Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Intramurale, Dr. Alan N. Schechter NIH finanziert.

Hinweis: Blutproben wurden von NIH Blutbank erhalten (IRB Protokoll genehmigt: 99-CC-0168).
(1) Blut Probenaufbereitung
Hinweis: Zur Vermeidung von Thrombozyten Aktivierung Blut langsam und vorsichtig mischen mit Citrat durch das Rohr mehrmals umdrehen.
<ol><li>
Platelet-Rich Plasma (PRP) Vorbereitung
	<ol>
<li>Ziehen Sie 30 – 50 mL Blut mit einem 20 G oder größeren Durchmesser Nadel u...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Da Thrombozyten leicht aktiviert werden, schonendes Handling von Thrombozyten-haltigen Proben erforderlich ist. Schnellen pipettieren und kräftig schütteln sollte vermieden werden. Thrombozyten-Hemmer wie Prostazyklin (PGI2) können verwendet werden, um Thrombozyten Aktivierung zu verhindern; Dies kann jedoch einige Signalwege innerhalb der Blutplättchen beeinflussen. Für die Vorbereitung von Thrombozyten Pellets wir die Thrombozyten-Suspensionen ACD hinzufügen und langsamem Zentrifugation verwenden.
...

Thrombozyten sind scheibenförmige kleinzelligen Fragmente aus Megakaryozyten, die entscheidend für die Blutgerinnung sind abgeleitet. Die gerinnende Kaskade wird von verschiedenen bioaktiven Moleküle (wie Kollagen oder ADP), veröffentlicht nach der Verletzung der Gefäßwand initiiert. Die Prozess der Blutgerinnung kann unter verschiedenen Effektoren von Stickstoffmonoxid (NO) geändert werden. Nein, natürlich von Säugerzellen produziert, ist eines der vielseitigsten physiologische Signale. Es wirkt als potenter Vasodilatator, Neurotransmitter und immun-Modulator, einige seiner vielen Funktionen zu nennen. In der Blutbahn hilft auch keine, um das Ausmaß der Blutgerinnung durch Hemmung der Thrombozytenaggregation zu regulieren. Die wahrscheinlichsten Ursachen von NO in den Blutkreislauf zählt Nitrit, eine anorganische Ionen, die gezeigt worden, um als ein Vorläufer der Nr. dienen Reaktion mit roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Nitrit reduziert sich auf NO und DeoxyHb ist oxidiert zu Methämoglobin (MetHb)1. Nein von Erythrozyten befreit vasoaktive und verursacht Vasorelaxation2. Dieses Nitrit-Reduktion-Weg ist eine Alternative keine Generation Weg zusammen mit handeln und Ergänzung der klassischen keine Generation Weg durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase unter hypoxischen Bedingungen.
Thrombozyten selbst sind nicht in der Lage, Nitrit in NO zu reduzieren, sondern reagieren sehr empfindlich auf ihre Präsenz. In intakten Blutplättchen, nicht in die nanomolaren Reichweite erhöht cGMP (EG50 = 10 nM) und Phosphorylierung von VASP (EG50 = 0,5 nM)3. Thrombozyten können dienen daher als hervorragende Sensor von Nitrit Abbau von Erythrozyten und keine Freisetzung ins Blut. Es gibt mehrere Methoden, die das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung - wie Aggregometry und Thromboelastography (TEG) direkt messen4,5. Diese Methoden erfordern jedoch teuer spezialisierte Instrumentierung und ziemlich große Mengen an Material. Es ist auch möglich, Ereignisse überwachen nachgeschalteten, nach NO wird freigegeben von Erythrozyten, Thrombozyten-Oberfläche Protein-Expression – z. B. P-Selektin6Änderungen bei. Nein ist auch bekannt, die Menge an cGMP in der Thrombozyten-7erhöhen. Früher wir cGMP keine Freisetzung ins Blut nach der Nitrit-Reduzierung durch sauerstoffarmes RBC8zu überwachen. Dies erwies sich als eine sehr empfindliche Methode; Allerdings cGMP ist eine kurzlebige Molekül und seine Entdeckung beinhaltet umfangreiche Arbeit. Eine weitere Möglichkeit, beschrieben in dem vorgestellten Protokoll verwendet Phosphorylierung von gefäßerweiternden stimuliert Phospho (VASP)-Protein, das Vorhandensein von NO im Blut zu erkennen. VASP ist ein Substrat aus Protein Kinase G Aktivierung, die auf die Interaktion mit Nein durch die sGC/cGMP Weg9phosphoryliert wird. Nachweisbare VASP Phosphorylierung tritt bei sehr niedrigen NO-Konzentrationen, die Blutplättchen im Blut einen sehr empfindlichen Detektor keine Präsenz machen könnte. VASP hoch in Thrombozyten angegeben, jedoch nicht in anderen Blutkörperchen, wodurch gezielt die Ereignisse im Zusammenhang mit Thrombozyten10folgen.
Das Hauptziel dieses Protokolls soll die Methode im Detail für den Nachweis von keine Freigabe im Vollblut mit seiner Interaktion mit Thrombozyten durch die Überwachung der VASP Phosphorylierung11,12beschreiben. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Früherkennung von niedrigen keine Konzentrationen - theoretisch im nanomolaren Bereich macht dieses Protokolls empfindlicher als cGMP Bestimmung, durch die Verwendung von standard-Western-Blot-Techniken, die in die meisten Labor erreichbare Einstellungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Blutplättchen sind verantwortlich für die ordnungsgemäße Blutgerinnung Blutbestandteilen. Ihre Funktion ist durch verschiedene Wege stark reguliert. Einer der potentesten vasoaktive Agenten, Stickstoffmonoxid (NO), kann auch als eine mächtige Inhibitor der Thrombozytenaggregation handeln. Direkt ist kein Nachweis im Blut sehr anspruchsvoll aufgrund seiner hohen Reaktivität mit zellfreien Hämoglobin, die keine Halbwertszeit bis Millisekundenbereich begrenzt. Derzeit keine Änderungen nach Interventionen nur geschätzt werden anhand der gemessenen Veränderungen von Nitrit und Nitrat (Mitglieder der Stoffwechselweg der Nitrat-Nitrit-NO). Aber genauer gesagt, sind diese Messungen eher schwierig zu interpretieren gegenüber tatsächlichen keine Änderungen aufgrund der natürlich hohe Ausgangswert Nitrit und Nitratgehalte, die mehrere Größenordnungen höher als erwarteten Veränderungen nicht allein sind. Die Entwicklung der direkte und einfache Methoden, die nicht direkt nachweisen lassen würde ist daher längst überfällig. Dieses Protokoll befasst sich einer möglichen Verwendung von Thrombozyten als eine hochsensible kein Sensor im Blut. Es beschreibt erste Thrombozyten rich Plasma (PRP) und gewaschenen Thrombozyten Vorbereitungen und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als keine Generatoren. Phosphorylierung von VASP an Serin 239 (P-VASPSer239) wird verwendet, um das Vorhandensein von Nr. Die Tatsache, dass VASP Proteins sich besonders in Thrombozyten drückt und dass es schnell phosphoryliert wird, wenn keine vorhanden führt zu eine einmalige Gelegenheit, diesen Weg nutzen, um direkt ohne Präsenz im Blut nachweisen.

