Name: purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue
Uploaded: 2018-11-30T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
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Die Autoren danken ihre Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Research Program (Zuschüsse 6AZ08 und 7AZ26), der NIH-NIAAA (Grant 5R01AA023781-03) und der American Heart Association (Grant 17PRE33660831).

Alle Mäuse wurden in eine feuchte und Temperatur-gesteuert, AAALAC-akkreditierten Tierhaus an der University of Miami Miller School of Medicine untergebracht. Alle Experimente wurden von der University of Miami Miller Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt nach Vorgaben des NIH.
1. Vorbereitung der Beispiel-Extrakt
<ol><li>
Adhärente Zellen
	<ol>
<li>Platte Zellen in 10 cm-Gerichte in geeignete Kulturmedien (1 x 106 bis 1 x 109 Zellen pro Schale für Zell-Linien, wie BV2, HEK-293, und SH-SY5Y, aber ~ 1 x 1015 Zellen pro Schale für primäre Zellen, wie z. B. primären kortikalen Neuronen). Versichern Sie, dass die Zellen sich gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche der Platte verteilen und die Zellen lassen wachsen für 48 h, ~ 100 % Zusammenfluss (37 ° C, 5 % CO2) zu erreichen.</li>
		<li>Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, vorsichtig Aspirieren der Nährmedien und waschen die Zellen 2 X mit vorgewärmte serumfreie Medien unter einer Gewebekultur-Haube.</li>
		<li>Aspirieren serumfreie Medien aus der Schale und 1 mL eiskaltes Extraktionspuffer (0,4 M Schwefelsäure, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0] und 1 x cocktail-Proteasehemmer) zu jedem Gericht.</li>
		<li>Verwenden Sie Schabeisen Kunststoff Zelle zu sammeln alle Zellen in dem Extraktionspuffer (durch Kratzen) und übertragen Sie sie auf eine 1,5 mL Röhrchen mit einer 1.000 µL Pipette beschriftet. Pipettieren der Zellen nach oben und unten 3 X Homogenisierung zu erleichtern.</li>
		<li>Schließen Sie alle Rohre und sofort auf Eis gelegt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hirngewebe
	<ol>
<li>Wenn gefrorenes Gewebe verwendet wird, legen Sie das Gewebe in der prechilled 1,5 mL Tube und tauen Sie es kurz auf Eis. Wenn frische Gewebe verwendet wird, gehen Sie sofort zum 1.2.2 Schritt. Hinweis: Das aktuelle Protokoll beschreibt Verfahren mit gefrorenen Mäusegehirn und Maus präfrontalen Kortex Proben.</li>
		<li>Homogenisieren des Gewebes mit einem handheld Dounce-Homogenisator mit der entsprechenden Menge an Extraktionspuffer und die empfohlene Anzahl von Strichen (Tabelle 1). Zur Vermeidung von übermäßigen Chromatin Zerkleinerung überschreiten Sie der empfohlene Hubzahl nicht.</li>
		<li>Mit einer einzigen Kanal 1.000 µL Pipette übertragen Sie das Homogenat zu einem prechilled 1,5 mL-Tube. Schließen Sie alle Rohre und sofort auf Eis gelegt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung der rohen Histon-Extrakt
<ol><li>Legen Sie die 1,5 mL Röhrchen mit den Zellen oder Gewebe im Extraktionspuffer auf einer rotierenden Plattform ausgesetzt und bei 15 u/min bei 4 ° C ermöglicht die Gewinnung von Rohöl Histone drehen. Hinweis: Die Extraktionszeit variieren für verschiedene Zell- und Gewebetypen und muss für jede Prozedur optimiert werden. Das aktuelle Protokoll präsentiert Ergebnisse nach 15 min, 2 h und 24 h der Extraktion (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5).</li>
	<li>Prechill Microcentrifuge bis 4 ° C. Nach Ablauf der gewünschten Extraktionszeit Zentrifugieren Sie die Rohre mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen des Überstands einschließlich Rohöl Histone, eine neue, prechilled 1,5 mL-Tube. Entsorgen Sie das Pellet.</li>
	<li>Den Überstand bei-80 ° C zu speichern (die Extraktion kann an dieser Stelle gestoppt werden siehe "Stop Schritt" in Abbildung 1) oder sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	<li>Neutralisieren der rohen Histone mit einem Volumen von 1/4 von 5 x Neutralisation Puffer (z.B.1 mL Rohöl Histone 250 µL 5 x Neutralisation Puffer hinzufügen). Mischen Sie gut durch nach oben und unten 6 X pipettieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie den pH-Wert des Gemisches mit pH-Streifen. Passen Sie entsprechend durch Zugabe von mehr Neutralisation Puffer um einen pH-Wert von 7 zu erreichen.</li>
	<li>Das Vorhandensein von Histon bewerten und Nonhistone Protein in der rohen Histon extrahieren wie folgt (Abb. 2).<ol>
<li>12,5 µL 4 x Probenpuffer (Laemmli) 37,5 µL der Probe hinzufügen und 10 Minuten bei 99 ° c denaturieren</li>
		<li>Laden Sie die Probe auf einem SDS-PAGE-Gel und führen Sie das Gel für 1 h bei 100 V.</li>
		<li>Das Gel über Nacht mit Coomassie Brilliant Blue R-250 Färbelösung zu beflecken und destain während drei aufeinander folgenden wäscht (1 h/Waschgang) mit Coomassie Brilliant Blue R-250 entfärben Lösung. Hinweis: Grobe Histone (Abbildung 2) können mit eluierten und gereinigten Histone (d.h.Spalte Eingabe [Abbildung 5A]) verglichen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Reinigung des Core-Histone
