Name: purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue
Uploaded: 2018-11-30T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
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लेखक स्वास्थ्य प्रवर्तन निदेशालय और Ethel मूर अल्जाइमर अनुसंधान कार्यक्रम (अनुदान 6AZ08 और 7AZ26), NIH-NIAAA (अनुदान 5R01AA023781-03), और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अनुदान 17PRE33660831) के फ्लोरिडा विभाग के लिए उनका आभार व्यक्त करते हैं ।

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	<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+an+Epigenetic+Component+in+Long-term+Memory?.">Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory?.</a> Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).</li><li>DeWoskin, V. A., Million, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+pipeline.">The epigenetics pipeline.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).</li><li>Eberharter, A., Becker, P. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

वर्तमान काम में, हम कोर हिस्टोन प्रोटीन और हिस्टोन H3 और H4 PTMs (जैसे, acetylation) यों तो शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रदर्शन किया । प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक व्यापक कार्यप्रवाह है कि कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक तैयार करने के बारे में अनुकूलित प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है, क्रूड हिस्टोन शुद्धि, और विस्तृत हिस्टोन वर्षण, रेफरेंस, और ठहराव, जिसके बाद कर रहे हैं हिस्टोन ट्रो आणि दमदार हिस्टोन PTM ठहराव. विवरण की बड़ी राशि यहां प्रदान की उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की एक replicable पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, हिस्टोन नमूनों की लंबी जोड़तोड़ की आवश्यकता के बावजूद ।
कई वर्तमान में प्रकाशित प्रोटोकॉल histones H3 और H419के शुद्ध अंशों को अलग करने के लिए HPLC के उपयोग की आवश्यकता है । हालांकि HPLC एक शक्तिशाली तकनीक है, इसकी जटिलता और कम प्रवाह सबसे आणविक जीव और इसके लगातार उपयोग से गैर विशेषज्ञों रोकते । दरअसल, HPLC कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं है, और अत्यधिक कुशल कर्मियों साधन संचालित करने के लिए आवश्यक है । HPLC बार समय लेने वाली है, महंगा है, और संभावित खतरनाक । यहां प्रस्तुत एक सस्ती, मध्यम प्रवाह के लिए समान गुणवत्ता जो HPLC बाईपास के परिणाम प्राप्त करने की रणनीति है । रिपोर्ट की रणनीति भी अधिक व्यावहारिक और लगभग किसी भी प्रयोगशाला में उपयोग के लिए उपयुक्त है के रूप में यह एक सरल स्पिन कॉलम दृष्टिकोण है कि विशेष साधन आपरेशन कौशल की आवश्यकता नहीं है का उपयोग करता है । इसके अतिरिक्त, हिस्टोन H3/H4 tetramer एक, शुद्ध, और प्रचुर मात्रा में एक प्रोटीन के प्रत्येक पर संरक्षित ठहराव के एक विश्वसनीय PTMs को सक्षम करने के रूप में निकाला जाता है ।
PTMs ऑक्सीडेटिव तनाव में परिवर्तन और पीएच20,21में परिवर्तन के लिए अत्यंत संवेदनशील हैं । इस प्रकार, पहले प्रकाशित तरीकों के विपरीत18, हम कोशिकाओं की एक न्यूनतम चयापचय अशांति सुनिश्चित करने के लिए और सीरम घटकों के साथ देशी PTMs के हस्तक्षेप से बचने के लिए सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को धोने की एक कुशल रणनीति की रिपोर्ट. वर्तमान प्रोटोकॉल न केवल पारंपरिक नाभिक अलगाव बाईपास लेकिन यह भी सेल lysis और सटीक ऊतक homogenization प्रक्रिया के लिए इष्टतम समय प्रदान करता है कि परमाणु लिफाफे के संरक्षण के लिए अनुमति देता है, जबकि परमाणु एकत्रीकरण से परहेज । हालांकि निष्कर्षण समय कोशिकाओं की संख्या के आधार पर हेरफेर किया जा सकता है, कोशिका प्रकार का उपयोग किया, ऊतक आकार, आदि, विस्तारित lysis वांछनीय नहीं है के रूप में यह नाभिक और डीएनए रिहाई के lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, नमूना मुश्किल को संभालने के लिए बना. महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल के भीतर कई चौकियों सफल हिस्टोन शुद्धिकरण (जैसे, कदम २.७ और 3.2.3) के सत्यापन के लिए मौजूद हैं । यह रणनीति भी लंबी प्रक्रिया में समस्या निवारण की सुविधा ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण और अनूठी विशेषता अपनी अनुप्रवाह पश्चिमी दाग विश्लेषण उपकरण और दूसरों के साथ पूर्ण अनुकूलता यदि ऐसा है तो वांछित है । हिस्टोन प्रोटीन पर पाए जाते हैं ~ 15 केडीए13,22,23 और, इसी तरह अन्य छोटे आणविक वजन प्रोटीन के लिए, मानक immunoblotting तकनीक से पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित किया गया है. इष्टतम संकल्प प्रोटीन जैल के साथ संयोजन में एक उच्च प्रदर्शन और उच्च प्रवाह हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग प्रोटीन देशी पुष्टि (एसडीएस के अभाव में) और एसडीएस और उच्च हस्तांतरण दक्षता के अभाव में गतिविधि के रखरखाव के लिए अनुमति देता है कम आणविक वजन हिस्टोन प्रोटीन की, इस प्रकार एक विश्वसनीय हिस्टोन PTM ठहराव आश्वस्त ।

