Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale NIH Dr Alan N. Schechter.

Nota: I campioni di sangue sono stati ottenuti dalla banca del sangue di NIH (IRB approvato protocollo: 99-CC-0168).
1. sangue preparazione del campione
Nota: Per evitare l'attivazione della piastrina, prelievo di sangue lentamente e mescolare delicatamente con citrato capovolgendo la provetta diverse volte.
<ol><li>
Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP)
	<ol>
<li>30 – 50 mL di...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Poiché le piastrine sono attivate, un trattamento delicato del piastrina-contenenti campioni è richiesto. Pipettaggio veloce e vigorosa agitazione dovrebbe essere evitati. Inibitori delle piastrine come prostaciclina (PGI2) possono essere utilizzati per impedire l'attivazione della piastrina; Tuttavia, questo potrebbe influire sulla alcune vie di segnalazione all'interno delle piastrine. Per la preparazione di pellet della piastrina, aggiungiamo ACD per le sospensioni della piastrina e utilizzare centrifugaz...

Le piastrine sono piccole cellule a forma di disco frammenti derivate dai megacariociti che sono fondamentali per la coagulazione del sangue. La cascata di coagulazione è iniziata da varie molecole bioattive (come collagene o ADP), pubblicati dopo la ferita della parete vascolare. Processo di coagulazione del sangue può essere modificato, tra vari effettori dall'ossido nitrico (NO). NO, prodotta naturalmente dalle cellule di mammiferi, è uno dei più versatili segnali fisiologici. Esso agisce come un potente vasodilatatore, neurotrasmettitore e modulatore immunitario, per citarne alcune delle sue numerose funzioni. Nel sangue, NO anche aiuta a regolare l'entità della coagulazione del sangue inibendo l'aggregazione della piastrina. Una delle fonti più probabile di NO nel sangue è nitrito, un ione inorganico che ha dimostrato di servire come un precursore del No. Reagendo con globuli rossi (RBCs), nitrito è ridotto a n e deoxyHb è ossidato a metaemoglobina (metHb)1. NO rilasciato da globuli rossi è vasoattivi e provoca vasodilatazione2. Questo percorso di riduzione di nitriti non è un supplente nessun percorso di generazione, agire insieme con e non integrare la classica nessun percorso di generazione mediante endoteliale di ossido nitrico sintasi in condizioni di ipossia.
Le piastrine se stessi non sono in grado di ridurre il nitrito in NO ma sono molto sensibili alla sua presenza. In piastrine intatte, non nel nanomolari gamma aumenta cGMP (CE50 = 10 nM) e fosforilazione della VASP (CE50 = 0.5 nM)3. Di conseguenza, le piastrine possono servire come un ottimo sensore di riduzione di nitrito di RBCs e nessun rilascio nel sangue. Ci sono diversi metodi che possono misurare direttamente il grado di attivazione piastrinica - come aggregometria e tromboelastografia (TEG)4,5. Tuttavia, questi metodi richiedono strumentazione specializzata costosi e piuttosto grandi quantità di materiale. È inoltre possibile monitorare gli eventi a valle, dopo NO viene rilasciato da globuli rossi, utilizzando i cambiamenti nell'espressione di proteina di superficie delle piastrine – ad esempio P-selectin6. NON è noto anche per aumentare la quantità di cGMP in piastrine7. In precedenza, abbiamo usato cGMP per non controllare nessun rilascio nel sangue dopo la riduzione del nitrito di deossigenata RBC8. Ciò rivelata per essere un metodo molto sensibile; Tuttavia, cGMP è una molecola di breve durata e la relativa rilevazione coinvolge vasto lavoro. Un'altra possibilità, descritta nel protocollo presentato, utilizza la fosforilazione del phospho vasodilatatore-stimolata (VASP)-proteina per rilevare la presenza di NO nel sangue. VASP è un substrato di attivazione della proteina chinasi G, che è fosforilata sull'interazione con NO attraverso la via sGC/cGMP9. Fosforilazione VASP rilevabile si verifica molto basso senza concentrazioni, che potrebbero rendere le piastrine un rivelatore molto sensibile di nessuna presenza nel sangue. VASP è altamente espresso in piastrine, ma non in altre cellule del sangue, che permette di seguire in modo selettivo gli eventi che coinvolgono le piastrine10.
L'obiettivo principale del presente protocollo è di descrivere il metodo in dettaglio per la rilevazione di nessun rilascio nel sangue intero utilizzando la sua interazione con le piastrine monitorando VASP fosforilazione11,12. Il metodo descritto non consente di individuazione tempestiva di basso vi erano concentrazioni - teoricamente in gamma nanomolar che rende più sensibile di determinazione di cGMP, dovute all'uso di tecniche standard Western blot realizzabili in laboratorio la maggior parte del presente protocollo Impostazioni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Le piastrine sono le componenti del sangue responsabili della coagulazione sanguigna corretta. Loro funzione altamente è regolata da varie vie. Uno dei più potenti agenti vasoattivi, ossido nitrico (NO), può anche agire come un potente inibitore dell'aggregazione piastrinica. Diretto nessun rilevamento nel sangue è molto impegnativo a causa della sua alta reattività con emoglobina senza cellula che non limita Half-Life per la gamma di millisecondo. Attualmente, nessun cambiamento dopo gli interventi sono solo stimati basato sui cambiamenti misurati di nitriti e nitrati (membri del pathway metabolici di nitrato-nitrito-NO). Tuttavia precisa, queste misure sono piuttosto difficili da non interpretare vis à vis effettivo modifiche, a causa del nitrito naturalmente elevato della linea di base e livelli che sono diversi ordini di grandezza superiori a cambiamenti attesi non sé di nitrati. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi diretti e semplici che permetterebbero di individuare direttamente NO è attesa da tempo. Questo protocollo non risolve un potenziale impiego delle piastrine come un altamente sensibili sensore nel sangue. Descrive come nessun generatori di plasma ricco di piastrine iniziale (PRP) e delle piastrine lavate i preparativi e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate. Fosforilazione della VASP a serina 239 (P-VASPSer239) viene utilizzata per rilevare la presenza di NO. Il fatto che la proteina VASP è altamente espressa in piastrine e che esso viene rapidamente fosforilata quando nessuno è presente conduce a un'occasione unica per utilizzare questa via per non rilevare direttamente la presenza nel sangue.