<ol><li>
Spalte Gleichgewichtherstellung Spin
	<ol>
<li>Fügen Sie 500 µL Puffer Gleichgewichtherstellung zu jeder Spin-Spalte verwendet wird. Berühren Sie nicht die Spalte-Membran.</li>
		<li>Zentrifuge bei 4 ° C für 3 min bei 800 X g. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie 1 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Histon-Reinigung
	<ol>
<li>Die Spalte 500 µL der Probe von Interesse aus Schritt 2.6 hinzufügen. Zentrifuge bei 4 ° C für 3 min bei 800 X g. Die Flow-through zu sammeln.</li>
		<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt so oft wie erforderlich, die gesamte Probe auf die Säule zu laden. Überfüllen Sie die Spin-Spalte nicht.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Durchströmung von jedem Zentrifugationsschritt Spaltenbindung Effizienz (Abbildung 3) zu analysieren.</li>
		<li>Folgen Sie Schritt 2.7, die Spalte Durchströmung zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spalte-Waschanlagen
	<ol>
<li>Jede Spalte 500 µL der Waschpuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 4 ° C für 3 min bei 800 X g. Sammeln der durchströmten Wäsche (Waschen #1).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 für eine Gesamtmenge von drei Wäschen. Sammeln Sie durchströmten Waschungen #2 und #3. Bündeln Sie die aufeinander folgenden Spalte fließen-durch Waschungen nicht.</li>
		<li>Um die Spalte Histon-Bindung Effizienz weiter zu bewerten, analysieren Sie die drei Spalten Waschungen durch folgende Schritt 2.7 (Abbildung 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Histon-elution
	<ol>
<li>Übertragen Sie die Spalte in eine neue beschriftete 1,5 mL Tube.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL des Puffers Histon Elution. Zentrifuge bei 4 ° C für 3 min bei 800 X g. Speichern der durchströmten enthaltenden Histonproteine.</li>
		<li>Wiederholen Sie für eine zusätzliche Elution Schritt 3.4.2. Kombinieren Sie der ersten und zweiten durchströmten Eluate nicht, da sie in Histon-Menge und Reinheit unterscheiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. die Ausfällung von Core-Histone
<ol><li>Die gereinigten Histone, eine Endkonzentration von 4 % Perchlorsäure (PCA) hinzufügen PCA (z. B.hinzufügen 3 µL 70 % PCA zu 50 µL der gereinigten Histone aus Schritt 3.4.2.</li>
	<li>Zentrifuge für 3 s, alle Restflüssigkeit aus der Rohrwand zu sammeln. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 6 X pipettieren.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre in einem Rack und 24 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Am nächsten Tag, einem Microcentrifuge bis 4 ° C prechill und Zentrifugieren Sie Proben für 75 min. bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, wird ein kleine weiße Pellet mit gefälltem Histone auf der Unterseite des Rohres sichtbar. Tun Sie nicht Strudel der Probenmaterials.</li>
	<li>Sorgfältig Aspirieren überstand und ohne zu stören das Pellet, fügen 500 µL eiskalte 4 % PCA zur Probe.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 4 ° C für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit. Aspirieren Sie sorgfältig den überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2 4,7 X.</li>
	<li>Fügen Sie ohne zu stören das Pellet, 500 µL eiskaltem Aceton. Zentrifugieren Sie bei 4 ° C für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit. Aspirieren Sie sorgfältig den überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4,9 2 X.</li>
	<li>Sorgfältig Aspirieren des Überstands, lassen Sie die Röhren verschlossen und ermöglichen die Probe auf Eis für 30 min. Check zu trocknen, wenn alle verbleibenden Aceton verdunstet ist.</li>
	<li>Lassen Sie die Röhren verschlossen und ermöglichen die Probe trocken bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.</li>
	<li>Das Pellet in 30 µL steriles Wasser Aufschwemmen. Tun Sie nicht Pipettieren rauf und runter. Streichen Sie das Rohr vorsichtig mit einem Finger.</li>
	<li>Verschließen Sie alle Rohre und erlauben Sie die Histonen, für 30-50 min, abhängig von der Größe der Pellets auf Eis wiederherzustellen. Überprüfen Sie, ob das Pellet Nukleinsäuretablette ist.</li>
	<li>Verschließen Sie alle Rohre und ermöglichen Sie das Pellet, weiter bei RT 5 min aufzuwirbeln. Hinweis: Diese Lösung (erste und zweite Elution von Schritt 3.4.3) besteht aus gereinigtem und entsalzten Histone und für weitere Quantifizierung und Histon Acetylierung Analyse verwendet werden.</li>
</ol>(5) Quantifizierung der eluierten Histonproteine
<ol><li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer gemäß Protokoll des Herstellers, um die total Histonproteine erhalten, nachdem die endgültige Elution in Schritt 4.15 zu quantifizieren. Messung der Extinktion bei 230 nm. Bezeichnend für die Kontamination der Probe mit Nukleinsäure-A260/A280 Verhältnis aufzeichnen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgende Formel zur Berechnung der Histon-Konzentration (X): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58648/58648eq1.jpg"> OD ist hier die optische Dichte bei A230 nm gemessen.</li>
