Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Ce travail a été financé par bourse intra-muros NIH au Dr Alan N. Schechter.

Remarque : Des échantillons de sang ont été prélevés à la banque de sang de NIH (CISR a approuvé le protocole : 99-CC-0168).
1. préparation des échantillons de sang
Remarque : Pour éviter l’activation plaquettaire, prélever du sang lentement et mélanger doucement avec du citrate en renversant le tube plusieurs fois.
<ol><li>
Préparation de plasma riche en plaquettes (PRP)...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Étant donné que les plaquettes sont facilement activées, douce manipulation plaquettes contenant des échantillons est nécessaire. Rapide de pipetage et secouant vigoureux doivent être évités. Plaquettaires tels que de la prostacycline (PGI2) peuvent être utilisés pour prévenir l’activation des plaquettes ; Toutefois, cela pourrait affecter certaines voies de signalisation à l’intérieur des plaquettes. Pour la préparation de boulettes de plaquettes, nous ajouter ACD pour les suspensions de pl...

Les plaquettes sont des fragments de petites cellules discoïdes dérivés de mégacaryocytes qui sont cruciaux pour la coagulation du sang. La cascade de coagulation est initiée par diverses molécules bioactives (comme le collagène ou ADP), publiés après la blessure de la paroi vasculaire. La processus de coagulation peut être modifiée, parmi divers effecteurs de l’oxyde nitrique (NO). Non, produite naturellement par les cellules de mammifères, est l’un des signaux physiologiques plus polyvalents. Il agit comme un puissant vasodilatateur, le neurotransmetteur et le modulateur immunitaire, pour n’en nommer que quelques-uns de ses nombreuses fonctions. Dans la circulation sanguine, donc aussi aide à réguler l’étendue de la coagulation sanguine en inhibant l’agrégation plaquettaire. Une des sources plus probables du NO dans la circulation sanguine est nitrite, un ion inorganique qui a été établi pour servir de précurseur de no Réagissant avec les globules rouges (hématies), nitrite est réduit à N° et deoxyHb est oxydé en méthémoglobine (metHb)1. N° libéré des globules rouges est vasomoteur et provoque la vasorelaxation2. Cette voie de réduction de nitrite n’est un autre aucune voie de génération, agissant conjointement avec et en ne complétant la classique aucun chemin de génération par endothélial d’oxyde nitrique synthase, à des conditions d’hypoxie.
Les plaquettes eux-mêmes ne sont pas en mesure de réduire le nitrite en NO mais sont très sensibles à sa présence. Dans les plaquettes intactes, non dans le nanomolaires gamme augmente cGMP (EC50 = 10 nM) et la phosphorylation de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Dès lors, les plaquettes peuvent servir comme un excellent capteur de réduction des nitrites par les globules rouges et aucun rejet dans le sang. Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer directement la mesure de l’activation plaquettaire - tels qu’aggregometry et thromboélastographie (TEG)4,5. Cependant, ces méthodes nécessitent des instruments spécialisés coûteux et assez grandes quantités de matériel. Il est également possible de surveiller les événements en aval, après on ne se détache de globules rouges, en utilisant les changements dans l’expression de la protéine de surface plaquettaire – comme la P-sélectine6. N’est également connu pour augmenter la quantité de GMPC dans les plaquettes7. Auparavant, nous avons utilisé des cGMP pour ne suivre aucun rejet dans le sang après réduction des nitrites par désoxygéné RBC8. Cela s’est avéré pour être une méthode très sensible ; Cependant, cGMP est une molécule de courte durée et sa détection implique une vaste main de œuvre. Une autre possibilité, décrite dans le protocole présenté, utilise la phosphorylation de la phospho stimulée par vasodilatateur (VASP)-protéine pour détecter la présence de NO dans le sang. VASP est un substrat de l’activation de protéine kinase G, qui est phosphorylé lors de l’interaction avec les N° à la voie CGT/GMPC9. Détectable phosphorylation VASP se produit à très faible NO concentrations, ce qui pourraient faire de plaquettes un détecteur très sensible d’aucune présence dans le sang. VASP est fortement exprimée dans les plaquettes, mais pas dans les autres cellules sanguines, qui permet de suivre sélectivement les événements impliquant les plaquettes10.
Le principal objectif du présent protocole est de décrire la méthode dans le détail pour la détection d’aucune libération dans le sang entier à l’aide de son interaction avec les plaquettes en surveillant VASP phosphorylation11,12. La méthode décrite ne permet la détection précoce de faible aucune concentration - théoriquement dans la gamme nanomolar qui rend le présent protocole plus sensible que la détermination de cGMP, en raison de l’utilisation de techniques de transfert Western standard réalisables dans la plupart de laboratoire Paramètres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Les plaquettes sont les responsables de la coagulation sanguine correcte des composants sanguins. Leur fonction est fortement réglementée par diverses voies. Un des plus puissants agents vasoactifs, oxyde nitrique (NO), peut aussi agir comme un puissant inhibiteur de l’agrégation plaquettaire. Direct, aucun détection dans le sang n’est très difficile en raison de sa forte réactivité avec hémoglobine acellulaire qui ne limite aucun Half-Life à la gamme de milliseconde. Actuellement, aucun changement après que des interventions sont estimées uniquement ne basée sur les changements mesurés de nitrite et de nitrate (membres de la voie métabolique nitrate-nitrite-pas). Précise toutefois, ces mesures sont assez difficiles à n’interpréter par rapport aux réelles aucune modification, en raison de la nitrite de base élevées naturellement et concentrations qui sont de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que des changements attendus pas elle-même de nitrates. Par conséquent, le développement de méthodes simples et directs qui permettraient de détecter directement les N° est depuis longtemps. Ce protocole vise une utilisation potentielle des plaquettes comme une très sensible sans capteur dans le sang. Elle qualifie plasma riche en plaquettes initial (PRP) et préparations des plaquettes lavées et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés de pas générateurs. La phosphorylation de la VASP à sérine 239 (P-VASPSer239) est utilisée pour détecter la présence de no Le fait que la protéine VASP est fortement exprimée dans les plaquettes et qu’il est phosphorylé rapidement lorsqu’il est présent conduit à une occasion unique d’utiliser cette voie pour ne détecter directement aucune présence dans le sang.

