135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010201-AAA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-channel pipettes (volume range: 0.5&#8211;10 &#181;L, 2&#8211;20 &#181;L, 20&#8211;200 &#181;L, 200&#8211;1,000 &#181;L; 1-10 mL)</td>
			<td>Gilson(or equivalent)</td>
			<td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 &#181;L, 20 &#181;L, 200 &#181;L, 1,000 &#181;L, 10 mL)</td>
			<td>Starlab (or equivalent)</td>
			<td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E2310-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>STARLAB</td>
			<td>E1450-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12194162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC480 384 Multi-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729749001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAME</td>
			<td>COMPANY</td>
			<td>CATALOG NUMBER</td>
			<td>COMMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIR haplotype identifier</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qkat: quantitative semi-automated typing of killer-cell immunoglobulin-like receptor genes

Receptores de inmunoglobulina-como las células Killer (IIC) son un conjunto de receptores inmunes inhibidoras y activadoras, natural killer (NK) y células T, codificadas por un clúster polimórfico de los genes en el cromosoma 19. Sus ligandos mejor caracterizadas son las moléculas de leucocito humano antígeno (HLA) que se codifican en el locus de (MHC) complejo principal de histocompatibilidad en el cromosoma 6. Hay pruebas sustanciales de que juegan un papel importante en inmunidad, reproducción y trasplante, lo que es fundamental contar con técnicas que pueden con exactitud el genotipo de ellos. Sin embargo, secuencia de alta homología, así como alélica y variación en número de copias, dificulta a genotipo y eficiente los métodos de diseño que pueden exactamente todos los genes KIR . Los métodos tradicionales se limitan generalmente en la resolución de los datos obtenidos, rendimiento, rentabilidad y el tiempo necesario para establecer y ejecutar los experimentos. Describimos un método llamado cuantitativa KIR semiautomático escribir (qKAT), que es un método de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real multiplex de alto rendimiento que puede determinar el número de copia del gene de todos los genes en el locus KIR . qKAT es un método simple de alto rendimiento que puede ofrecer alta resolución KIR copia datos del número, que además permite inferir las variaciones en los haplotipos estructuralmente polimórficos que abarcan los. Estos datos copia número y haplotipo pueden ser beneficiosos para los estudios sobre asociaciones a gran escala enfermedad, genética de la población, así como las investigaciones sobre la expresión y las interacciones funcionales entre KIR y HLA.

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qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: semiautomáticos cuantitativa escribiendo de la asesino-célula inmunoglobulina-como Receptor de Genes

Cuantitativa la célula de asesino inmunoglobulina-como receptor (KIR) semiautomático escribir (qKAT) es un método simple, de alto rendimiento y rentable para copiar número genes KIR de tipo para su aplicación en estudios de Asociación de población y enfermedades.