	<li>Eine Histon-Konzentration von ~1.5 mg/mL gilt eine Durchschnittsrendite für Zell-Linien, während eine Histon-Konzentration von ~5.0 mg/mL als eine Durchschnittsrendite von 30 mg des Gewebes gilt.</li>
</ol>6. Western-Blot Analyse
<ol><li>Passen Sie die gereinigten und eluierten Histon aus Schritt 4.15 bis ~ 10 µg Histon Protein/Probe.</li>
	<li>Fügen Sie das entsprechende Volumen von Wasser und 4 X Laemmli Probenpuffer laden Volumen einstellen.</li>
	<li>Denaturieren Sie die Proben 10 min bei 99 ° C. Kühlen sie auf Eis. Zentrifuge für 3 s, alle Restflüssigkeit und Kondensation von der Rohrwand zu sammeln.</li>
	<li>Laden Sie die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel und führen Sie das Gel für 1 h bei 100 V.</li>
	<li>Um insgesamt Histon Protein zu visualisieren, das Gel über Nacht mit Coomassie Brilliant Blue R-250 Färbelösung zu beflecken und destain während drei aufeinander folgenden wäscht (1 h/Waschgang) mit Coomassie Brilliant Blue R-250 entfärben Lösung. Hinweis: Der ersten Elution von Histonproteine enthält qualitativ hochwertige Histone (Abb. 5A), während die zweite Elution niedrig, um keine Ebenen der Histone (Abb. 5 b) enthält.</li>
	<li>Zur Quantifizierung von Histon PTMs verwenden ein Transfersystem (siehe Tabelle der Materialien), die Histon-Proteine von der SDS-PAGE-Gel (Schritt 6.4) auf einer PVDF-Membran übertragen.<ol>
<li>Zur Montage der Transfer-Sandwich öffnen Sie die Transfer System Kassette und legen Sie PVDF Membran Stapel (gekennzeichnet als unten +) auf den Boden der Kassette mit der Membran nach oben. Rollen Sie die Membran vorsichtig mit einem Fleck Roller, alle Luft aus dem Stapel zu entfernen und die Membran.</li>
		<li>Legen Sie das Gel auf die Membran, Rollen Sie das Gel sanft mit einem Fleck Roller, keine Luft zwischen der Membran zu entfernen und das Gel und legen Sie den oberen Stapel auf das Gel. Rollen sanft wieder und legen Sie die Kassettenabdeckung auf das Sandwich, fest nach unten drücken und drehen der Nob zu sperren.</li>
		<li>Legen Sie die Kassette in den Transfer-System-Steckplatz. Wählen Sie im Fenster Geräte Turbo-Protokoll. Verwenden Sie ein 3 min-Protokoll für ein einziges Mini-Gel oder eine 7 min-Protokoll für mehr als zwei Mini-Gele.</li>
		<li>Färben Sie die Membran mit Ponceau S Fleck für 5 min und visualisieren Sie die gesamte Histonproteine.</li>
		<li>Waschen Sie sie 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 für 2 h und Block in 5 % für 1 h Inkubation mit primären und sekundären Antikörper Milch (über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei RT, beziehungsweise) oder nach einem zuvor optimiertes Protokoll. Hinweis: In der aktuellen Protokoll, Antikörper gegen acetylierte Histone H4K12 (Abbildung 6 und Abbildung 7) und H3K27 (Abbildung 8) dienten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+an+Epigenetic+Component+in+Long-term+Memory?.">Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory?.</a> Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).</li><li>DeWoskin, V. A., Million, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+pipeline.">The epigenetics pipeline.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).</li><li>Eberharter, A., Becker, P. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bei den laufenden Arbeiten haben wir eine optimierte Methode zum Kern-Histon-Proteine zu reinigen und zu quantifizieren, Histon H3 und H4 PTMs (z.B. Acetylierung) gezeigt. Die vorgestellte Protokoll ist ein umfassender Workflow, der enthält optimierte Verfahren in Bezug auf Zellen und Gehirn Gewebe Vorbereitung, grobe Histon Reinigung und detaillierte Histon Niederschlag, Elution und Quantifizierung, gefolgt sind Histon-Elektrophorese und robuste Histon PTM Quantifizierung. Die große Menge an Details, die hier zur Verfügung gestellten ermöglicht eine reproduzierbare Generation qualitativ hochwertige Daten, trotz des Bedarfs an langen Manipulationen der Histon-Proben.
Viele derzeit veröffentlichten Protokolle erfordern den Einsatz von HPLC, sortenreine Fraktionen der Histone H3 und H419zu isolieren. Obwohl HPLC eine leistungsstarke Technik ist, abschrecken der Komplexität und der niedrigen Durchsatz die meisten Molekularbiologen und unverständliche von seiner häufigen Verwendung. In der Tat HPLC ist nicht zur Verfügung, um viele Labore und hoch qualifiziertem Personal benötigt, um das Gerät zu betreiben. HPLC ist oft zeitaufwendig, teuer und potenziell gefährlich. Präsentiert hier ist eine preiswerte, Medium-Durchsatz Strategie, um Ergebnisse von ähnlicher Qualität erzielen, die HPLC umgeht. Die gemeldeten Strategie ist auch praktisch und geeignet für den Einsatz in fast jedem Labor, da sie einen einfache Drehung Spalte Ansatz verwendet, der keine spezielle Instrument Betrieb Fähigkeiten erfordert. Darüber hinaus wird Histon H3/H4 Tetramer als einen einzigen, reinen, und reichlich Bruchteil, ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung der erhaltenen PTMs auf jedem der Proteine extrahiert.
