Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי מענק מגזר NIH ד ר אלן ש שכטר.

הערה: דגימות דם, התקבלו בנק הדם NIH (IRB אושר פרוטוקול: 99-CC-0168).
1. דם לטעום הכנה
הערה: כדי למנוע הפעלת טסיות דם, דם לאט ומערבבים בעדינות עם ציטראט על-ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים.
<ol><li>
טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) הכנה
	<ol>
<li>ל?...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

מאז טסיות מופעלים בקלות, עדין טיפול של טסית דם המכילים דוגמאות נדרש. יש להימנע pipetting מהר, ומנענע נמרצת. מעכבי טסיות כגון prostacyclin (PGI2) יכול לשמש כדי למנוע הפעלה טסית דם; עם זאת, זה עלול להשפיע על איזה איתות המסלולים בתוך טסיות הדם. עבור הכנת כדורי טסיות, אנו להוסיף ACD המתלים טסיות ולהשתמש נ?...

הטסיות הן שברי תאים קטנים בצורת דיסק נגזר megakaryocytes כי הם חיוניים קרישת הדם. המפל קרישת דם הוא שיזם מולקולות ביו שונים (כגון קולגן או ADP), שוחרר לאחר פציעתו של קיר כלי הדם. תהליך קרישת הדם יכול להיות שונה, בין effectors השונים על ידי תחמוצת החנקן (NO). . לא, באופן טבעי המיוצר על ידי תאי יונקים, הוא אחד המגוונים ביותר אותות פיזיולוגיים. היא פועלת vasodilator חזק, מוליך עצבי, אפנן המערכת החיסונית, שם כמה הפונקציות הרבות שלה. בכלי הדם, לא גם מסייע לווסת את היקף קרישת הדם על ידי עיכוב הצטברות של טסיות דם. אחד המקורות סביר ביותר לא במחזור הדם הוא חנקיתי, יון אנאורגניים זה הוכח להוות סימן מקדים של מס מגיבה עם כדוריות דם אדומות (RBCs) חנקיתי מופחתת ללא, deoxyHb תחמוצת methemoglobin (metHb)1. לא שוחררו RBCs הוא vasoactive וגורם vasorelaxation2. מסלול זה הפחתת חנקיתי הוא תוכנית חלופית אין מסלול הדור, מתנהג יחד עם ו משלימים קלאסית אין שביל דור על ידי סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל-תנאים ובשפתיים.
טסיות הדם עצמם אינם מסוגלים להפחית חנקיתי לתוך לא אבל רגישים מאוד את נוכחותה. בטסיות תקין, לא ב- nanomolar טווח מגדילה cGMP (EC50 = 10 ננומטר), זירחון של VASP (EC50 = 0.5 ננומטר)3. לכן, טסיות עשויים לשמש חיישן מעולה של הפחתת חנקיתי RBCs, אין שחרור לדם. ישנן מספר שיטות שבהן באפשרותך למדוד ישירות את היקף ההפעלה טסיות - כגון aggregometry ו- thromboelastography (TEG)4,5. עם זאת, שיטות אלה דורשים יקר במכשור מיוחד, כמויות די גדולות של חומר. זה גם אפשרי לעקוב אחר אירועים במורד הזרם, לאחר לא הוא שוחרר מן RBCs, באמצעות השינויים בביטוי חלבונים משטח טסיות – כגון בחירת שמלות P6. לא ידוע גם להגדיל את כמות cGMP ב טסיות הדם7. בעבר, היינו cGMP לפקח אין שחרור לתוך הדם לאחר הפחתה חנקיתי מאת RBC רווית8. זה הוכיח להיות שיטה מאוד רגיש; עם זאת, cGMP הוא מולקולה קצרת ימים, זיהוי שלו כרוכה עבודה נרחב. אפשרות נוספת, שמתואר פרוטוקול שהוצגו, משתמשת זירחון של פוספו מגורה מרחיב כלי דם (VASP)-חלבון כדי לזהות הנוכחות של NO בדם. VASP הוא מצע של הפעלת קינאז גרם חלבון, אשר הוא phosphorylated על האינטראקציה עם לא דרך הסטארגייט/cGMP מסלול9. זרחון VASP לזיהוי מתרחשת ללא נמוך מאוד ריכוזי, שעלולה לגרום טסיות גלאי רגיש מאוד אין נוכחות בדם. VASP מתבטאת מאוד טסיות, אך לא בתאים אחרים בדם, מה שמאפשר לעקוב באופן סלקטיבי את האירועים הקשורים טסיות10.
המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת בפירוט עבור זיהוי אין שחרור בדם כל שימוש ביחסיו עם טסיות דם על-ידי ניטור VASP זרחון11,12. השיטה המתוארת מאפשרת גילוי מוקדם של נמוך אין ריכוזים - תיאורטית בטווח nanomolar מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי רגיש יותר נחישות cGMP, עקב השימוש של טכניקות תספיג סטנדרטי השגה במעבדה רוב הגדרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