शब्द epigenetics जीन गतिविधि है कि डीएनए अनुक्रम1,2में परिवर्तन से स्वतंत्र रूप से होने में heritable परिवर्तन करने के लिए संदर्भित करता है । जीन प्रतिलेखन और दमन (1) गुणसूत्र डीएनए की पहुंच से निर्धारित कर रहे है कोर हिस्टोन प्रोटीन के एक octamer के आसपास लिपटे (दो प्रतियां H2A, H2B, H3, और H4) और द्वारा (2) प्रतिलेखन कारकों और पाड़ प्रोटीन की उपलब्धता विशिष्ट प्रमोटर साइटों के लिए भर्ती3,4। जीन प्रतिलेखन एंजाइम-विशिष्ट डीएनए प्रमोटर साइटों की मध्यस्थता संशोधनों और हिस्टोन पूंछ5,6,7के PTMs द्वारा विनियमित है । एन-टर्मिनी हिस्टोन H3 और H4 के सबसे उच्च संरक्षित eukaryotic जीवों3में जाना जाता दृश्यों के बीच में हैं, और उनके posttranslational संशोधनों को बड़े पैमाने पर किया गया है क्रोमेटिन संरचना का निर्धारण करने में एक केंद्रीय भूमिका निभा दस्तावेज और समारोह8,9. हिस्टोन पूंछ पर PTMs (यानी, acetylation, मिथाइल, फास्फारिलीकरण, और ubiquitination) पूंछ की बातचीत की क्षमता को बदलने के लिए, संरचनात्मक राज्य और क्रोमेटिन फाइबर की तह को प्रभावित, और इस तरह, डीएनए पहुंच को विनियमित और प्रसंस्करण4,10,11,12। एसिटाइल समूहों को जोड़ा और हिस्टोन पूंछ पर कश्मीर अवशेषों से विशिष्ट हिस्टोन-बातचीत epigenetic एंजाइमों, अर्थात् टोपी और HDACs, क्रमशः13का एक सेट द्वारा हटा रहे हैं । उदाहरण के लिए, lysine 12 (H4K12ac) में हिस्टोन H4 की acetylation पहले स्मृति अधिग्रहण और समेकन14से संबंधित जीन की प्रतिलिपि को सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, सबूत के कई लाइनें सुझाव है कि जीन प्रतिलेखन के एंजाइम मध्यस्थता epigenetic नियंत्रण स्वस्थ सेलुलर विकास और भेदभाव6,15का एक महत्वपूर्ण पहलू है । जीन अभिव्यक्ति के epigenetic विनियमन में अदल-बदल, या तो डीएनए के epigenetic संशोधनों द्वारा या स्वयं epigenetic एंजाइमों के उत्परिवर्तन द्वारा, मानव रोगों में dysregulated होने के लिए दिखाया गया है जहां एक विशेष जीन गतिविधि में परिवर्तन एक बानगी है की विकृति (जैसे, कैंसर)6,16,17। इस प्रकार, कोर हिस्टोन PTMs में परिवर्तन के मूल्यांकन के संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक उच्च मूल्य लक्ष्य के रूप में उभर रहा है । हालांकि, बहुतायत का निर्धारण, बातचीत भागीदारों, और histones PTMs की विशिष्ट भूमिकाओं18चुनौतीपूर्ण साबित किया गया है ।
वर्तमान रिपोर्ट में, एक अनुकूलित, मध्यम प्रवाह रणनीति एक ही अंश में कोशिकाओं और मस्तिष्क के ऊतकों से कोर histones को शुद्ध करने के लिए, और histones H3 और H4 PTMs के ठहराव के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । नोट की, हालांकि वर्तमान में प्रकाशित एसिड आधारित शुद्धि तकनीक और एंटीबॉडी आधारित हिस्टोन का पता लगाने रणनीतियों व्यापक रूप से हिस्टोन लक्षण वर्णन के लिए अपनाया गया है, वे वर्णनात्मक प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम के बारे में विवरण की कमी है, इस प्रकार त्वरित और replicable हिस्टोन निष्कर्षण और ठहराव बाधा. उदाहरण के लिए, सेल निकालने और ऊतक बायोप्सी के प्रसंस्करण सफल निष्कर्षण के लिए विभिंन उपकरणों और प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है । इसके अलावा, अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्तमान पांडुलिपि में प्रस्तुत एक व्यावहारिक, मध्यम प्रवाह दृष्टिकोण दर्शाता है । कोर histones एक एकल, शुद्ध अंश के रूप में निकाले जाते हैं, जो किसी भी दोष से हस्तक्षेप के बिना विश्वसनीय बहाव एंटीबॉडी-मध्यस्थता PTM का पता लगाने में सक्षम बनाता है । इसके अलावा, वर्तमान पांडुलिपि में, अपने छोटे आणविक वजन के कारण हिस्टोन का पता लगाने के बारे में चुनौतियों को दरकिनार किया गया है । आमतौर पर, शुद्धि, ठहराव, और जेल ट्रो प्रोटोकॉल के बीच अनुकूलता की कमी replicable और निर्णायक परिणाम प्राप्त करने से वैज्ञानिकों में बाधा । यहाँ, एक अनुकूलित कार्यप्रवाह कोशिकाओं और ऊतकों से कोर histones को शुद्ध और पश्चिमी दाग के माध्यम से बहाव PTM विश्लेषण के लिए उन्हें तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है.
वर्तमान प्रोटोकॉल कोर हिस्टोन प्रोटीन की शुद्धि के लिए सक्षम बनाता है, जबकि उनके मूल posttranslational संशोधनों के संरक्षण (यानी, acetylation, मिथाइल, और फास्फारिलीकरण) । चित्रा 1 हिस्टोन शुद्धि प्रोटोकॉल की समयरेखा को दर्शाया गया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-230-204</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% perchloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270725</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator strips, non-bleeding</td>
			<td>Milliipore Sigma</td>
			<td>1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x SDS sample buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop rotor</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-04397-34</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube rack</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-541</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone purification mini kit</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>40026</td>
			<td>spin columns included in the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop instrument</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culute media</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-serum media</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-9035</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610436</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610438</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>RIO-RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S stain</td>
			<td>CellSignalling</td>
			<td>59803S</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885302-0007</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>68973</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4K12ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39166</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39134</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue

सभी eukaryotic जीवों में, क्रोमेटिन, सभी आनुवंशिक जानकारी का शारीरिक टेम्पलेट, आनुवंशिकता के लिए आवश्यक है । क्रोमेटिन विविध posttranslational संशोधनों (PTMs) है कि ज्यादातर हिस्टोन प्रोटीन (यानी, हिस्टोन पूंछ) के अमीनो टर्मिनी में होते है और अंतर्निहित डीएनए की पहुंच और कार्यात्मक राज्य को विनियमित की एक सरणी के अधीन है । हिस्टोन पूंछ nucleosome के कोर से विस्तार और हिस्टोन acetyltransferases (टोपी) और एसिटाइल हिस्टोन (deacetylases) द्वारा HDACs समूहों के हटाने के दौरान सेलुलर विकास और भेदभाव के दौरान एसिटाइल समूहों के अलावा के अधीन हैं । lysine पर विशिष्ट acetylation पैटर्न (कश्मीर) हिस्टोन पूंछ पर अवशेषों transcriptionally सक्रिय या transcriptionally दमित क्रोमेटिन के बीच एक गतिशील homeostasis निर्धारित (1) कोर हिस्टोन विधानसभा को प्रभावित करने और (2) भर्ती synergistic या प्रतिपक्षी क्रोमेटिन-प्रतिलेखन साइट के लिए प्रोटीन से जुड़े । हिस्टोन पूंछ PTMs की जटिल प्रकृति के मौलिक विनियामक तंत्र क्रोमेटिन के बहुमत-टेंपलेट प्रक्रियाओं और कोशिका परिपक्वता और दोनों सामांय और रोग के विकास में भेदभाव में परिवर्तन में परिणाम प्रभावित करता है । वर्तमान रिपोर्ट के लक्ष्य के लिए एक कुशल विधि के साथ एक नौसिखिया प्रदान करने के लिए कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक से कोर हिस्टोन प्रोटीन शुद्ध और मज़बूती से histones H3 और H4 पर acetylation के निशान यों तो है ।

