Name: platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Bu eser NIH intramural hibe Dr Alan N. Schechter tarafından finanse edildi.

Not: Kan örnekleri NIH Kan Bankası'ndan elde (IRB onaylı protokolü: 99-CC-0168).
1. kan örnek hazırlama
Not: Trombosit aktivasyon önlemek için yavaş yavaş kan alıp birkaç kez tüp ters çevirme tarafından sitrat ile karışımı yavaşça.
<ol><li>
Trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlık
	<ol>
<li>30 – 50 mL kan bir 20 G veya daha büyük çaplı iğne kullanar...

<ol>
	<li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry.">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li><li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation.">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li><li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide/cGMP/phosphodiesterase-5+pathway.">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li><li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography.">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li><li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose.">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li><li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes.">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).</li><li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase.">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li><li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation.">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).</li><li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody.">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li><li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways.">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li><li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation.">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li><li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+(P-VASPSer239)+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes.">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).</li><li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs:+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li><li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets.">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li></ol>

Trombosit kolayca etkinleştirilir beri trombosit içeren işlenmesi nazik örnekleri gereklidir. Hızlı pipetting ve güçlü sallayarak kaçınılmalıdır. Trombosit inhibitörleri gibi prostacyclin (PGI2) trombosit aktivasyon önlemek için kullanılabilir; Ancak, bu bazı sinyal yolları içinde trombosit etkileyebilir. Trombosit granül kursları, ACD trombosit süspansiyonlar ekleyebilir ve düşük hızlı Santrifüjü kullanabilirsiniz.
Taze hazırlanmış trombositlerin P...