Échantillons de sang veineux ont des valeurs de2 pO entre 50-80 mmHg. Désoxygénation de hélium diminue rapidement pO2 à 25 mmHg dans 10 min. accrue désoxygénation temps un peu plus loin des diminutions pO2. Cependant, augmentation du temps de désoxygénation conduit également à des niveaux sensiblement accrus d’hémoglobine acellulaire (déterminé par co-oxymétrie, vu visuellement sur la Figure 2 que la coloratio...

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Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Nous présentons ici un protocole pour répondre à l’utilisation potentielle des plaquettes comme un capteur très sensible l’oxyde nitrique dans le sang. Il décrit la préparation de plaquettes initial et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés comme générateurs de l’oxyde nitrique.

Détection du monoxyde d’azote dans le sang en mesurant Phosphorylation VASP plaquettaire

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Ce protocole traite de l’utilisation potentielle de plaquettes comme capteur d’oxyde nitrique hautement sensible à la fois in vitro et in vivo dans le sang. L’augmentation de la phosphoprotéine stimulée par vasodilatateur phosphorateur ou de la sérine P-VASP 239 dans les plaquettes oxyde nitrique présente certains avantages, y compris la capacité de détecter la présence d’oxyde nitrique dans les lignées nanomolaires. Dans les deux heures suivant la collecte de 30 à 50 millilitres de sang entier auprès d’un donneur sain, ajouter cinq millilitres aliquots du sang dans le nombre approprié de tubes coniques de 15 millilitres pour la centrifugation.Utilisez une pipette de transfert en plastique pour recueillir soigneusement le plasma riche en plaquettes de la partie supérieure des supernatants. Pelleter les plaquettes riches en plasma avec une deuxième centrifugation et laver délicatement les granulés en cinq millilitres de tampon CGS. Centrifugeuse à 400 g pendant 10 minutes à température ambiante.À la fin de la centrifugation, resuspendez les granulés en trois millilitres de tampon Tyrode modifié. Utilisez un hémocytomètre pour compter et ajuster la densité des suspensions plaquettaires à trois fois 10 à la huitième cellule par millilitre dans le tampon tyrode frais. Puis incuber les suspensions plaquettes pendant une heure à 37 degrés Celsius.Pendant ce temps, recueillir les globules rouges à partir des couches plasmatiques sans plaques des échantillons de sang entier par centrifugation suivie de quatre lavages en cinq millilitres de PBS par lavage. Après le dernier lavage, jetez les supernatants et mélangez les globules rouges avec un millilitre des plaquettes riches en plasma à l’hématocrit expérimental approprié dans des bouteilles de polypropylène fermées avec des bouchons en caoutchouc. Insérez une aiguille reliée à un réservoir d’essence d’hélium dans chaque septa et insérez des aiguilles de calibre 26 pour faire des prises de gaz.Puis faites tourbillonner lentement les bouteilles à température ambiante et utilisez un oxymètre pour mesurer la pression partielle d’oxygène pour la surveillance du processus de désoxygénation. Le taux de diminution de l’oxygène dépend du débit d’hélium et de la vitesse d’agitation. Par conséquent, l’heure de l’oxygénation doit être optimisée avant de commencer une expérience car cela dépend fortement de la géométrie de la configuration expérimentale.Pour réduire le nitrite des globules rouges, utilisez une microsyringe pour injecter du nitrite à travers le septum dans les échantillons désoxygénés de PRP et de RBCs afin