הטסיות הן רכיבי הדם אחראי על קרישת הדם תקין. תפקידם הוא מאוד מווסתות על ידי מסלולים שונים. אחד הסוכנים vasoactive הקטלניים ביותר, תחמוצת החנקן (NO), יכול גם לפעול מעכב חזק של הצטברות של טסיות דם. ישיר אין זיהוי בדם הוא מאוד מאתגר עקב שלה תגובתיות גבוהה עם המוגלובין ללא תא המגביל מחצית אין חיים על הטווח אלפיות השנייה. כיום, אין שינויים לאחר התערבויות מוערכות רק בהתבסס על שינויים מדודה של חנקיתי חנקתי (חברים של מסלול מטבולי חנקת-חנקיתי-לא). עם זאת מדויק, מדידות אלה הם די קשה לפרש מול בפועל ללא שינויים, עקב חנקיתי בסיסית גבוהה באופן טבעי טונות רמות שנמצאים במספר סדרי גודל גבוה יותר מאשר שינויים צפויים לא עצמו. לכן, בפיתוח שיטות ישירה ופשוטה שתאפשר אחד לזהות לא ישירות הוא מזמן. פרוטוקול זה מטפל שימוש פוטנציאלי של טסיות כמו רגישות גבוהה לא חיישן בדם. זה מתאר פלזמה עשיר טסיות הראשונית (PRP) ואת ההכנות טסיות שטף את השימוש חנקיתי רווית תאי דם אדומים גנרטורים אין. זירחון של VASP-סרין 239 (P-VASPSer239) משמש כדי לזהות הנוכחות של מס העובדה כי חלבון VASP מתבטאת מאוד טסיות הדם, כי זה הוא במהירות phosphorylated כאשר לא קיים מוביל הזדמנות ייחודית לשימוש מסלול זה ישירות לאתר בו שום נוכחות בדם.

דגימות דם ורידי יש פו2 ערכים בין 50-80 מ מ כספית. Deoxygenation על ידי הליום יורדת במהירות פו2 ל- 25 מ מ כספית בתוך 10 דקות הגדילו deoxygenation-זמן פו ובירידות מעט יותר2. עם זאת, זמן מוגברת של deoxygenation גם מוביל רמות גבוהות באופן משמעותי של המוגלובין ללא תא (שנקבע על ידי Oximeter שי?...

Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לטפל להשתמש הפוטנציאל של טסיות דם כמו חיישן רגיש מאוד תחמוצת החנקן בדם. זה מתאר טסיות הראשונית הכנה ושימוש חנקיתי ו רווית תאי דם אדומים גנרטורים תחמוצת החנקן.

