Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de NIH intramurale subsidie aan Dr. Alan N. Schechter.

Opmerking: Bloedmonsters werden verkregen NIH bloedbank (IRB protocol goedgekeurd: 99-CC-0168).
1. bloed monster voorbereiding
Opmerking: Om te voorkomen dat bloedplaatjes activering, tekenen bloed langzaam en meng zachtjes met citraat door het omkeren van de buis meerdere malen.
<ol><li>
Platelet-rich plasma (PRP) voorbereiding
	<ol>
<li>Tekenen van 30-50 mL bloed met behulp van een 20 G ...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Aangezien de bloedplaatjes zijn gemakkelijk geactiveerd, zachte behandeling van bloedplaatjes-bevattende monsters is vereist. Snelle pipetteren en krachtig schudden moet worden vermeden. Bloedplaatjes remmers zoals prostacyclin ("BGA"2) kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat bloedplaatjes activering; Nochtans, kan dit sommige signaalroutes binnen de bloedplaatjes beïnvloeden. Voor de bereiding van bloedplaatjes pellets, we ACD toevoegen aan de bloedplaatjes schorsingen en gebruiken van lage snelheid centr...

Bloedplaatjes zijn kleine schijf-vormige cel fragmenten afgeleid van megakaryocytes, die cruciaal zijn voor de bloedstolling. De bloedstolling cascade wordt geïnitieerd door verschillende biologische actieve moleculen (zoals collageen of ADP), vrijgegeven na de verwonding van vasculaire muur. Het bloed bloedstolling proces kan worden gewijzigd, onder verschillende effectoren door stikstofmonoxide (NO). Nee, natuurlijk geproduceerd door cellen van zoogdieren, is een van de meest veelzijdige fysiologische signalen. Het fungeert als een krachtige vaatverwijdende, neurotransmitter en immune modulator, een paar van de vele functies te noemen. In de bloedbaan, helpt niet ook om het reguleren van de omvang van de bloedstolling door remming van de aggregatie van de bloedplaatjes. Een van de meest waarschijnlijke bronnen voor NO in de bloedbaan is nitriet, een anorganische ion dat is getoond om te dienen als een voorloper van nr. Reactie met rode bloedcellen (RBC), nitriet wordt verminderd op Nee en deoxyHb is geoxideerd tot methemoglobine (metHb)1. NO verlost van RBC is vasoactieve en veroorzaakt vasorelaxation2. Dit nitriet vermindering traject is een alternatief geen generatie traject, optreden samen met en als aanvulling op de klassieke geen generatie pad door endothelial stikstofoxide synthase bij hypoxische voorwaarden.
Bloedplaatjes zelf zijn niet kundig voor nitriet in NO verminderen maar zijn zeer gevoelig voor haar aanwezigheid. In intact Trombocyten, niet in de nanomolar bereik vergroot cGMP (EG50 = 10 nM) en fosforylering van VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Daarom, bloedplaatjes kunnen dienen als een uitstekende sensor van nitriet reductie tegen RBC en geen introductie in bloed. Er zijn verschillende methoden die direct van de omvang van de activatie van de bloedplaatjes - zoals aggregometry en thromboelastography (TEG meten kunnen)4,5. Echter, deze methoden vereisen dure gespecialiseerde instrumentatie en vrij grote hoeveelheden materiaal. Het is ook mogelijk om gebeurtenissen te controleren downstream, na Nee wordt vrijgelaten uit de RBC, met behulp van de wijzigingen in bloedplaatjes oppervlakte-proteïne expressie – zoals de P-selectine6. Nee is ook bekend om de hoeveelheid cGMP in de bloedplaatjes7te verhogen. Wij vroeger cGMP geen introductie in bloed te controleren na de nitriet verkleining door gedeoxygeneerd RBC8. Dit bleek een zeer gevoelige methode; echter cGMP is een kortstondige molecule en de detectie omvat uitgebreide arbeid. Een andere mogelijkheid, zoals beschreven in het voorgestelde protocol, maakt gebruik van fosforylering van de phospho van vaatverwijdende-gestimuleerd (VASP)-eiwit op de aanwezigheid van NO in het bloed. VASP is een substraat van proteïne kinase G activering, die op de interactie met NO t/m de sGC/cGMP traject9is phosphorylated. Detecteerbare VASP fosforylatie treedt op bij zeer lage NO concentraties, ertoe dat bloedplaatjes een zeer gevoelige detector van geen aanwezigheid in het bloed leiden kunnen. VASP is sterk uitgedrukt in bloedplaatjes, maar niet in andere cellen van het bloed, waardoor de gebeurtenissen waarbij bloedplaatjes10selectief te volgen.
Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven de methode gedetailleerd voor de detectie van geen vrijgave in volbloed zijn interactie met bloedplaatjes via toezicht VASP fosforylatie11,12. De beschreven methode maakt de vroege ontdekking van lage geen concentraties - theoretisch in het bereik van nanomolar, waardoor dit protocol gevoeliger dan cGMP bepaling, als gevolg van het gebruik van standaard westelijke vlek technieken haalbaar in meeste laboratorium Instellingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Bloedplaatjes zijn de bloedbestanddelen die verantwoordelijk zijn voor een goede bloedstolling. Hun functie is sterk gereguleerd door verschillende trajecten. Een van de meest potente vasoactieve agenten, stikstofmonoxide (NO), kan ook fungeren als een krachtige remmer van aggregatie van de bloedplaatjes. Direct is geen detectie in bloed zeer uitdagend vanwege haar hoge reactiviteit met cel-vrij hemoglobine geen half-life naar de milliseconde bereik te beperken. Op dit moment geen wijzigingen na interventies zijn slechts geraamd op basis van gemeten wijzigingen nitriet en nitraat (leden van de nitraat-nitriet-NO metabolische weg). Echter precieze, deze metingen zijn lastig te interpreteren vis een vis werkelijke geen veranderingen, als gevolg van de natuurlijk hoge basislijn nitriet en nitraat niveaus die verschillende ordes van grootte hoger dan verwachte wijzigingen van geen zelf. Daarom is de ontwikkeling van directe en eenvoudige methoden die het mogelijk een maken te detecteren NO direct allang. Dit protocol adressen een potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige geen sensor in bloed. Het beschrijft eerste platelet rich plasma (PRP) en gewassen bloedplaatjes preparaten en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als geen generatoren. Fosforylering van VASP op serine 239 (P-VASPSer239) wordt gebruikt voor het detecteren van de aanwezigheid van nr. Het feit dat VASP eiwit sterk in bloedplaatjes uitgedrukt wordt en dat het snel is phosphorylated als er geen aanwezig leidt tot een unieke kans om dit traject kunt direct geen aanwezigheid in het bloed.