Venöse Blutproben haben pO2 Werte zwischen 50-80 MmHg. Sauerstoffabspaltung durch Helium sinkt rasch pO2 bis 25 MmHg innerhalb von 10 min. erhöhte Sauerstoffabspaltung mal etwas weiter sinkt pO2. Erhöhte Zeit Sauerstoffabspaltung führt jedoch auch zu deutlich erhöhten Werten von zellfreien Hämoglobin (bestimmt durch Co Oximeter, visuell auf Abbildung 2 als zunehmend rote Färbung des Plasma gesehen) (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Dieses Protokoll befasst sich mit der möglichen Verwendung von Blutplättchen als hochempfindlicher Stickstoffmonoxid-Sensor sowohl in vitro als auch in vivo im Blut. Erhöhte Phosphorylierte Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein oder P-VASP Serin 239 in Thrombozyten Stickstoffmonoxid hat einige Vorteile, einschließlich der Fähigkeit, das Vorhandensein von Stickstoffmonoxid in nanomolaren Linien zu erkennen. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Sammeln von 30 bis 50 Milliliter Vollblut von einem gesunden Spender, fügen Sie fünf Milliliter Aliquots des Blutes in die entsprechende Anzahl von 15 Milliliter konischen Röhren für zentrifugation.Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um das plättchenreiche Plasma sorgfältig aus dem oberen Teil der Überräube zu sammeln. Pellet die plasmareichen Blutplättchen mit einer zweiten Zentrifugation und waschen Sie die Pellets vorsichtig in fünf Milliliter CGS Puffer. Zentrifuge bei 400 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Am Ende der Zentrifugation die Pellets in drei Milliliter modifizierten Tyrode-Puffer wieder aussetzen. Verwenden Sie ein Hämozytometer zum Zählen und passen Sie die Dichte der Thrombozytensuspensionen auf dreimal 10 bis zu den achten Zellen pro Milliliter in frischem Tyrode-Puffer an. Dann die Thrombozytensuspensionen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.In der Zwischenzeit sammeln Sie die roten Blutkörperchen aus den plattenfreien Plasmaschichten der Vollblutproben durch Zentrifugation, gefolgt von vier Wäschen in fünf Millilitern PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Überstande entsorgen und die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter der plasmareichen Blutplättchen an der entsprechenden experimentellen Hämatokrit in Polypropylenflaschen mit Gummistopfen geschlossen mischen. Setzen Sie eine Nadel, die mit einem Helium-Gastank verbunden ist, in jede Septa ein und setzen Sie 26-Spur-Nadeln ein, um Gasaustritte herzustellen.Dann wirbeln Sie die Flaschen langsam bei Raumtemperatur und messen Sie mit einem Oximeter den teilweisen Sauerstoffdruck zur Überwachung des Desoxygenierungsprozesses. Die Sauerstoffabnahme rate hängt von der Heliumdurchflussrate und der Rührgeschwindigkeit ab. Daher sollte die Zeit der Sauerstoffversorgung vor Beginn eines Experiments optimiert werden, da dies stark von der Geometrie des Versuchsaufbaus abhängt.Zur Reduktion der roten Blutkörperchen nitrit verwenden Sie eine Mikrospritze, um Nitrit durch das Septum in die desoxygenierten Proben von PRP und RBCs zu injizieren, so dass eine endgültige Konzentration von 10 Mikromolaren erreicht wird. Inkubieren Sie die Proben mindestens 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie einen Milliliter jeder Probe zur Zentrifugation in ein Mikrozentrifugenrohr. 300 Mikroliter Thrombozytensuspension aus dem oberen Teil der Überstande in neue Mikrozentrifugenröhrchen geben und säurezitratdextrose in einem Verhältnis von eins zu neun in jedes Rohr geben.Zentrifugieren Sie die Blutplättchen erneut und setzen Sie die Pellets in 80 Mikrolitere eiskaltelyse Puffer mit Protease-Hemmer-Cocktail drei zu jeder Röhre wieder auf. Als nächstes laden Sie 15 Mikrogramm Protein aus jeder Probe auf zwei separate 10%SDS-PAGE Gele. Führen Sie die Gele bei 120 Volt für 1,3 Stunden.