Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por beca intramural NIH a Dr. Alan N. Schechter.

Nota: Se obtuvieron muestras de sangre de banco de sangre del NIH (IRB aprobó protocolo: CC-99-0168).
1. preparación de muestras de sangre de
Nota: Para evitar la activación plaquetaria, extraer la sangre lentamente y mezclar suavemente con el citrato invirtiendo el tubo varias veces.
<ol><li>
Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP)
	<ol>
<li>Dibujar 30 – 50 mL de sangre con un...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Puesto que las plaquetas se activan fácilmente, suave manejo de plaquetas que contienen las muestras se requiere. Debe evitarse uso rápido y vigoroso. Plaquetarios tales como prostaciclina (PGI2) pueden utilizarse para prevenir la activación plaquetaria; sin embargo, esto puede afectar algunas vías de señalización dentro de las plaquetas. Para la preparación de gránulos de la plaqueta, añadir ACD a las suspensiones de plaquetas y utilizar centrifugación a baja velocidad.
R...

Las plaquetas son fragmentos de células pequeñas en forma de disco, derivados de megacariocitos que son cruciales para la coagulación de la sangre. La cascada de coagulación se inicia por diversas moléculas bioactivas (como colágeno o ADP), publicadas después de la lesión de pared vascular. El proceso de coagulación de la sangre puede ser modificada, entre varios generadores de óxido nítrico (NO). NO, producida naturalmente por las células de mamífero, es una de las señales fisiológicas más versátiles. Actúa como un potente vasodilatador, neurotransmisor y modulador inmune, por nombrar algunos de sus múltiples funciones. En el torrente sanguíneo, NO también ayuda a regular el grado de coagulación de la sangre al inhibir la agregación plaquetaria. Una de las fuentes más probables de NO en el torrente sanguíneo es el nitrito, un ion inorgánico que se ha demostrado para servir como un precursor del NO. Reaccionan con los glóbulos rojos (gr), nitrito se reduce a NO y deoxyHb se oxida a metahemoglobina (metHb)1. NO liberado de los glóbulos rojos es vasoactivo y causa vasorelaxation2. Esta vía de la reducción del nitrito es suplente NO generación, actuando junto con y no complementa el clásico ningún camino de generación de óxido nítrico sintasa endotelial en condiciones hipóxicas.
Las plaquetas no se son capaces de reducir el nitrito a NO, pero son muy sensibles a su presencia. En plaquetas intactas, NO en el nanomolar gama aumenta el GMPC (EC50 = 10 nM) y fosforilación de VASP (EC50 = 0,5 nM)3. Por lo tanto, las plaquetas pueden servir como un excelente sensor de reducción de nitritos por los glóbulos rojos y no hay liberación en sangre. Hay varios métodos que pueden medir directamente el grado de activación de las plaquetas - Tromboelastografía (TEG) como aggregometry de4,5. Sin embargo, estos métodos requieren costosos instrumentos especializados y grandes cantidades de material. También es posible monitorizar eventos río abajo, después NO es liberado de los glóbulos rojos, con los cambios en la expresión de proteína de la superficie plaquetaria – tales como P-selectina6. NO también se conoce para aumentar la cantidad de GMPC en las plaquetas7. Anteriormente, solíamos cGMP no supervisar ninguna liberación en sangre después de la reducción de nitrito por desoxigenada RBC8. Esto resultó para ser un método muy sensible; sin embargo, cGMP es una molécula de breve duración y su detección implica mano de obra extensa. Otra posibilidad, descrito en el protocolo presentado, utiliza la fosforilación de la fosfo estimulada por vasodilatador (VASP)-proteína para detectar la presencia de NO en sangre. VASP es un sustrato de la activación de proteína quinasa G, que es fosforilado a la interacción con NO a la sGC/cGMP pathway9. Fosforilación de VASP detectarse ocurre en NO muy baja concentraciones, que podrían hacer que las plaquetas un detector muy sensible de NO presencia en la sangre. VASP se expresa altamente en las plaquetas, pero no en otras células de la sangre, que permite para seguir selectivamente los acontecimientos que involucran a las plaquetas10.
El objetivo principal de este protocolo es describir el método detalladamente para la detección de ninguna liberación en sangre entera mediante su interacción con las plaquetas mediante el control de VASP fosforilación11,12. El método descrito no permite la detección temprana de baja las concentraciones - teóricamente en el rango nanomolar que hace más sensible que la determinación de la cGMP, debido al uso de técnicas de Western blot estándar alcanzables en laboratorio la mayoría del presente Protocolo Configuración.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Las plaquetas son los componentes de la sangre responsables de coagulación de la sangre adecuada. Su función es altamente regulada por diversas vías. Uno de los más potentes agentes vasoactivos óxido nítrico (NO), también puede actuar como un potente inhibidor de la agregación plaquetaria. Directo detección en sangre no es muy difícil debido a su alta reactividad con la hemoglobina libre que no limita Half-Life a la gama del milisegundo. Actualmente, ningún cambio después de las intervenciones sólo se calculan basado en los cambios medidos de nitrito y nitrato (miembros de la vía metabólica de nitrato-nitrito-NO). Sin embargo precisa, estas mediciones son más bien difíciles de no interpretar frente a real cambios, debido al nitrito inicial alto y niveles que son varios órdenes de magnitud mayores que los cambios esperados NO sí mismo del nitrato. Por lo tanto, el desarrollo de métodos simples y directos que le permiten detectar directamente NO es mucho. Este protocolo dirige a un potencial uso de plaquetas como altamente sensibles sin sensor en sangre. Califica de plasma rico en plaquetas inicial (PRP) y preparados de plaquetas lavadas y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos NO generadores. Fosforilación de la VASP en serina 239 (P-VASPSer239) se utiliza para detectar la presencia de NO. El hecho de que proteínas VASP se expresaron altamente en las plaquetas y que se fosforila rápidamente cuando NO está presente conduce a una oportunidad única para utilizar esta vía para detectar directamente la presencia en sangre.