Veneuze bloedmonsters hebben pO2 waarden tussen 50-80 mmHg. Deoxygenering van helium vermindert snel pO2 tot 25 mmHg binnen 10 min. verhoogde deoxygenering tijd iets verder daalt pO2. Meer tijd voor deoxygenering leidt echter ook tot aanzienlijk hogere niveaus van cel-vrije hemoglobine (bepaald door co Oximeter, visueel gezien op Figuur 2 als steeds meer rode verkleuring van plasma) (Figuur 2A</str...

Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Hier presenteren we een protocol om het potentiële gebruik van bloedplaatjes als een hooggevoelige stikstofmonoxide sensor in bloed. Het beschrijft eerste bloedplaatjes voorbereiding en het gebruik van nitriet en gedeoxygeneerd rode bloedcellen als stikstofmonoxide generatoren.

Bloedplaatjes gebaseerde detectie van stikstofmonoxide in bloed door het meten van VASP fosforylatie

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Dit protocol richt zich op het mogelijke gebruik van bloedplaatjes als zeer gevoelige stikstofmonoxidesensor, zowel in vitro als in vivo in het bloed. Verhoogde fosforylated Vasodilator-Gestimuleerde Fosphoprotein of P-VASP serine 239 in bloedplaatjes stikstofmonoxide heeft een aantal voordelen, waaronder het vermogen om de aanwezigheid van stikstofmonoxide in nanomoerische geslachten te detecteren. Binnen twee uur na het verzamelen van 30 tot 50 milliliter volbloed van een gezonde donor, voeg vijf milliliter aliquots van het bloed in het juiste aantal van 15 milliliter conische buizen voor centrifugatie.Gebruik een plastic transfer pipet om het bloedplaatjesrijke plasma voorzichtig te verzamelen uit het bovenste gedeelte van de supernatants. Pellet de plasma-rijke bloedplaatjes met een tweede centrifugatie en voorzichtig wassen van de pellets in vijf milliliter CGS buffer. Centrifuge op 400 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Aan het einde van de centrifugatie, resuspend de pellets in drie milliliter van gemodificeerde Tyrode buffer. Gebruik een hemocytometer voor het tellen en pas de dichtheid van de bloedplaatjessuspensiesussenspensies aan op drie keer 10 tot de achtste cellen per milliliter in de verse Tyrode-buffer. Dan incubeer de bloedplaatjes schorsingen voor een uur op 37 graden Celsius.Verzamel ondertussen de rode bloedcellen uit de plaatvrije plasmalagen van de bloedmonsters door centrifugatie, gevolgd door vier wasbeurten in vijf milliliter PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, gooi de supernatants en meng de rode bloedcellen met een milliliter van de plasma-rijke bloedplaatjes op de juiste experimentele hematocriet in polypropyleen flessen gesloten met rubberstoppers. Steek een naald aangesloten op een helium gastank in elke septa en steek 26 meter naalden om gasuitlaten te maken.Draai vervolgens langzaam de flessen op kamertemperatuur en gebruik een oximeter om de gedeeltelijke zuurstofdruk te meten voor het monitoren van het zuurstofproces. De snelheid van zuurstofdaling is afhankelijk van de heliumstroomsnelheid en de roersnelheid. Daarom moet de tijd van de oxygenatie worden geoptimaliseerd voordat een experiment wordt begonnen, omdat dit sterk afhankelijk is van de geometrie van de experimentele opstelling.Voor de vermindering van nitriet in rode bloedcellen gebruikt u een microsyringe om nitriet via het septum in de zuurstofarme monsters van PRP en RBC's te injecteren, zodat een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar wordt bereikt. Incubeer de monsters gedurende ten minste 10 minuten bij 37 graden Celsius en breng één milliliter van elk monster over in een microcentrifugebuis voor centrifugatie. Breng 300 microliter bloedplaatjessuspensie van het bovenste gedeelte van de supernatants over in nieuwe