PTMs reagieren extrem empfindlich auf Änderungen in oxidativen Stress und Veränderungen im pH-Wert20,21. So berichten wir im Gegensatz zu den zuvor veröffentlichten Methoden18, eine wirksame Strategie der Spülung der Zellen in serumfreien Medien, eine minimale metabolische Störung der Zellen zu gewährleisten und die Einmischung der native PTMs mit Serumkomponenten zu vermeiden. Das aktuelle Protokoll nicht nur umgeht die traditionellen Kerne Isolation, sondern bietet auch optimale Zeiten für Zelle lyse und die genaue Gewebe Homogenisierung-Prozedur, die für die Erhaltung der Kernhülle unter Vermeidung nuklearer Aggregation ermöglicht. Obwohl die Extraktionszeit manipuliert werden kann, basierend auf der Anzahl von Zellen, der Zelltyp verwendet, Gewebe-Größe, etc.ist erweiterte Lyse nicht wünschenswert, da es zu der Lyse der Kerne und der DNA-Release, machen die Probe schwierig zu handhaben führen kann. Wichtig ist, gibt es mehrere Kontrollpunkte innerhalb des Protokolls für die Validierung der erfolgreichen Histon-Reinigung (z.B. Schritte 2.7 und 3.2.3). Diese Strategie ermöglicht auch Fehlersuche während des langwierigen Verfahrens.
Eine weitere wichtige und einzigartige Funktion des vorliegenden Protokolls ist seine volle Kompatibilität mit nachgeschalteten western-Blot-Analyse-Tools und andere, falls gewünscht. Histonproteine werden bei ~ 15 kDa13,22,23 erkannt und ebenso zu anderen kleinen Molekulargewicht Proteinen nachgewiesen anspruchsvollen standard Immunoblotting Techniken erkennen. Die Verwendung eines High-Performance und Hochdurchsatz-Transfersystems in Kombination mit optimalen Auflösung Protein Gele ermöglicht die Aufrechterhaltung der Protein native Bestätigung (in Abwesenheit von SDS) und Aktivität in der Abwesenheit von SDS und hoher Auftragswirkungsgrad der niedermolekularen Histon-Proteine, somit gewährleisten eine zuverlässige Histon-PTM-Quantifizierung.

Der Begriff Epigenetik bezieht sich auf vererbbare Veränderungen im Gen-Aktivität, die unabhängig von Veränderungen in der DNA-Sequenz1,2auftreten. Gentranskription und Unterdrückung werden bestimmt durch (1) die Zugänglichkeit der chromosomalen DNA umwickelt ein Octamer Kern-Histon-Proteine (zwei Exemplare jeder H2A, H2B, H3 und H4) und (2) die Verfügbarkeit von Transkriptionsfaktoren und Gerüst Proteine rekrutiert zu spezifischen Promotor Seiten3,4. Gentranskription wird durch Enzym-vermittelten Änderungen spezifischer DNA-Promotor-Standorte und das PTMs Histone Tails5,6,7geregelt. Die N-Termini der Histon H3 und H4 gehören die meisten hoch konservierten Sequenzen in Eukaryonten3bekannt, und ihre posttranslationale Modifikationen haben ausführlich dokumentiert, um eine zentrale Rolle bei der Bestimmung der Chromatinstruktur und 8,9funktionieren. PTMs an die Histone Tails (d.h., Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitination) das Interaktion Potential der Enden zu ändern, beeinflussen den baulichen Zustand und Faltung der Chromatin Faser, und damit, regulieren DNA-Barrierefreiheit und Verarbeitung von4,10,11,12. Acetyl-Gruppen werden hinzugefügt und entfernt von K Rückstände auf Histone Tails durch eine Reihe von spezifischen Histon interagierende epigenetische Enzyme, nämlich Hüte und HDACs, bzw.13. Z. B. nachweislich die Acetylierung der Histone H4 an Lysin 12 (H4K12ac) zuvor die Transkription von Genen im Zusammenhang mit Speicher-Übernahme und Konsolidierung14aktivieren. Darüber hinaus empfehlen einige Linien des Beweises, dass die Enzym-vermittelten epigenetische Kontrolle der Gentranskription ein wesentlicher Aspekt der gesund-zelluläre Wachstum und Differenzierung6,15 ist. Wechsel in der epigenetischen Regulation der Genexpression durch epigenetische Modifikationen der DNA oder durch eine Mutation der epigenetischen Enzyme selbst nachweislich Dysregulated bei menschlichen Erkrankungen, wo Veränderungen in einem bestimmten Gen-Aktivität ein Markenzeichen ist die Pathologie (z.B. Krebs)6,16,17. Damit die Bewertung der Veränderungen beim Kern Histon PTMs entsteht als hochwertige Zielscheibe für mögliche therapeutische Interventionen. Jedoch wurde bestimmen die Fülle, Interaktionspartnern und bestimmte Rollen der Histone PTMs nachgewiesen herausfordernden18.
In dem vorliegenden Bericht wird eine optimierte, Medium-Durchsatz Strategie Core Histone von Zellen und Gehirn Gewebe in einem einzigen Bruchteil und ein vollständiges Protokoll für die Quantifizierung der Histone H3 und H4 PTMs reinigen beschrieben. Der Hinweis Obwohl derzeit veröffentlicht Säure-basierte Reinigungstechniken und Histon Antikörper-basierte Erkennung Strategien wurden für Histon Charakterisierung weithin angenommen, ihnen fehlen beschreibende Angaben wichtige Schritte des Verfahrens, so schnelle und reproduzierbare Histon-Extraktion und Quantifizierung zu behindern. Zum Beispiel die Verarbeitung von Zelle extrahieren und Gewebebiopsien erfordert verschiedene Tools und Technologien für die erfolgreiche Extraktion. Darüber hinaus zeigt das optimierte Protokoll präsentiert im aktuellen Manuskript einen praktischen, Medium-Durchsatz Ansatz. Core-Histone werden als einen einzigen, reinen Bruch extrahiert ermöglicht zuverlässige nachgelagerten Antikörper-vermittelten PTM Erkennung ohne Einmischung von Verunreinigungen. Darüber hinaus haben in der aktuellen Handschrift, die Herausforderungen in Bezug auf Histon-Erkennung durch ihre kleinen Molekulargewicht umgangen worden. In der Regel die mangelnde Kompatibilität zwischen Reinigung, Quantifizierung und Gel-Elektrophorese Protokolle hindern Wissenschaftler replizierbar und aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Hier ist ein optimierter Workflow Core Histone von Zellen und Gewebe zu reinigen und bereiten sie für nachgeschaltete PTM Analysen über western-Blot präsentiert.