Muestras de sangre venosa tienen valores de pO2 entre 50-80 mmHg. Desoxigenación por helio disminuye rápidamente la pO2 a 25 mmHg dentro de 10 minutos mayor detracción de oxígeno tiempo un poco más disminuciones pO2. Sin embargo, aumento del tiempo de detracción de oxígeno conduce también a significativamente mayores niveles de hemoglobina libre (determinada por co-oximetría, visualmente vista en la figura 2 como colo...

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Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Aquí, presentamos un protocolo para abordar el uso potencial de las plaquetas como un sensor altamente sensible de óxido nítrico en la sangre. Describe la preparación de plaquetas inicial y el uso de nitrito y desoxigenadas glóbulos rojos como generadores de óxido nítrico.

Detección basada en plaquetas de óxido nítrico en sangre mediante la medición de VASP fosforilación

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Este protocolo aborda el uso potencial de plaquetas como sensor de óxido nítrico altamente sensible tanto in vitro como in vivo dentro de la sangre. Aumento de la fosotilproteína fosforilada-estimulada o serina P-VASP 239 en plaquetas el óxido nítrico tiene algunas ventajas, incluyendo la capacidad de detectar la presencia de óxido nítrico en linajes nanomolares. Dentro de las dos horas siguientes a la recolección de 30 a 50 mililitros de sangre entera de un donante sano, agregue cinco mililitros alícuotas de sangre en el número adecuado de tubos cónicos de 15 mililitros para la centrifugación.Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger cuidadosamente el plasma rico en plaquetas de la parte superior de los sobrenadantes. Pele el plasma de plaquetas con una segunda centrifugación y lave suavemente los pellets en cinco mililitros de tampón CGS. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la centrifugación, resuspender los pellets en tres mililitros de tyrode tyrode modificado. Utilice un hemocitociómetro para contar y ajuste la densidad de las suspensiones plaquetarias a tres veces 10 a las octavas células por mililitro en el tampón Tyrode fresco. Luego incubar las suspensiones plaquetarias durante una hora a 37 grados Centígrados.Mientras tanto, recoger los glóbulos rojos de las capas plasmáticas libres de placas de toda la muestra de sangre por centrifugación seguido de cuatro lavados en cinco mililitros de PBS por lavado. Después del último lavado, deseche los sobrenadantes y mezcle los glóbulos rojos con un mililitro de plaquetas ricas en plasma en el hematocrito experimental adecuado en botellas de polipropileno cerradas con tapones de goma. Inserte una aguja conectada a un tanque de gas helio en cada septo e inserte agujas de calibre 26 para hacer salidas de gas.A continuación, gire lentamente las botellas a temperatura ambiente y utilice un oxímetro para medir la presión parcial de oxígeno para el monitoreo del proceso de desoxigenación. La tasa de disminución del oxígeno depende del caudal de helio y de la velocidad de agitación. Por lo tanto, el tiempo de la oxigenación debe optimizarse antes de comenzar un experimento, ya que esto depende en gran medida de la geometría de la configuración experimental.Para la reducción de nitrito de glóbulos rojos, utilice un microsyringe para inyectar nitrito a través del tabique en las muestras desoxigenadas de PRP y RBC de modo que se alcance una concentración