d’atteindre une concentration finale de 10 micromolaires. Incuber les échantillons pendant au moins 10 minutes à 37 degrés Celsius et transférer un millilitre de chaque échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour centrifugation. Transférer 300 microlitres de suspension plaquettaires de la partie supérieure des supernatants dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse et ajouter du dextrose de citrate acide à chaque tube à un rapport d’un à neuf.Centrifugez à nouveau les plaquettes et resuspendez les granulés dans 80 microlitres de tampon de lyse glacée contenant un cocktail inhibiteur de la protéase de trois à chaque tube. Ensuite, chargez 15 microgrammes de protéines de chaque échantillon à deux gels distincts de 10% SDS-PAGE. Faire fonctionner les gels à 120 volts pendant 1,3 heure.À la fin de la course, transférer les gels dans les membranes individuelles de cellulose nitreux et bloquer toute liaison non spécifique avec un volume approprié de 5% de lait sec non gras. Incuber les membranes avec les anticorps primaires appropriés pendant la nuit à quatre degrés Celsius, suivie de l’étiquetage avec un anticorps approprié de radis de cheval secondaire peroxidase pendant 45 minutes à température ambiante. Exposez ensuite les membranes avec un imageur pour quantifier la densité de la bande avec un programme d’analyse d’image approprié.Les échantillons de sang veineux sains ont des valeurs partielles de pression d’oxygène entre 50 et 80 millimètres de mercure. La désoxygénation par hélium diminue rapidement la pression partielle de l’oxygène à 25 millimètres de mercure dans les 10 minutes. D’autres diminutions de la pression partielle d’oxygène peuvent être réalisées avec un temps accru de désoxygénation.La désoxygénation accrue mène aux niveaux accrus d’hémolyse comme indiqué par le plasma de couleur de plus en plus rouge. Il s’agit d’un effet de désoxygénation et n’est pas causé par l’agitation elle-même comme indiqué par le manque d’hémolyse dans les échantillons agités sans hélium. Les niveaux d’expression Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein ou VASP et Phosphorylated-VASP dans les plaquettes ont diminué avec l’hématocrit croissant dans les échantillons désoxygénés tels que détectés par la tache occidentale.Le traitement avec un donneur d’oxyde nitrique de courte durée augmente l’expression phosphorylatée de phosphoprotéine vasodilatateur-stimulée dans les plaquettes dans les 10 secondes du traitement. De plus, les niveaux de phosphorylated-VASP ou de P-VASP sont demeurés stables jusqu’à 10 minutes après l’incubation du donneur NO avec plasma riche en plaquettes, ce qui indique qu’il y a suffisamment de temps pour séparer les CFC des plaquettes sans affecter les niveaux existants de P-VASP. Nitrite augmente également les niveaux de P-VASP du plaquette en présence de RBCs désoxygénés.Ici, le rapport P-VASP au VASP total dépend du niveau d’hématocrit. Vasp est fortement exprimé dans le plaquette et il est rapidement phosphorylated en présence d’oxyde nitrique. Par conséquent, ce protocole fournit une méthode pour étudier l’induction de l’oxyde nitrique par divers stimuli physiologiques.Avec cette méthode, nous avons employé avec succès le P-VASP accru dans le plaquette comme marqueur de stimulation d’oxyde nitrique par nitrite inhalé in vivo. N’oubliez pas que le travail avec plaquette avec un spécimen biologique doit toujours être effectué à l’aide de l’équipement de protection personnelle approprié.

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