Das aktuelle Protokoll ermöglicht die Reinigung von Kern-Histon-Proteine unter Beibehaltung ihrer nativen posttranslationale Modifikationen (d.h., Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung). Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste des Protokolls Histon-Reinigung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-230-204</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% perchloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270725</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator strips, non-bleeding</td>
			<td>Milliipore Sigma</td>
			<td>1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x SDS sample buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop rotor</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-04397-34</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube rack</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-541</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone purification mini kit</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>40026</td>
			<td>spin columns included in the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop instrument</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culute media</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-serum media</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-9035</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610436</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610438</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>RIO-RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S stain</td>
			<td>CellSignalling</td>
			<td>59803S</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885302-0007</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>68973</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4K12ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39166</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39134</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue

In allen Eukaryonten unbedingt Chromatin, die physiologische Vorlage alle genetischen Informationen, Vererbung. Chromatin ist abhängig von einer Reihe von unterschiedlichen posttranslationale Modifikationen (PTMs), die meist in die amino Termini von Histonproteine (d.h. Histon-Tail) auftreten und regulieren die Zugänglichkeit und Funktionszustand der zugrunde liegenden DNA. Histone Tails aus dem Kern der Nukleosom zu verlängern und die Zugabe von Acetyl-Gruppen von Histon-Acetyltransferases (Hüte) und die Beseitigung von Acetyl-Gruppen von Histon Deacetylases (HDACs) beim Zellwachstum und Differenzierung unterliegen. Spezifische Acetylierung Muster auf Lysin (K) Rückstände auf Histone Tails bestimmen eine dynamische Homöostase zwischen transcriptionally aktiv oder transcriptionally verdrängten Chromatin durch (1) Beeinflussung der Rumpfgruppe Histon und (2) recruiting synergistische oder antagonistische Chromatin-assoziierte Proteine auf die Transkription-Website. Der grundlegende Regulierungsmechanismus der komplexen Natur der Histon-Rute PTMs beeinflusst die Mehrheit der Chromatin-templated Prozesse und führt zu Veränderungen in Zelle Reifung und Differenzierung in der normalen und pathologischen Entwicklung. Der vorliegende Bericht soll Anfänger bieten eine effiziente Methode, Kern Histonproteine von Zellen und Hirngewebe zu reinigen und zu zuverlässig Acetylierung Markierungen auf Histone H3 und H4 quantifizieren.

Um das Fortschreiten der Histon-Reinigung-Protokoll und die Zusammensetzung aller analysierten Fraktionen zu veranschaulichen, haben wir verschiedene Histon Auszüge aus menschlichen Mikroglia BV2 Zellen ausgewertet. Um die Quantifizierung der Histone H3 und H4 PTMs (d.h. Acetylierung) zu demonstrieren, haben wir Gehirn Gewebe Lysates verwendet.
BV2 Zellen waren vergoldet 5 x 106 Zellen pro Schale 10 cm Gewebekultur-behandelten Gerichte und erlaubte es zu Konfluenz für 48 h wachsen Zellen wurden dann gesammelt und Histone erschienen von Chromatin durch eine Inkubation im Extraktionspuffer mit 0,4 M Schwefelsäure, 1 mM KCl 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 x Protease-Inhibitor. Die Extraktionszeit von 15 min bis 24 h, hatte keinen Einfluss auf die Gesamtkomposition des rohen Histon Extrakte von Coomassie Brilliant Blue Färbung (Abbildung 2). Nächste, rohen Histone waren äquilibriert Histon Spalten durchlaufen und der Durchfluss wurde analysiert. Spaltenbindung hocheffiziente richtet sich nach der Abwesenheit von Histon Protein in die Durchströmung von Coomassie Brilliant Blue Färbung analysiert. Wir entschlossen die Spaltenbindung Effizienz zu 100 % sein, da gab es keine nachweisbaren Histonproteine vorhanden in den analysierten durchströmten (Abbildung 3). Alle Membranen mit gebundenen Histone wurden dann drei Mal mit Waschpuffer restlichen Verunreinigungen, verlassen nur Histonproteine verpflichtet das Silica-Gel entfernen gewaschen. Wir festgestellt, dass für alle Histon-Extraktion Zeit (d. h., 15 min, 2 h und 24 h), die erste Membran-Wäsche das wichtigste war, Nonhistone Verunreinigungen aus den Spalten zu entfernen, während der zweiten und dritten Wäschen keinen auf die Reinheit der Probe Einfluss. So könnte je nach Probentyp, die letzten zwei Wäschen weggelassen werden. Nach der ersten Elution von Histon-Proteine aus der Spalte (mit Elution Puffer mit 1mM NaCl und EDTA), Histone wurden über Nacht mit 4 % Perchlorsäure ausgefällt dann pelleted, gewaschen und zur Bereicherung der gereinigten Histone H3 analysiert und H4. Wir haben beobachtet, dass 24 Stunden nach der Extraktion Zeit erhöht sich die Menge der H3 und H4 Histone in der gereinigten Fraktion auf 15 min und 2 h Extraktionszeit (Abbildung 5A) verglichen. Die zweite Elution aus der Spalte ergab sich nicht in hoher Qualität oder hohe Menge Histone (Abb. 5 b).