Trombosit kan pıhtılaşması için çok önemli megakaryocytes türetilen küçük hücreli disk şeklindeki oluşuyor. Pıhtılaşma cascade vasküler duvar yaralanma sonra yayımlanan çeşitli biyoaktif molekülleri (örneğin, kollajen veya ADP) tarafından başlatılır. Kan pıhtılaşma işlemi, nitrik oksit (NO) tarafından çeşitli effectors arasında değiştirilebilir. Hayır, doğal memeli hücreleri tarafından üretilen, çok yönlü fizyolojik sinyalleri biridir. Bir güçlü vazodilatör, nörotransmitter ve birçok işlevleri bir kaç isim için bağışıklık modülatör olarak davranır. Kan dolaşımında, Hayır da pıhtılaşması kan trombosit toplama engelleyerek ölçüde düzenleyecek yardımcı olur. No kan olasılıkla kaynaklarından biridir nitrit, No bir habercisi hizmet etmek için gösterilen bir inorganik iyon Kırmızı kan hücreleri (RBCs) ile tepki, nitrit Hayır olarak azalır ve deoxyHb methemoglobin (metHb)1' e okside. Hayır RBCs yayımlanan vazoaktif ve vasorelaxation2neden olur. Bu nitrit azaltma yolu bir başka hiçbir üretimi, ile birlikte hareket eden ve klasik üretimi yol hipoksik koşulları, endotelyal nitrik oksit sentaz tarafından tamamlayan yoludur.
Trombosit kendilerini nitrit NO azaltmak mümkün değildir ama onun hazır bulunma için çok hassas. Sağlam trombosit içinde nanomolar içinde Hayır cGMP aralığını artırır (EC50 = 10 nM) ve fosforilasyon VASP (EC50 0,5 = nM)3. Bu nedenle, trombosit mükemmel bir sensör nitrit azaltma RBCs ve hiçbir yayın kana olarak sunabilir. Trombosit aktivasyon - aggregometry ve Tromboelastografi (TEG) gibi ölçüde doğrudan ölçebilirsiniz birkaç yöntem vardır4,5. Ancak, bu yöntem pahalı özel araçları ve malzeme oldukça büyük miktarda gerektirir. Aynı zamanda mümkün olan olayları izlemek aşağı akım, Hayır sonra RBCs, platelet yüzey protein ifadesindeki –6P-selektin gibi değişiklikleri kullanarak üzerinden serbest bırakılır. Hayır da trombosit7cGMP miktarını artırmak için bilinir. Daha önce biz hiçbir yayın içine kan deoxygenated RBC8tarafından nitrit azaltma sonra izlemek için cGMP kullanılır. Bu çok hassas bir yöntem olduğunu kanıtladı; Ancak, cGMP kısa ömürlü bir moleküldür ve geniş iş onun algılama içerir. Başka bir olasılık, sunulan protokolünde açıklanan vazodilatör uyarılmış Fosfo (VASP) fosforilasyon kullanır-Hayır kan içinde var olup olmadığını belirlemek için protein. VASP bir substrat-sGC/cGMP yolu9NO ile etkileşim üzerine fosforile protein kinaz G etkinleştirme var. Algılanabilir VASP fosforilasyon oluşur çok düşük Hayır konsantrasyonları, trombosit kanda herhangi bir varlığı çok hassas bir dedektör yapabiliriz. VASP yüksek trombosit ifade edilir, ancak diğer kan hücreleri seçerek trombosit10içeren olayları takip etmek sağlayan değil.
Bu iletişim kuralının temel amacı ayrıntılı yöntemi tam kan trombosit ile etkileşimi VASP fosforilasyon11,12izleyerek kullanarak hiçbir sürümde tespiti için tarif etmektir. Açıklanan yöntemi düşük erken teşhis yok konsantrasyonları - teorik olarak mevcut iletişim kuralı standart Western blot ulaşılabilir teknikleri çoğu laboratuvar kullanımı nedeniyle cGMP belirlenmesi daha duyarlı kılan nanomolar aralığında sağlar Ayarlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Supply by NIH blood bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl; sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7653 1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7892-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl; potassium chloride</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3; sodium bicarbonate</td>
			<td>Mallinckrodt Chemical</td>
			<td>7412-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[-ethanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (1 M); magnesium chloride</td>
			<td>Quality Biology</td>
			<td>351-033-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2; calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2089-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red septum stopper NO.29</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB57877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2-; sodium nitrite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8524-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-VASP (Ser239) antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VASP antibody</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>3112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6250-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1705060-200ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-oximeter (ABL 90 flex)</td>
			<td>Radiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-based detection of nitric oxide in blood by measuring vasp phosphorylation

Trombosit kan bileşenleri uygun kan pıhtılaşması için sorumlu vardır. Onların işlevi son derece çeşitli yolları tarafından düzenlenir. En güçlü vazoaktif ajanlar, nitrik oksit (NO), biri de trombosit toplama güçlü bir inhibitörü olarak hareket edebilir. Doğrudan hiçbir algılama kan yok half-life milisaniyelik aralığı için sınırlar boş hücre hemoglobin ile onun yüksek reaktivite nedeniyle çok zor olduğunu. Şu anda, müdahaleler sadece tahmin edilir sonra herhangi bir değişiklik, nitrit ve nitrat (nitrat-nitrit-Hayır metabolik yolu üyeleri) ölçülen değişiklikleri dayalı. Ancak kesin, bu ölçümler vis bir vis gerçek doğal olarak yüksek temel nitrit nedeniyle herhangi bir değişiklik yorumlamak ve büyüklükte birkaç emir hiçbir kendisinin beklenen değişiklikler yüksek düzeylere nitrat oldukça zordur. Bu nedenle, bir Hayır doğrudan algılamak olanak sağlayacak doğrudan ve basit yöntem geliştirme gecikmiş olduğunu. Bu iletişim kuralı hiçbir sensör kan trombosit olarak son derece hassas bir potansiyel kullanımı giderir. HİÇBİR jeneratörler ilk trombosit zengin plazma (PRP) ve yıkanmış trombosit preparatları ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar. VASP fosforilasyon, serin 239 (P-VASPSer239) No var olup olmadığını belirlemek için kullanılır VASP protein yüksek trombosit ifade edilir ve bu hızla oluşturulduğunda fosforile da mevcuttur aslında doğrudan kan içinde yok olup olmadığını belirlemek için bu yolu kullanmak için eşsiz bir fırsat yol açar.