I campioni di sangue venoso hanno pO2 valori tra 50-80 mmHg. Deossigenazione di elio diminuisce velocemente pO2 a 25 mmHg entro 10 min. Increased deossigenazione tempo leggermente maggiori diminuzioni pO2. Tuttavia, tempo aumentato di deossigenazione inoltre conduce ai livelli significativamente aumentati di emoglobina senza cellula (determinato dal Co-ossimetro, visivamente visto in Figura 2 come colorazione sempre più rossa...

Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Qui, presentiamo un protocollo per affrontare l'uso potenziale delle piastrine come un sensore molto sensibile dell'ossido di azoto nel sangue. Esso descrive la preparazione iniziale della piastrina e l'uso di nitrito e di cellule rosse del sangue deossigenate come generatori di ossido nitrico.

Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Questo protocollo affronta il potenziale uso delle piastrine come sensore di ossido nitrico altamente sensibile sia in vitro che in vivo all'interno del sangue. L'aumento della fosforilato vasodilatatore-fosfoproteina stimolata o della serina P-VASP 239 nelle piastrine l'ossido nitrico ha alcuni vantaggi, tra cui la capacità di rilevare la presenza di ossido nitrico nei lignaggi nanomolari. Entro due ore dalla raccolta da 30 a 50 millilitri di sangue intero da un donatore sano, aggiungere cinque aliquote millilitri del sangue nel numero appropriato di tubi conici da 15 millilitri per la centrifugazione.Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per raccogliere con cura il plasma ricco di piastrine dalla parte superiore dei supernatanti. Pellet le piastrine ricche di plasma con una seconda centrifugazione e lavare delicatamente i pellet in cinque millilitri di tampone CGS. Centrifuga a 400 g per 10 minuti a temperatura ambiente.Al termine della centrifugazione, resuspend i pellet in tre millilitri di tampone Tyrode modificato. Utilizzare un emocitometro per il conteggio e regolare la densità delle sospensioni piastrine a tre volte 10 all'ottava cellule per millilitro nel tampone tyrode fresco. Quindi incubare le sospensioni piastrine per un'ora a 37 gradi Celsius.Nel frattempo, raccogliere i globuli rossi dagli strati plasmatici senza piastre dei campioni di sangue intero per centrifugazione seguiti da quattro lavaggi in cinque millilitri di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, scartare i supernaganti e mescolare i globuli rossi con un millilitro delle piastrine ricche di plasma presso l'appropriato ematocrito sperimentale in bottiglie di polipropilene chiuse con tappi di gomma. Inserire un ago collegato a un serbatoio di gas elio in ogni setto e inserire aghi calibro 26 per realizzare prese di gas.Quindi ruotare lentamente le bottiglie a temperatura ambiente e utilizzare un ossimetro per misurare la pressione parziale dell'ossigeno per il monitoraggio del processo di deossigenazione. La velocità di diminuzione dell'ossigeno dipende dalla portata dell'elio e dalla velocità di agitazione. Pertanto, il tempo di ossigenazione deve essere ottimizzato prima di iniziare un esperimento in quanto questo dipende fortemente dalla geometria della configurazione sperimentale.Per la riduzione del nitrito dei globuli rossi, utilizzare un microsiringe per iniettare nitrito attraverso il setto nei campioni deossigenati di PRP e RBC in modo da ottenere una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubare i campioni per almeno 10 minuti a 37 gradi Celsius e trasferire un millilitro di ciascun campione in un tubo di microcentrifugo per la centrifugazione. Trasferire 300 microlitri di sospensione piastrinica dalla parte superiore dei supernaganti in nuovi tubi a microcentrifugo e aggiungere il destrosio di citrato acido a ciascun tubo con un rapporto