Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Este trabalho foi financiado pela concessão intramural do NIH para Dr Alan N. Schechter.

Nota: Amostras de sangue foram obtidas do banco de sangue do NIH (IRB aprovado protocolo: 99-CC-0168).
1. preparação da amostra sangue
Nota: Para evitar a ativação plaquetária, tirar sangue lentamente e misture suavemente com citrato o tubo várias vezes por inversão.
<ol><li>
Preparação do plasma rico em plaquetas (PRP)
	<ol>
<li>Desenhar a 30-50 mL de sangue usando um 20g ou agul...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Desde que as plaquetas são facilmente ativadas, suave manipulação de plaquetas contendo amostras é necessária. Pipetagem rápido e agitação vigorosa devem ser evitadas. Inibidores de plaquetas como a prostaciclina (PGI2) podem ser usados para prevenir a ativação plaquetária; no entanto, isso pode afetar algumas vias de sinalização no interior das plaquetas. Para a preparação de pelotas de plaquetas, podemos adicionar ACD para as suspensões de plaquetas e usar centrifugação de baixa velocidade....

As plaquetas são fragmentos de células pequenas em forma de disco, derivados de megacariócitos que são cruciais para a coagulação do sangue. A cascata de coagulação é iniciada por várias moléculas bioativas (como colágeno ou ADP), lançadas após a lesão da parede vascular. O processo de coagulação do sangue pode ser modificado, entre vários efetores pelo óxido nítrico (NO). Não, naturalmente produzido por células de mamíferos, é um dos mais versáteis sinais fisiológicos. Ele age como um potente vasodilatador e neurotransmissor modulador imune, para citar algumas das suas múltiplas funções. Na corrente sanguínea, também não ajuda a regular o grau de coagulação do sangue inibindo a agregação plaquetária. Dentre as fontes mais prováveis de não na corrente sanguínea é o nitrito, um íon inorgânico que tem sido mostrado para servir como um precursor do n. º Reagindo com glóbulos vermelhos (hemácias), o nitrito é reduzido a n e deoxyHb é oxidado a metahemoglobina1. Não lançado de hemácias é vasoativas e faz com que vasorrelaxamento2. Esta via de redução de nitrito não é uma alternativa pathway nenhuma geração, atuando junto com e não complementando a clássica nenhum caminho de geração pela endotelial de óxido nítrico sintase em condições de hipóxicos.
As plaquetas se não são capazes de reduzir o nitrito em não, mas são muito sensíveis à sua presença. Em plaquetas intactas, não no nanomolar gama aumenta GMPc (CE50 = 10 nM) e fosforilação da VASP (CE50 = 0,5 nM)3. Portanto, as plaquetas podem servir como um excelente sensor de redução de nitrito por hemácias e liberação no sangue. Existem vários métodos que podem diretamente a medir o grau de Ativação plaquetária - como aggregometry e tromboelastografia (TEG)4,5. No entanto, estes métodos requerem instrumentação especializada cara e prefere grandes quantidades de material. Também é possível monitorar eventos a jusante, depois não é liberada de hemácias, usando as mudanças na expressão de proteínas de superfície de plaquetas – como P-selectina6. Não é também conhecida por aumentar a quantidade de cGMP em plaquetas7. Anteriormente, nós costumávamos cGMP monitorar sem libertação no sangue após a redução de nitrito por venoso RBC8. Isto provou para ser um método muito sensível; no entanto, cGMP é uma molécula de curta duração, e a sua detecção envolve extensa do trabalho. Outra possibilidade, descrita o protocolo apresentado, usa fosforilação do phospho vasodilatador-estimulada (VASP)-proteína para detectar a presença de n no sangue. VASP é um substrato de ativação de proteína quinase G, que é fosforilada mediante a interação com n através do sGC/cGMP via9. Detectável fosforilação VASP ocorre sem nenhum muito baixa concentrações, que poderiam fazer um detector muito sensível de nenhuma presença a plaquetas no sangue. VASP é altamente expresso em plaquetas, mas não em outras células do sangue, que permite seguir seletivamente os eventos envolvendo plaquetas10.
O objetivo principal do presente protocolo é descrever o método em detalhes para a detecção de liberação no sangue inteiro usando sua interação com as plaquetas, monitorando a VASP fosforilação11,12. O método descrito permite detecção precoce de baixa sem concentrações - teoricamente na faixa nanomolar que torna o presente protocolo mais sensível do que a determinação de cGMP, devido ao uso de técnicas de padrão ocidental do borrão realizáveis em laboratório a maioria dos Configurações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