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

פרוטוקול זה מטפל בשימוש הפוטנציאלי של טסיות דם כמו חיישן תחמוצת החנקן רגיש מאוד הן במבחנה והן ב vivo בתוך הדם. מוגברת זרחן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או P-VASP סרין 239 בתחמוצת החנקן טסיות יש כמה יתרונות, כולל היכולת לזהות את נוכחותו של תחמוצת החנקן בשושלת nanomolar. בתוך שעתיים של איסוף 30 עד 50 מיליליטר של דם שלם מתורם בריא, להוסיף חמישה aliquots מיליליטר של הדם למספר המתאים של צינורות חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.השתמש פיפטה העברת פלסטיק בזהירות לאסוף את הפלזמה עשיר טסיות מהחלק העליון של supernatants. גלולה טסיות דם עשירות בפלזמה עם צנטריפוגה שנייה בעדינות לשטוף את כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ CGS. צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הצנטריפוגה, תן שימוש חוזר כדורי בשלושה מיליליטר של חיץ טירוד שונה. השתמש hemocytometer לספירה ולהתאים את הצפיפות של מתלי טסיות הדם לשלוש פעמים 10 לתאים השמיני למיליליטר במאגר טירוד טרי. ואז להדגר את השעיות טסיות הדם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בינתיים, לאסוף את תאי הדם האדומים משכבות פלזמה ללא צלחת של דגימות הדם כולו על ידי צנטריפוגה ואחריו ארבע שטיפות בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את העל-טבעיים וערבבו את תאי הדם האדומים עם מיליליטר אחד של טסיות הדם העשירות בפלזמה בהמטוקריט הניסיוני המתאים בבקבוקי פוליפרופילן סגורים עם פקקי גומי. הכנס מחט המחוברת למיכל גז הליום לתוך כל septa ולהכניס 26 מחטי מד כדי להפוך את שקעי גז.ואז לאט מערבלים את הבקבוקים בטמפרטורת החדר ולהשתמש oximeter כדי למדוד את לחץ החמצן החלקי לניטור של תהליך ניוון. קצב ירידה בחמצן תלוי בקצב זרימת ההליום והמהירות המרגשת. לכן, הזמן של החמצון צריך להיות אופטימיזציה לפני תחילת ניסוי כמו זה תלוי מאוד על הגיאומטריה של ההתקנה הניסיונית.להפחתת חנקן של תאי דם אדומים, השתמש במיקרו-זירינג כדי להזריק ניטריס דרך המחיצה לדגימות הנוונות של PRP ו- RBCs, כך שהושג ריכוז סופי של 10 מיקרומולרים. הדגירה את הדגימות לפחות 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולהעביר מיליליטר אחד של כל מדגם לתוך צינור microcentrifuge עבור צנטריפוגה. מעבירים 300 מיקרוליטרים של מתלי טסיות דם מהחלק העליון של העל-טבעיים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים ומוסיפים חומצה ציטראט דקסטרוז לכל צינור ביחס של 1 עד 9.צנטריפוגה טסיות הדם שוב resuspend כדורי ב 80 microliters של חיץ תמוגה קר קרח המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז שלוש לכל צינור. לאחר מכן, העמיסו 15 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה לשני ג'לים נפרדים של 10%SDS-PAGE. הפעל את הג'לים ב 120 וולט במשך 1.3 שעות.בסיום הריצה, מעבירים את הג'לים למברנות חנקן בודדות וחוסך כל כריכה לא ספציפית בנפח מתאים של 5% חלב יבש ללא שומן. הדגירה את הממברנות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים לילה בארבע מעלות צלזיוס ואחריו תיוג עם נוגדן צנון סוס משני מתאים peroxidase במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לחשוף את הממברנות עם imager לכמת את צפיפות הלהקה עם תוכנית ניתוח תמונה מתאימה.דגימות דם ארסיות בריאות יש ערכי לחץ חמצן חלקיים בין 50 ל 80 מילימטרים של כספית. ניוון על ידי הליום במהירות מקטין את הלחץ החלקי של חמצן ל 25 מילימטרים של כספית בתוך 10 דקות. ירידה נוספת של לחץ חמצן חלקי ניתן להשיג עם זמן ניוון מוגבר.deoxygenation מוגברת מוביל רמות גבוהות של המוליזה כפי שצוין על ידי פלזמה צבע אדום יותר ויותר. זוהי השפעה של deoxygenation והוא לא נגרם על ידי ערבוב עצמו כפי שצוין על ידי חוסר המוליזה בדגימות עורר ללא הליום. הן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או VASP ו Phosphorylated-VASP רמות ביטוי טסיות דם ירד עם hematocrit הגדלת דגימות ניוון כפי שזוהה על ידי כתם מערבי.טיפול עם תורם תחמוצת החנקן קצר ימים מגביר ביטוי פוספופרוטאין זרחן מגורה זרחן בתוך 10 שניות של טיפול. כמו כן, רמות של Phosphorylated-VASP או P-VASP נשאר יציב עד 10 דקות לאחר הדגירה של תורם NO עם פלזמה עשירה טסיות דם המציין כי יש מספיק זמן להפרדת RBCs טסיות דם מבלי להשפיע על רמות P-VASP הקיימות. ניטירה גם מגבירה את רמות ה-P-VASP של טסיות הדם בנוכחות RBCs מנוונים.כאן היחס בין P-VASP ל- VASP הכולל תלוי ברמת ההמטוקריט. VASP מתבטא מאוד טסיות והוא זרחן במהירות בנוכחות תחמוצת החנקן. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטה לחקר אינדוקציה של תחמוצת החנקן על ידי גירויים פיזיולוגיים שונים.בשיטה זו, השתמשנו בהצלחה P-VASP מוגברת טסיות דם כסמן של גירוי תחמוצת החנקן על ידי שאיפת ניטריס ב vivo. אל תשכח כי עבודה עם טסיות דם עם דגימה ביולוגית תמיד צריך להתבצע באמצעות ציוד ההגנה האישי המתאים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov הארת ההדמיה (CLI) לניטור ריפוי הסרטן

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Nephrectomy 5/6th בשילוב עם דיאטת מלח גבוהה ועיכוב תחמוצת החנקן synthase כדי לגרום למחלת כליות כרונית בחולדת לואיס

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

השגרה הקרנת שיטה עבור Microparticles ב עירויי טסיות

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

מערכת מסכת שאיפה חדשנית כדי לספק ריכוזים גבוהים של גז תחמוצת החנקן בנבדקים נושמים באופן ספונטני

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...