Übertragen Sie die Gele am Ende des Laufs auf einzelne Lachgas-Zellulosemembranen und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit einem entsprechenden Volumen von 5% fettfreier Trockenmilch. Inkubieren Sie die Membranen mit den entsprechenden Primärantikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius, gefolgt von der Kennzeichnung mit einem geeigneten sekundären Pferderettichperoxidase-Antikörper für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie dann die Membranen mit einem Imager aus, um die Banddichte mit einem geeigneten Bildanalyseprogramm zu quantifizieren.Gesunde venöse Blutproben haben teilweise Sauerstoffdruckwerte zwischen 50 und 80 Millimeter Quecksilber. Die Deoxgenation durch Helium verringert den Teildruck von Sauerstoff innerhalb von 10 Minuten schnell auf 25 Millimeter Quecksilber. Eine weitere Abnahme des partiellen Sauerstoffdrucks kann mit einer erhöhten Deoxygenierungszeit erreicht werden.Erhöhte Deoxygenierung führt zu erhöhten Hämolyse, wie durch zunehmend rote Farbe Plasma angezeigt. Dies ist eine Auswirkung der Deoxygenierung und wird nicht durch Rühren selbst verursacht, wie durch das Fehlen von Hämolyse in Proben ohne Helium gerührt angezeigt. Sowohl Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein oder VASP- als auch Phosphorylierte-VASP-Expressionskonzentrationen in Thrombozyten verringerten sich mit zunehmender Hämatokrit in deoxygenierten Proben, wie sie von Western Blot nachgewiesen wurden.Die Behandlung mit einem kurzlebigen Stickstoffmonoxidspender erhöht die phosphorylierte, vasodilatatorstimulierte Phosphoproteinexpression in Blutplättchen innerhalb von 10 Sekunden nach der Behandlung. Darüber hinaus blieben die Konzentrationen von Phosphoryliertem-VASP oder P-VASP bis zu 10 Minuten nach der Inkubation des NO-Spenders mit plättchenreichem Plasma stabil, was darauf hindeutet, dass genügend Zeit für die Trennung von RBCs von Thrombozyten zur Folge bleibt, ohne die bestehenden P-VASP-Spiegel zu beeinflussen. Nitrit erhöht auch die P-VASP-Spiegel von Thrombozyten in Gegenwart von desoxygenierten RBCs.Hier hängt das Verhältnis von P-VASP zu Gesamt-VASP vom Hematokrit-Niveau ab. VASP ist stark in Thrombozyten exprimiert und wird in Gegenwart von Stickstoffmonoxid schnell phosphoryliert. Daher bietet dieses Protokoll eine Methode zur Untersuchung der Induktion von Stickstoffmonoxid durch verschiedene physiologische Reize.Mit dieser Methode haben wir erfolgreich erhöhte P-VASP in Thrombozyten als Marker der Stickstoffmonoxidstimulation durch inhaliertes Nitrit in vivo eingesetzt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Thrombozyten mit einer biologischen Probe immer mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung durchgeführt werden sollte.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Forschung

Medizin

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Lumineszenz Imaging (CLI) for Cancer Therapy Überwachung

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Synthese, Charakterisierung und Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanosonden zur Erkennung von extrapulmonaler Tuberkulose

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Ein neuartiges Inhalationsmaskensystem zur Abgabe hoher Konzentrationen von Stickoxidgas bei spontan atmenden Probanden

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...