As plaquetas são os componentes do sangue responsáveis pela coagulação do sangue. Sua função é altamente regulada por vários caminhos. Um dos mais potentes agentes vasoativas, óxido nítrico (NO), também pode atuar como um potente inibidor da agregação plaquetária. Direto não detecção no sangue é muito desafiador devido à sua alta reatividade com hemoglobina livre celular que não limita nenhum Half-Life para o intervalo em milissegundos. Atualmente, nenhuma alteração após intervenções são apenas estimadas baseado no medido mudanças de nitritos e nitratos (membros da via metabólica de nitrato-nitrito-não). No entanto preciso, as medidas são um pouco difícil de interpretar vis a vis um real sem alterações, devido a nitrito de base naturalmente elevada e nitrato de níveis que são várias ordens de magnitude maior do que esperado mudanças sem si. Portanto, o desenvolvimento de métodos simples e diretos que permita um para detectar não diretamente está muito atrasado. Este protocolo aborda um potencial uso de plaquetas como um altamente sensível sem sensor no sangue. Como não geradores descreve plasma rico de inicial de plaquetas (PRP) e preparações de plaquetas lavadas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio. Fosforilação da VASP em serina 239 (P-VASPSer239) é usada para detectar a presença de n º. O fato de que a proteína da VASP é altamente expresso em plaquetas e que é rapidamente fosforilada quando não está presente leva a uma oportunidade única de usar esta via para detectar diretamente sem a presença de sangue.

Amostras de sangue venoso tem valores de2 pO entre 50 e 80 mmHg. Desoxigenação por Hélio diminui rapidamente pO2 a 25 mmHg dentro de 10 min.2pO um pouco mais tempo de Desoxigenação aumento diminui. No entanto, o aumento do tempo de Desoxigenação também leva a um significativamente aumento dos níveis de hemoglobina sem célula (determinado pelo CO-oxímetro, visualmente, visto na Figura 2 como cada vez mais vermelha co...

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Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Aqui, apresentamos um protocolo para abordar o potencial uso de plaquetas como um sensor altamente sensível de óxido nítrico no sangue. Ele descreve a preparação inicial de plaquetas e o uso de nitrito e células vermelhas do sangue pobre em oxigênio como geradores de óxido nítrico.

Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Este protocolo aborda o uso potencial de plaquetas como sensor de óxido nítrico altamente sensível tanto in vitro quanto in vivo dentro do sangue. O aumento da fosforproteína estimulada por vasodilatador ou serina P-VASP 239 em óxido nítrico plaquetas tem algumas vantagens, incluindo a capacidade de detectar a presença de óxido nítrico em linhagens nanomolares. Dentro de duas horas após a coleta de 30 a 50 mililitros de sangue inteiro de um doador saudável, adicione cinco alíquotas mililitros do sangue no número apropriado de tubos cônicos de 15 mililitros para centrifugação.Use uma pipeta de transferência de plástico para coletar cuidadosamente o plasma rico em plaquetas da porção superior dos supernantes. Pellule as plaquetas ricas em plasma com uma segunda centrifugação e lave suavemente as pelotas em cinco mililitros de tampão CGS. Centrifugar a 400 g por 10 minutos em temperatura ambiente.No final da centrifugação, resuspenque as pelotas em três mililitros de tampão Tyrode modificado. Use um hemótmetro para contar e ajuste a densidade das suspensões plaquetas para três vezes 10 para as oitavas células por mililitro em tampão Tyrode fresco. Em seguida, incubar as suspensões plaquetas por uma hora a 37 graus Celsius.Enquanto isso, colete os glóbulos vermelhos das camadas de plasma livres de placas de amostras de sangue inteiros por centrifugação, seguido por quatro lavagens em cinco mililitros de PBS por lavagem. Após a última lavagem, descarte os supernacantes e misture os glóbulos vermelhos com um mililitro das plaquetas ricas em plasma no hematocrit experimental apropriado em garrafas de polipropileno fechadas com rolhas de borracha. Insira uma agulha conectada a um tanque de gás hélio em cada septa e insira 26 agulhas de calibre para fazer saídas de gás.Em seguida, gire lentamente as garrafas à temperatura ambiente e use um oxímetro para medir a pressão parcial de oxigênio para o monitoramento do processo de desoxigenação. A taxa de diminuição do oxigênio depende da taxa de fluxo de hélio e da velocidade de agitação. Portanto, o tempo da oxigenação deve ser otimizado antes de iniciar um experimento, pois isso é altamente dependente da geometria da configuração experimental.Para a redução do nitrito de glóbulos vermelhos, use uma microsinga para injetar nitrito através do septo nas amostras desoxigenadas de PRP e RBCs para que uma concentração final de 10 micromolars seja alcançada. Incubar as amostras por pelo menos 10 minutos a 37 graus Celsius e transferir um mililitro de cada amostra em um tubo de microcentrifuuga para centrifugação. Transfira 300 microliters de suspensão plaqueta da porção superior dos supernantes em novos tubos de microcentrifuuagem e adicione dextrose citrato ácido a cada tubo em uma proporção de um a nove.Centrifugar as plaquetas novamente e resuspensar as pelotas em 80 microliters de tampão de lise gelada contendo coquetel inibidor de protease três para cada tubo. Em seguida, carregue 15 microgramas de proteína de cada amostra para dois géis separados de 10% SDS-PAGE. Execute os géis a 120 volts por 1,3 horas.No final da corrida, transfira os géis para membranas individuais de celulose nitrosa e bloqueie qualquer ligação inespecífica com um volume apropriado de leite seco de 5% sem gordura. Incubar as membranas com os anticorpos primários apropriados durante a noite a quatro graus Celsius seguidos de rotulagem com um anticorpo peroxidase de rabanete secundário apropriado por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, exponha as membranas com um imager para quantificar a densidade da banda com um programa de análise de imagem apropriado.Amostras de sangue venoso saudáveis têm valores parciais de pressão de oxigênio entre 50 e 80 milímetros de mercúrio. A desoxgenação por hélio diminui rapidamente a pressão parcial do oxigênio para 25 milímetros de mercúrio em 10 minutos. Uma maior diminuição da pressão parcial de oxigênio pode ser alcançada com um tempo de desoxigenação aumentado.O aumento da desoxigenação leva ao aumento dos níveis de hemólise, como indicado pelo plasma de cor cada vez mais vermelho. Este é um efeito da desoxigenação e não é causado por mexer-se como indicado pela falta de hemólise em amostras agitadas sem hélio. Tanto a fosfoproteína estimulada vasodilator quanto os níveis de expressão VASP e Phosphorylated-VASP em plaquetas diminuíram com o aumento do hematocríto em amostras desoxigenadas detectadas pela mancha ocidental.O tratamento com um doador de óxido nítrico de curta duração aumenta a expressão de fosfoproteína estimulada por vasodilatador em plaquetas dentro de 10 segundos de tratamento. Além disso, os níveis de Phosphorylated-VASP ou P-VASP permaneceram estáveis até 10 minutos após a incubação do doador NO com plasma rico em plaquetas indicando que há tempo suficiente para separar RBCs de plaquetas sem afetar os níveis P-VASP existentes. O nitrito também aumenta os níveis P-VASP da plaqueta na presença de RBCs desoxigenados.Aqui a razão entre P-VASP e VASP total depende do nível de hematócrito. VASP é altamente expresso em plaqueta e é rapidamente fosfoilado na presença de óxido nítrico. Portanto, este protocolo fornece um método para estudar a indução de óxido nítrico por vários estímulos fisiológicos.Com este método, temos usado com sucesso o aumento P-VASP em plaqueta como um marcador de estimulação de óxido nítrico por nitrito inalado in vivo. Não se esqueça que trabalhar com plaquetas com um espécime biológico deve ser sempre realizado usando o equipamento de proteção pessoal adequado.

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