PO2 değerleri arasında 50-80 mmHg venöz kan örnekleri var. Deoxygenation helyum tarafından hızla pO2 10 en az artan deoxygenation zaman biraz daha fazla düşüşler pO2içinde 25 mmHg olarak azalır. Ancak, deoxygenation artan zaman da boş hücre hemoglobin (görsel olarak plazma giderek kırmızı rengi Şekil 2 ' de görülen ortak oksimetre tarafından belirlenen) önemli ölçüde yüksek düzeyde yol açar (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation at JoVE.com

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Burada, trombosit potansiyelini kullanmak son derece hassas nitrik oksit sensör kan olarak adrese bir iletişim kuralı mevcut. Nitrik oksit jeneratörler ilk trombosit hazırlık ve nitrit ve deoxygenated kırmızı kan hücreleri kullanımını açıklar.

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

Bu protokol trombositlerin hem in vitro hem de in vivo kan içinde son derece hassas nitrik oksit sensörü olarak potansiyel kullanımını ele alır. Artmış Fosforiile Vazodilatör-Uyarılmış Fosfoprotein veya P-VASP serine 239 trombositnnitrik oksit bazı avantajları vardır, nanomolar soylarda nitrik oksit varlığını tespit etmek de dahil olmak üzere. Sağlıklı bir donörden 30 ila 50 mililitre tam kan toplandıktan sonra iki saat içinde, santrifüj için uygun sayıda 15 mililitre konik tüplere beş mililitre kan ekleyin.Supernatants üst kısmından trombosit açısından zengin plazmayı dikkatlice toplamak için plastik bir transfer pipetkullanın. Pelet ikinci bir santrifüj ile plazma açısından zengin trombositler ve yavaşça CGS tampon beş mililitre pelet yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika 400 g santrifüj.Santrifüj sonunda, modifiye Tyrode tampon üç mililitre pelet resuspend. Saymak için bir hemositometre kullanın ve trombosit süspansiyonlarının yoğunluğunu taze Tirrode tamponunda mililitre başına sekizinci hücrelere kadar üç kez 10'a ayarlayın. Sonra trombosit süspansiyonlarını 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Bu arada, santrifüj ile tüm kan örneklerinin plakasız plazma katmanlarından kırmızı kan hücrelerini toplamak yıkama başına PBS beş mililitre dört yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, supernatants atın ve kauçuk durdurucular ile kapalı polipropilen şişelerde uygun deneysel hematokrit plazma açısından zengin trombosit bir mililitre ile kırmızı kan hücreleri karıştırın. Her septa içine bir helyum gaz tankına bağlı bir iğne yerleştirin ve gaz çıkışları yapmak için 26 gauge iğne takın.Sonra yavaş yavaş oda sıcaklığında şişe girdap ve deoksijenasyon sürecinin izlenmesi için kısmi oksijen basıncı ölçmek için bir oksimetre kullanın. Oksijen azalma hızı helyum akış hızı ve karıştırma hızına bağlıdır. Bu nedenle, bu son derece deneysel kurulum geometrisi bağlıdır gibi bir deney başlamadan önce oksijenasyon zamanı optimize edilmelidir.Kırmızı kan hücresi nitrit azaltma için, 10 mikromolar son konsantrasyon elde böylece PRP ve RBC deoxygenated örnekleri içine septum yoluyla nitrit enjekte etmek için bir mikroşiniş kullanın. Numuneleri en az 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve her numunenin bir mililitresini santrifüj için mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeni mikrosantrifüj tüpler içine supernatants üst kısmından trombosit süspansiyon 300 mikrolitre aktarın ve bir ila dokuz oranında her tüp asit sitrat dekstroz ekleyin.Trombositleri tekrar santrifüj edin ve her tüpe üç proteaz inhibitörü kokteyli içeren 80 mikrolitre buz soğuk lisis tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Daha sonra, her örnekten 15 mikrogram proteini iki ayrı %10 SDS-PAGE jellerine yükleyin. 