final de 10 micromolares. Incubar las muestras durante al menos 10 minutos a 37 grados centígrados y transferir un mililitro de cada muestra a un tubo de microcentrífuga para centrifugación. Transfiera 300 microlitros de suspensión plaquetaria de la parte superior de los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga y agregue dextrosa de citrato ácido a cada tubo en una proporción de uno a nueve.Centrifugar las plaquetas de nuevo y resuspender los pellets en 80 microlitros de tampón de lysis helada que contiene inhibidor de la proteasa cóctel tres a cada tubo. A continuación, cargue 15 microgramos de proteína de cada muestra en dos geles separados de 10%SDS-PAGE. Ejecute los geles a 120 voltios durante 1,3 horas.Al final de la carrera, transfiera los geles a membranas individuales de celulosa nitrosa y bloquee cualquier unión inespecífico con un volumen adecuado de 5% de leche seca sin grasa. Incubar las membranas con los anticuerpos primarios apropiados durante la noche a cuatro grados centígrados seguidos de etiquetado con un anticuerpo secundario de rábano de rábano de caballo apropiado durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, exponga las membranas con un imager para cuantificar la densidad de la banda con un programa de análisis de imagen adecuado.Las muestras de sangre venosa saludables tienen valores parciales de presión de oxígeno entre 50 y 80 milímetros de mercurio. La desoxgenación por helio disminuye rápidamente la presión parcial del oxígeno a 25 milímetros de mercurio en 10 minutos. Se puede lograr una mayor disminución de la presión parcial de oxígeno con un mayor tiempo de desoxigenación.El aumento de la desoxigenación conduce a un aumento de los niveles de hemólisis como se indica en el plasma de color rojo. Este es un efecto de la desoxigenación y no es causado por agitarse como lo indica la falta de hemólisis en las muestras agitadas sin helio. Tanto los niveles de expresión de fosfoproteína espirituosatoria-estimulada por vasodilatadores como VASP y fosforilado-VASP en plaquetas disminuyeron con el aumento del hematocrito en muestras desoxigenadas detectadas por la mancha occidental.El tratamiento con un donante de óxido nítrico de corta duración aumenta la expresión de fosfoproteína estimulada por vasodilatador fosforilado en las plaquetas dentro de los 10 segundos del tratamiento. Además, los niveles de Fosforilado-VASP o P-VASP se mantuvieron estables hasta 10 minutos después de la incubación del donante NO con plasma rico en plaquetas, lo que indica que hay tiempo suficiente para separar los glóbulos rojos de las plaquetas sin afectar los niveles existentes de P-VASP. El nitrito también aumenta los niveles de P-VASP de plaquetas en presencia de glóbulos rojos desoxigenados.Aquí la relación de P-VASP al VASP total depende del nivel de hematocrito. VASP está muy expresado en plaquetas y se fosforila rápidamente en presencia de óxido nítrico. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método para estudiar la inducción de óxido nítrico por diversos estímulos fisiológicos.Con este método, hemos utilizado con éxito el aumento de P-VASP en plaquetas como un marcador de estimulación de óxido nítrico por nitrito inhalado in vivo. No olvide que el trabajo con plaquetas con una muestra biológica siempre debe realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.

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