Als nächstes haben wir Gehirn Gewebe Homogenates um Histon H3 und H4 PTMs, nämlich Acetylierung zu quantifizieren. Wildtyp (C57BL6/J) männliche Mäuse wurden verabreicht ein breit wirkenden HDAC-Inhibitor (Tributyrin) in einer Dosis von 5 g/kg oral für 3 d. ganzen Gehirn Gewebe war am 4. Tag gesammelt und roh Histone wurden nach dem beschriebenen Protokoll extrahiert. Mit einem ungepaarten t-Test, wir entschlossen, dass Tributyrin erhöht die Acetylierung der Histone im Rohöl Extrakt (t(6) = 6.184, P = 0,0004); jedoch werden Verunreinigungen im Extrakt erkannt (die Histon-Bänder sind nicht klar definiert). H4K12ac Antikörper muss also keine hohe Spezifität (Abbildung 6). Um die Anwendbarkeit des vorgestellten Protokolls zum kleineren Gewebeschnitte weiter zu bewerten, haben wir den präfrontalen Cortex von Dreifach transgenen Alzheimer-Krankheit erfasst (3 x Tg-AD) behandelten Mäuse täglich mit 10 mg/kg M344, eine Klasse ich und IIb HDAC-Inhibitor, für vier Personen Monaten. Histon-Reinigung und Niederschlag erfolgte gemäß der hierin beschriebenen Protokoll. Mit dem gereinigten Histon H3 und H4 Bruchteil, wir festgestellt, dass M344 H4K12 Acetylierung 2.4-fold erhöht (t(6) = 13.03, P < 0,0001), mit einer hohen Spezifität der H4K12ac Antikörper (Abbildung 7). In ähnlicher Weise, beobachteten wir eine Zunahme der Histon H3 Acetylierung in BV2 Zellen als Reaktion auf eine weitere HDAC-Inhibitor, nämlich der selektiven HDAC3 Inhibitor, RGFP-966. 10 µM RGFP-966 Ursachen eine ca. Verdoppelung der Acetylierung auf Histon H3K27 nach 24 Stunden der Behandlung. Student der ungepaarten t-Test wurde verwendet, um gegen behandelt Kontrollzellen vergleichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig1.jpg"> Abbildung 1: Timeline des Protokolls Reinigung Histon. Alle Schritte zur Histon Analysen sehen Sie unten zusammen mit der geschätzte Zeitaufwand für jeden Schritt. Figuren zeigt das Ergebnis von bestimmten Schritten und innerhalb der Handschrift vorgestellt werden in Klammern bezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig2.jpg"> Abbildung 2: repräsentative Coomassie Brilliant blau gefärbt Gel zeigt grobe Histone BV2 Zellen entnommen. BV2 Zellen waren für 48 h kultiviert, bevor das Histon-Extraktion-Protokoll begann. Grobe Histone wurden extrahiert für 15 min, 2 h und 24 h, mit drei Wiederholungen für jeden Zeitpunkt (Dies ist auch der Fall in Abbildung 3, Abbildung 4und Abbildung 5). Nonhistone und Histon-Proteine sind in der rohen Histon-Extrakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig3.jpg"> Abbildung 3: repräsentative Coomassie Brilliant blau gefärbt Gel demonstrieren Spalte fließen-durch folgende Histon Reinigung Schritte vom BV2 Zellen. Nach Rohöl Histon passieren der Histon-Bindung-Spalte sind nur Nonhistone Proteine in den durchströmten. Histonproteine fehlen in dieser Fraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig4.jpg"> Abbildung 4: Vertreter zeigen eine Spalte Waschen nach einem Histon Reinigungsstufe aus BV2 Zellen Coomassie Brilliant blau gefärbt Gel. Unabhängig von der Histon-Extraktion waren oder (C) 24 h, geringe Mengen von Nonhistone Proteinen (A) (B) 2 h 15 min waren nur in der ersten Wäsche Histonebinding Spalte. Histonproteine fehlten in allen Waschungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig5.jpg"> Abbildung 5: repräsentative Coomassie Brilliant blau gefärbt Gel Elutions nach einem Histon Reinigungsstufe aus BV2 Zellen demonstriert. (A) qualitativ hochwertige gereinigt und entsalzt Histon H3 und H4 wurden nach der ersten Elution aus der Histon-Reinigung-Spalte. (B) die zweite Elution von Histon-Reinigung-Säule eine hohe Qualität oder Quantität der Histone H3 oder H4 nicht nachgeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig6.jpg"> Abbildung 6: die breit wirkenden HDAC Inhibitor, Tributyrin, H4K12 Acetylierung in das ganze Gehirn von Wildtyp Mäusen erhöht. (A) dieses Panel zeigt einem Vertreter westlichen Fleck zeigt eine Erhöhung der H4K12 Acetylierung in der rohen Histon extrahieren abgeholt das ganze Gehirn von Wildtyp Mäusen als Reaktion auf die im großen und ganzen Schauspiel HDAC-Inhibitor, Tributyrin. (B) dieses Panel zeigt die Quantifizierung des Zuwachses im H4K12 Acetylierung in Vivo. Ungepaarten t-Test wurde verwendet, um Gruppen zu vergleichen (t(6) = 6.076, P = 0,0005). Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). N = 8. P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig7.jpg"> Abbildung 7: die Klasse ich und IIb HDAC-Inhibitor, M344, erhöht H4K12 Acetylierung im präfrontalen Kortex der Dreifach transgenen Alzheimer-Krankheit (3 x Tg-AD) Mäuse. (A) dieses Panel zeigt einem Vertreter western blot mit einem Anstieg von H4K12 Acetylierung in den gereinigten und entsalzten Histon-Extrakt aus der präfrontale Kortex von 3 x Tg-AD Mäuse als Reaktion auf die Hemmung der HDACs von M344 gesammelt. (B) zeigt dieses Fenster die Quantifizierung des Anstiegs der H4K12 Acetylierung als Reaktion auf M344 für vier Monate bei einer täglichen Dosis von 10 mg/kg verabreicht. Ungepaarten t-Test wurde verwendet, um Gruppen zu vergleichen (t(6) = 13.30, P < 0,0001). Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM N = 8. P < 0.00001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig8.jpg"> Abbildung 8: die selektive HDAC3-Hemmer, RGFP-966, erhöht H3K27 Acetylierung in BV2 Microglial Zellen. (A) dieses Panel zeigt eine repräsentative western-Blot Darstellung eine Erhöhung der H3K27 Acetylierung in den gereinigten und entsalzten Histon-Extrakt aus BV2 Zellen als Reaktion auf die HDAC3 Hemmung von RGFP-966 gesammelt. (B) RGFP-966 führt ein ca. Verdoppelung der Acetylierung Histon H3 und Lysin (K) 27 nach 24 Stunden der Behandlung. Ungepaarten t-Test wurde verwendet, um gegen behandelt Kontrollzellen vergleichen (t(4) = 5.981, P = 0,002). Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM N = 6. P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Repräsentative Gewebe (eine Hemisphäre) *</td>