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Este método puede responder preguntas clave sobre la genética de los receptores de células NK, como la diversidad del haplototipo y cómo esto se relaciona con la enfermedad. La demostración visual de este método ayudará a establecer el protocolo en su laboratorio, incluido el proceso de automatización y el análisis de datos. Las principales ventajas de esta técnica son que, a diferencia de los métodos convencionales, qKAT, que significa escritura automatizada KIR cuantitativa, es de alto rendimiento y proporciona el número de copia genética.qKAT puede proporcionar información sobre la asociación de enfermedades. Las implicaciones de esta técnica pueden ser útiles para la terapia para infecciones virales como el VIH y la hepatitis C, en el cáncer, en el trasplante de células madre y los trastornos del embarazo. qKAT también se puede aplicar en el estudio de la genética de la población, así como explorar la expresión y las interacciones funcionales entre las moléculas kir y HLA.qKAT consta de 10 reacciones multiplex que se dirigen específicamente a exones de los dos genes KIR y un gen de referencia. En este protocolo, las imprimaciones específicas están diseñadas para detectar los alelos del gen dado y los resultados de la PCR en amplicons cortos. Después de esto, las sondas de hidrólisis específicas de doble etiqueta se utilizan para monitorear la amplificación de PCR en tiempo real.El análisis de números de copia utiliza la cuantificación relativa de los genes KIR objetivo a un gen de referencia. qKAT está diseñado y configurado para ser una técnica de alto rendimiento. Por lo tanto, cada reacción se puede realizar en poco menos de 1.000 muestras.Los siguientes pasos muestran los pasos involucrados en la preparación y chapado de cada placa de ADN de 96 pozos. Para empezar, después de cuantificar el ADN, diluir el ADN en una placa de pozo profundo de 96 pozos. Incluya al menos un ejemplo de control con un número de copia conocido y un control que no sea de plantilla.Centrifugar la placa a 450 gs durante dos minutos. A continuación, dispensar cada muestra en cuadrúplica en placas qPCR de 384 pozos. Después de esto, seque al aire el ADN en un área limpia a temperatura ambiente durante 24 horas.Para configurar una reacción qKAT para 10 placas de 384 pozos, primero, descongele el búfer qPCR, la imprimación y las alícuotas de sonda a cuatro grados centígrados. Prepare la mezcla maestra sobre hielo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice una pipeta multicanal para distribuir la mezcla maestra uniformemente a través de una placa de pozo profundo de 96 pozos.Dispensar 9,5 microlitros de la mezcla maestra en cada pozo de la placa con las muestras de gDNA secas. Después de esto, selle la placa con papel de aluminio e inmediatamente guárdela a cuatro grados centígrados. Recuerde realizar un lavado corto de agua para limpiar las agujas del sistema de manipulación de líquidos si dispensa la mezcla maestra en más de una placa de ADN de 384 pozos.Centrifugar la placa con las muestras de gDNA a 450 gs durante tres minutos. Luego, incuba la placa a 4 grados celsius para resuspender el ADN y disipar cualquier burbuja de aire. Después de incubar la placa durante la noche, repita la centrifugación para disipar cualquier burbuja de aire.A continuación, coloque la placa en el muelle de almacenamiento refrigerado. Conecte la máquina qPCR a un controlador de microplacas. A continuación, programe el controlador de microplacas de acuerdo con el protocolo de texto.Una vez completada la carrera, pida al robot que recoja la placa de la máquina qPCR y colóquela en el muelle de descarte. Después de completar la amplificación, abra el software qPCR. En la pestaña Navegador, abra el archivo de experimento de reacción guardado para una placa.A continuación, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el 2do método Derivative Max. A continuación, seleccione Filter Comb y asegúrese de que los datos recopilados para STAT6 están seleccionados. Seleccione la compensación de color adecuada.Haga clic en Calcular y, a continuación, haga clic en Guardar archivo. Para analizar los datos con el método Puntos de ajuste, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el método Puntos de ajuste. A continuación, seleccione los filtros y las compensaciones de color correctos para STAT6.Establezca la banda de ruido para excluir el ruido de fondo. Después de esto, abra la pestaña Análisis y establezca los puntos de ajuste en tres y seleccione Mostrar puntos de ajuste. Guarde los cambios y repita los pasos con la configuración adecuada para el análisis de punto de ajuste y 2o derivado para los genes KIR.Abra la pestaña Navegador en el software qPCR y seleccione Exportación por lotes de resultados. A continuación, abra la carpeta que contiene los archivos del experimento y transfiéralos al lado derecho de la ventana. Haga clic en Siguiente y seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.Después de esto, seleccione el tipo de análisis de interés y haga clic en Siguiente. Asegúrese de que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correctos antes de hacer clic en Siguiente para iniciar el proceso de exportación. Cuando el estado de exportación cambia a Aceptar, la pantalla se moverá automáticamente al siguiente paso.Asegúrese de que todos los archivos seleccionados se han exportado correctamente y haga clic en Listo. A continuación, utilice los scripts en el protocolo de texto para dividir las placas exportadas en reacciones individuales y para convertir los archivos en un software legible por software de análisis de números de copia. A continuación, abra el software de análisis de números de copia y seleccione Importar archivo de resultados de PCR en tiempo real para cargar los archivos de texto creados por los scripts.Por último, seleccione Analizar y realice el análisis seleccionando Número de copia de muestra más frecuente. En este protocolo, se utilizó la escritura semiautomática, o qKAT, para copiar genes KIR de tipo numérico. El número de copia más frecuente para KIR2DL4 era de dos copias, mientras que el número de copia más frecuente para KIR3DS1 era cero.Al intentar este procedimiento, es extremadamente importante asegurarse de que el ADN se cuantifica con precisión, para llevar a cabo todos los pasos sobre el hielo, y para asegurarse de que los reactivos están cubiertos de luz. También es importante realizar controles exhaustivos de los datos sin procesar de las muestras que no se ajustan a las reglas de LD conocidas para los genes KIR. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación para responder preguntas adicionales, por ejemplo, la presencia de genes de fusión, o la identificación de nuevos alelos.Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunogenética exploraran el papel de la KIR en la biología celular NK, la resistencia a las enfermedades y la reproducción humana.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

El uso de Inducida somática Análisis del Sector (ISSA) para el estudio de genes y promotores implicados en la formación de la madera y el desarrollo del tallo Secundaria

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Investigación

Genética

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Preparación de rAAV9 que sobreexpresan o una caída en los genes de ratón Corazones

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

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Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

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Un método para el estudio del polimorfismo C924T del gen Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

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Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

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In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

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There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...