microcentrifugebuizen en voeg zuurcitraatdextrose toe aan elke buis met een verhouding van één tot negen.Centrifugeren de bloedplaatjes opnieuw en resuspend de pellets in 80 microliters van ijskoude lyse buffer met proteaseremmer cocktail drie aan elke buis. Laad vervolgens 15 microgram eiwit uit elk monster tot twee afzonderlijke 10% SDS-PAGE gels. Voer de gels op 120 volt gedurende 1,3 uur.Breng de gels aan het einde van de run over op individuele stikstofcellulosemembranen en blokkeer elke niet-specifieke binding met een passend volume van 5%vetvrije droge melk. Incubeer de membranen met de juiste primaire antilichamen 's nachts bij vier graden Celsius, gevolgd door etikettering met een geschikte secundaire paardenradoxidase antilichaam gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Stel vervolgens de membranen bloot met een imager om de banddichtheid te kwantificeren met een geschikt beeldanalyseprogramma.Gezonde veneuze bloedmonsters hebben gedeeltelijke zuurstofdrukwaarden tussen 50 tot 80 millimeter kwik. Deoxgenatie door helium vermindert snel de gedeeltelijke druk van zuurstof tot 25 millimeter kwik binnen 10 minuten. Verdere vermindering van de gedeeltelijke zuurstofdruk kan worden bereikt met een verhoogde deoxygenatietijd.Verhoogde deoxygenatie leidt tot verhoogde niveaus van hemolyse zoals aangegeven door steeds rode kleurenplasma. Dit is een effect van deoxygenatie en wordt niet veroorzaakt door zelf te roeren, zoals aangegeven door het gebrek aan hemolyse in monsters geroerd zonder helium. Zowel Vasodilator-Gestimuleerde Fosfor of VASP en Fosforylated-VASP expressie niveaus in bloedplaatjes daalde met toenemende hematocriet in zuurstofarme monsters zoals gedetecteerd door westerse vlek.Behandeling met een kortlevende stikstofmonoxidedonor verhoogt de fosforyleerde vaatverwijdende fosfoverexpressie in bloedplaatjes binnen 10 seconden na de behandeling. Verder bleven de niveaus van fosforylated-VASP of P-VASP stabiel tot 10 minuten na incubatie van de NO-donor met bloedplaatjesrijk plasma, wat aangeeft dat er voldoende tijd is om RBC's van bloedplaatjes te scheiden zonder dat dit gevolgen heeft voor de bestaande P-VASP-niveaus. Nitriet verhoogt ook de P-VASP-niveaus van bloedplaatjes in aanwezigheid van geoxygeneerde RBC's.Hier is de verhouding van P-VASP tot totale VASP afhankelijk van het niveau van hematocriet. VASP wordt sterk uitgedrukt in bloedplaatjes en wordt snel fosforylated in aanwezigheid van stikstofmonoxide. Daarom biedt dit protocol een methode voor het bestuderen van de inductie van stikstofmonoxide door verschillende fysiologische stimuli.Met deze methode hebben we met succes verhoogde P-VASP in bloedplaatjes gebruikt als marker van stikstofmonoxidestimulatie door ingeademde nitriet in vivo. Vergeet niet dat het werken met bloedplaatjes met een biologisch monster altijd moet worden uitgevoerd met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescentie Imaging (CLI) voor kankertherapie Monitoring

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrectomy in combinatie met High Salt Dieet en stikstofoxide synthase Remming aan chronische nierziekte induceren in de Lewis rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Routine Screening Method voor microdeeltjes in bloedplaatjes transfusies

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Synthese, karakterisering en toepassing van superparamagnetische ijzeroxide nanosondes voor detectie van extrapulmonale tuberculose

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Een nieuw inhalatiemaskersysteem om hoge concentraties stikstofmonoxidegas te leveren bij spontaan ademende proefpersonen

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...