uno-nove.Centrifugare nuovamente le piastrine e rimescolare i pellet in 80 microlitri di tampone di lisi ghiacciata contenente cocktail inibitore della proteasi tre per ogni tubo. Successivamente, caricare 15 microgrammi di proteine da ogni campione a due gel separati 10%SDS-PAGE. Eseguire i gel a 120 volt per 1,3 ore.Alla fine della corsa, trasferire i gel su singole membrane di cellulosa nitrosa e bloccare qualsiasi legame non specifico con un volume appropriato di latte secco non grasso al 5%. Incubare le membrane con gli anticorpi primari appropriati durante la notte a quattro gradi Celsius, seguita dall'etichettatura con un anticorpo perossidasi del ravanello secondario appropriato per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi esporre le membrane con un imager per quantificare la densità della banda con un programma di analisi delle immagini appropriato.Campioni di sangue venoso sano hanno valori parziali di pressione dell'ossigeno tra 50 e 80 millimetri di mercurio. La disossazione per elio riduce rapidamente la pressione parziale dell'ossigeno a 25 millimetri di mercurio entro 10 minuti. Un'ulteriore diminuzione della pressione parziale dell'ossigeno può essere ottenuta con un aumento del tempo di deossigenazione.L'aumento della deossigenazione porta ad un aumento dei livelli di emolisi, come indicato dal plasma di colore sempre più rosso. Questo è un effetto della deossigenazione e non è causato dall'agitazione stessa come indicato dalla mancanza di emolisi in campioni mescolati senza elio. Sia la fosfoproteina stimolata dal vasodilatatore che i livelli di espressione VASP e fosforilato-VASP nelle piastrine sono diminuiti con l'aumento dell'ematocrito nei campioni deossigenati rilevati dalla macchia occidentale.Il trattamento con un donatore di ossido nitrico di breve durata aumenta l'espressione di fosfoproteina stimolata dal vasodilatatore fosforilato nelle piastrine entro 10 secondi dal trattamento. Inoltre, i livelli di Phosphorylated-VASP o P-VASP sono rimasti stabili fino a 10 minuti dopo l'incubazione del donatore di NO con plasma ricco di piastrine, indicando che c'è tempo sufficiente per separare gli RBC dalle piastrine senza influire sui livelli di P-VASP esistenti. Il nitrito aumenta anche i livelli di P-VASP della piastrinica in presenza di RBC deossigenati.Qui il rapporto tra P-VASP e VASP totale dipende dal livello di ematocrito. VASP è altamente espresso in piastrine ed è rapidamente fosforilato in presenza di ossido nitrico. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'induzione dell'ossido nitrico da vari stimoli fisiologici.Con questo metodo, abbiamo utilizzato con successo l'aumento del P-VASP nella piastrine come marcatore di stimolazione dell'ossido nitrico da nitrito inalato in vivo. Non dimenticare che lavorare con la piastrina con un campione biologico deve sempre essere eseguito utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Ricerca

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Luminescenza Imaging Cerenkov (CLI) per il monitoraggio Cancer Therapy

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th nefrectomia in combinazione con dieta di sale e di ossido nitrico sintasi Inibizione di indurre la malattia renale cronica nel ratto Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Routine di metodo di Screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Analisi dell'attività dell'endotossina per il rilevamento dell'endotossiamia del sangue intero nei pazienti in malattia critica

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Un nuovo sistema di maschere per inalazione per fornire alte concentrazioni di gas ossido nitrico in soggetti che respirano spontaneamente

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...