1.3 saat boyunca 120 volt jelleri çalıştırın.Çalışma sonunda, jelleri tek tek azot selüloz membranlarına aktarın ve %5 yağsız kuru süt hacmiile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Membranları bir gecede uygun primer antikorlarla dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ardından oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun bir sekonder at turp peroksidaz antikorile etiketleyin. Daha sonra uygun bir görüntü analiz programı ile bant yoğunluğunu ölçmek için bir görüntüleyici ile membranlar maruz.Sağlıklı venöz kan örneklerinin kısmi oksijen basınç değerleri 50 ila 80 milimetre arasında cıvaya sahiptir. Helyum ile deoxgenation hızla 10 dakika içinde cıva 25 milimetre oksijen kısmi basıncı azalır. Kısmi oksijen basıncının daha da azalması, daha fazla oksijensizleşme süresi ile sağlanabilir.Artan deoksijenasyon giderek kırmızı renk plazma ile belirtildiği gibi hemolizi düzeylerinde artışa yol açar. Bu deoksijenasyon un bir etkisidir ve helyumsuz karıştırılan örneklerde hemol eksikliğinden kaynaklandığı gibi kendini karıştırmaktan kaynaklanmaz. Trombositlerdeki vazodilatör uyarılmış fosfoprotein veya VASP ve Fosforilasyonlu-VASP ekspresyonu düzeyleri, batı lekesi ile saptanır.Kısa ömürlü nitrik oksit donör ile tedavi, tedaviden sonraki 10 saniye içinde trombositlerde fosforilasyonlu vazodilatör uyarılmış fosfoprotein ekspresyonunu arttırır. Ayrıca, Fosforitane-VASP veya P-VASP düzeyleri, NO donörün trombosit açısından zengin plazma ile inkübasyonundan 10 dakika sonrasına kadar sabit kaldı ve bu da RbC'lerin mevcut P-VASP düzeylerini etkilemeden trombositlerden ayırmak için yeterli zaman olduğunu gösterdi. Nitrit ayrıca deoksijenadan arındırılmış RBC varlığında trombositP-VASP düzeylerini artırır.Burada P-VASP'nin total VASP'ye oranı hematokrit seviyesine bağlıdır. VASP trombositile yüksek oranda ifade edilir ve nitrik oksit varlığında hızla fosforilasyona neden olur. Bu nedenle, bu protokol çeşitli fizyolojik uyaranlar tarafından nitrik oksit indüksiyon uyşuiçin bir yöntem sağlar.Bu yöntemle trombositte artmış P-VASP'yi inhale nitrit in vivo ile nitrik oksit stimülasyonunun bir belirteci olarak başarıyla kullandık. Biyolojik bir numune ile trombosit ile çalışmanın her zaman uygun kişisel koruma ekipmanı kullanılarak yapılması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Kanser Tedavisi İzleme Cerenkov Lüminesans Görüntüleme (CLI)

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Yüksek Tuz Diyet ve Lewis Rat Kronik Böbrek Hastalığı tetikleyebilecek Nitrik Oksit Sentaz inhibisyonu ile bağlantılı 5/6th nefrektomi

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Trombosit transfüzyonları Microparticles için yöntem eleme rutin

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Ekstrapulmoner Tüberküloz Tespiti için Süperparamanyetik Demir Oksit Nanoprobukların Sentezi, Karakterizasyonu ve Uygulanması

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Eleştirel hasta hastalarda tam kan endotoksemi tespiti için endotoksin aktivite assay

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Kendiliğinden Solunan Deneklerde Yüksek Konsantrasyonlarda Nitrik Oksit Gazı Sağlamak için Yeni Bir Soluma Maske Sistemi

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...