			<td>Durchschnittliche Gewebe Gewicht (mg)</td>
			<td>Extraktionspuffer (mL)</td>
			<td>Anzahl der Hübe</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maus Kleinhirn</td>
			<td>40</td>
			<td>1</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frontalen Kortex Maus</td>
			<td>30</td>
			<td>0,3</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maus-hippocampus</td>
			<td>27</td>
			<td>0,3</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maus entorhinalen Kortex</td>
			<td>19</td>
			<td>0,3</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Alle Experimente wurden an erwachsenen männlichen Mäusen durchgeführt.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Durchschnittliches Alter: 16 Monate. Durchschnittliches Gewicht: 30 Gramm.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Optimierte Voraussetzung für Gehirn Gewebe Homogenisierung.

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Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

Der Zweck dieses Artikels ist es, eine umfassende, systematische Leitfaden für die effiziente Reinigung der Histone H3 und H4 und die Quantifizierung von Schimmelpilzschäden Histon-Rückständen.

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Diese Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Kernhistonen H3 und H4 und deren posttranslationalen Modifikationen aus Zell- und Gewebeextrakten, die somit zur Erzeugung hochwertiger, reproduzierbarer Ergebnisse führen. Die vorgestellte Technik hat drei Hauptvorteile. Erstens bewahrt es native post-translationale Modifikationen von Histonen.Zweitens umgeht sie teure Niedrigdurchsatzmethoden. Schließlich ist es vollständig kompatibel mit nachgeschalteten Anwendungen mit mittlerem Durchsatz. Demonstriert wird das Verfahren karolina Janczura eine talentierte Studentin aus meinem Labor, die dieses Protokoll vollständig optimiert und die Technik verwendet, um wichtige Fragen zur epigenetischen Regulation bei Alzheimer zu beantworten.Um die Zellen in 10-Zentimeter-Gewebekultur-behandelten Gerichten mit den entsprechenden Zellkulturmedien nach dem Textprotokoll zu verzieren. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie etwa 90% Konfluenz erreichen. Nachdem die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, saugen Sie die Kulturmedien sanft an und waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmten serumfreien Medien.Danach die serumfreien Medien aus den Zellen entfernen und die 10-Zentimeter-Gerichte auf Eis legen. Fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter eiskalten Extraktionspuffer hinzu. Mit einem Kunststoffzellenschaber sammeln Sie die Zellen im Extraktionspuffer und übertragen sie in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr.Dann legen Sie die Rohre auf Eis. Wenn gefrorenes Gewebe verwendet wird, legen Sie das Gewebe in eine vorgekühlte 1,5-Milliliter-Röhre und tauen Sie es kurz auf Eis auf. Als nächstes homogenisieren Sie das Gehirngewebe mit einem Handhomogenisator mit der empfohlenen Menge an Extraktionspuffer und Anzahl der Striche.Die Homogenisierung ist abgeschlossen, wenn keine sichtbaren Gewebefragmente vorhanden sind und die Lösung ein milchiges Aussehen annimmt. Danach verwenden Sie eine einkanalige 1.000-Mikroliter-Pipette, um das Homogenat in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen und die Rohre auf Eis zu legen. Platzieren Sie das Rohr mit den Zelllysaten und homogenisiertem Hirngewebe auf einer rotierenden Plattform, die sich bei 15 RpM bei vier Grad Celsius dreht.Danach zentrieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes den Überstand auf ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr übertragen und das Pellet entsorgen. Als nächstes neutralisieren Sie die Histone mit einem 1/4 Volumen neutralisationspuffer, und mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.Verwenden Sie pH-Streifen, um den pH-Wert der Mischung zu überprüfen, und passen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit neutralem Neutralisationspuffer weiter an. Wenn saure Histone während dieses Schritts nicht neutralisiert werden, binden sie sich nicht richtig an die Säulenmembran, passieren sie und werden im Durchfluss erkannt. Fügen Sie 37,5 Mikroliter der Probe zu 12,5 Mikroliter Probenpuffer hinzu.Nach einer kurzen Zentrifugation denaturieren die Mischung bei 99 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach die Rohre auf Eis legen und kurz drehen, um Kondensat zu sammeln. Die Probe auf ein SDS-PAGE-Gel laden und das Gel eine Stunde lang mit 100 Volt ausführen.Dann färben Sie das Gel über Nacht. Und entzähnen Sie es während drei aufeinanderfolgenden Wähungen. Fügen Sie zunächst 500 Mikroliter Ausgleichspuffer zu jeder Spinspalte hinzu.Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal. Danach fügen Sie 500 Mikroliter der Probe in die Spalte.Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten und sammeln Sie den Durchfluss. Analysieren Sie dann den Spaltendurchfluss wie zuvor beschrieben. Fügen Sie der Säule 500 Mikroliter Waschpuffer hinzu.Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten und sammeln Sie den Durchfluss. Übertragen Sie die Säule in ein neues beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie der Spalte 50 Mikroliter Histon-Elutionspuffer hinzu.Nach dem Zentrieren der Säule speichern Sie den durchfließenden Histonprotein. Unter einer chemischen Haube perchlorsäure zu den gereinigten Histonen hinzufügen, um eine Endkonzentration von 4% Perchlorsäure zu erreichen. Pipette auf und ab sechs Mal zu mischen.Wenn die Histonen in der Probe sehr konzentriert sind, wird die Lösung nach zugabe von Perchlorsäure trübe. Danach, inkubieren Sie die Röhre bei vier Grad Celsius für 24 Stunden. Wenn der über Nacht Histon-Niederschlag erfolgreich ist, wird ein kleines weißes Pellet auf der Unterseite der Durchstechflasche nach dem Zentrifugationsschritt sichtbar sein.Beim Waschen des Pellets in den aufeinanderfolgenden Schritten stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht gestört wird, da es sich leicht vom Durchstechflascheboden lösen kann. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben für 75 Minuten in vorgekühlten Mikrozentrifugenröhren. Den Überstand vorsichtig ansaugen und 500 Mikroliter eiskalte Perchlorsäure in die pelletierte Probe geben.Nach dem Zentrieren der Probe für 10 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit, aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie der Probe 500 Mikroliter eiskaltes Aceton hinzu und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Als nächstes entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Rohre auf Eis für 30 Minuten unbedeckt trocknen.Dann entfernen Sie die Rohre vom Eis und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für fünf Minuten trocknen. Nachdem das Pellet trocken ist, wird es in 30 Mikroliter sterilem Wasser wieder ausgesetzt. Kappen Sie die Rohre und lassen Sie die Histone 30 bis 50 Minuten auf Eis rekonstruieren.Nachdem Sie überprüft haben, ob das Pellet resuspendiert ist, die Rohre zurückstellen und vom Eis entfernen. In diesem Protokoll wurden Histone aus menschlichen mikrogliaalen BV-2-Zellen gereinigt und die Extraktzusammensetzung analysiert. Das gefärbte Gel zeigt, dass Extraktionszeiten zwischen 15 Minuten und 24 Stunden die Gesamtzusammensetzung der rohen Histonextrakte nicht beeinflussten.Die Wirksamkeit der Histonbindung an die Matrix der Säule wurde durch Färbung des Gels analysiert. Die Koloneffizienz betrug etwa 100%, wie das Fehlen nachweisbarer Histonproteine im Spaltendurchfluss zeigt. Unabhängig von der Extraktionszeitdauer, d.h.15 Minuten, zwei Stunden oder 24 Stunden. Die erste Säulenwäsche eliminiert die größte Menge an nicht-histonen proteinen aus dem Extrakt. Die gereinigten Histonproteinfraktionen aus der 24-Stunden-Extraktionsgruppe enthielten mehr H3- und H4-Histone im Vergleich zu 15-Minuten- und zweistündigen Extraktionszeiten.Die erste Kolonnenelution war etwa 100% effizient, wie der Mangel an Histonproteinen im zweiten Eluat belegt. Rohe Histone wurden dann aus dem ganzen Maushirn extrahiert und posttranslationale Modifikationen wurden gemessen. Als Reaktion auf den breit wirkenden HADC-Hemmer erhöhte sich Tributyrin, H4K12-Acetylierung im Extrakt.Die Spezifität des Antikörpers verringerte sich jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen im Rohextrakt. Das Histonreinigungsprotokoll wurde mit dem präfrontalen Kortex von dreifach transgenen A/D-Mäusen abgeschlossen, die mit dem HDAC-Inhibitor der Klasse I und IIb, M344, behandelt wurden, und die einzelne reine Kern-Histonfraktion wurde auf Veränderungen der H4K12-Acetylierung untersucht. Als Reaktion auf M344 wurde eine signifikante Zunahme der H4K12-Acetylierung festgestellt.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die im Protokoll beschriebenen mehreren Prüfpunkte auszuführen, um die erfolgreiche Histonreinigung während des gesamten Prozesses zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Fragen zur Histonphosphorylierung und zum Methylierungsstatus behandelt werden. Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für Forscher in unserem Labor, um die genetischen Mechanismen der Alzheimer-Krankheit zu analysieren.Jedoch kann es in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen verwendet werden, wo Chromatin-Modifikation wird vermutet, um eine bedeutende Rolle zu spielen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Mouse Brain Vessels

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Psychophysics Paradigm for the Collection and Analysis of Similarity Judgments

Ein psychophysikalisches Paradigma zur Sammlung und Analyse von Ähnlichkeitsurteilen

Similarity judgments are commonly used to study mental representations and their neural correlates. This approach has been used to characterize perceptual ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...