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Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

इस लेख का उद्देश्य histones H3 और H4 और acetylated हिस्टोन अवशेषों के ठहराव के कुशल शुद्धिकरण के लिए एक व्यापक, व्यवस्थित मार्गदर्शन प्रदान करना है ।

H3 और H4 हिस्टोन प्रोटीन और कोशिकाओं और मस्तिष्क ऊतक में Acetylated हिस्टोन के निशान के ठहराव का शुद्धिकरण

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

यह विधि कोर हिस्टीटोन एच 3 और एच 4 के सटीक मात्राकरण और कोशिका और ऊतक अर्क से उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के लिए अनुमति देती है जिसके फलस्वरूप उच्च गुणवत्ता, प्रजनन योग्य परिणामों की पीढ़ी होती है। प्रस्तुत तकनीक के तीन मुख्य फायदे हैं। सबसे पहले, यह हिस्टन के मूल पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को बरकरार रखता है।दूसरा, यह महंगे कम थ्रूपुट तरीकों को बाईपास करता है । अंत में, यह डाउनस्ट्रीम मध्यम-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के साथ पूरी तरह से संगत है। प्रक्रिया का प्रदर्शन कारोलिना Janczura मेरी प्रयोगशाला से एक प्रतिभाशाली स्नातक छात्र जो पूरी तरह से इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया जाएगा और तकनीक के लिए अल्जाइमर रोग में एपीजेनेटिक विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब कार्यरत हैं ।पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया के साथ 10 सेंटीमीटर ऊतक संस्कृति-इलाज व्यंजनों में कोशिकाओं की थाली शुरू करने के लिए। कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि वे लगभग 90% तक न पहुंच जाए। कोशिकाओं के बाद वांछित पूर्णता धीरे संस्कृति मीडिया aspirate और पूर्व युद्धाकार सीरम मुक्त मीडिया के साथ कोशिकाओं को धोने तक पहुंच गए हैं ।इसके बाद कोशिकाओं से सीरम मुक्त मीडिया को हटा दें और 10 सेंटीमीटर के व्यंजनों को बर्फ पर रखें। प्रत्येक डिश में बर्फ-ठंड निष्कर्षण बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। प्लास्टिक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके कोशिकाओं को निष्कर्षण बफर में इकट्ठा करें और उन्हें लेबल 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।इसके बाद ट्यूबों को बर्फ पर रखें। यदि जमे हुए ऊतकों का उपयोग किया जाता है, तो ऊतक को पूर्व-ठंडा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और संक्षेप में इसे बर्फ पर पिघला दें। अगला एक्सट्रैक्शन बफर की अनुशंसित मात्रा और स्ट्रोक की संख्या का उपयोग करके एक हैंडहेल्ड होमोजेनाइजर के साथ मस्तिष्क के ऊतकों को समरूप करें।समरूपता पूरा हो जाता है जब कोई दिखाई ऊतक के टुकड़े नहीं होते हैं और समाधान दूधिया उपस्थिति पर ले जाता है। इसके बाद, एक एकल चैनल 1, 000-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें ताकि समरूप को पूर्व-ठंडा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके और ट्यूबों को बर्फ पर रखें। कोशिका ओं से युक्त ट्यूब को चार डिग्री सेल्सियस पर 15 आरपीएम पर घूर्णन मंच पर एक घूर्णन मंच पर रखें।इसके बाद अधिकतम गति से ट्यूब को चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तक सेंट्रलाइज करें। इसके बाद सुपरनेट को एक नए प्री-ठंडा 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें। अगले बेअसर बफर की एक 1/4 मात्रा के साथ हिटोन बेअसर, और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिश्रण ।मिश्रण के पीएच की जांच करने के लिए पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग करें, और यदि आवश्यक हो तो बेअसर बफर के साथ पीएच को समायोजित करें। यदि इस चरण के दौरान अम्लीय हस्टटोन को निष्प्रभावी नहीं किया जाता है, तो वे कॉलम झिल्ली को ठीक से नहीं बांधेंगे, इसके माध्यम से गुजरेंगे और प्रवाह के माध्यम से पता लगाया जाएगा। नमूना बफर के 12.5 माइक्रोलीटर में नमूने के 37.5 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक संक्षिप्त अपकेंद्रित्र के बाद 10 मिनट के लिए ९९ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण विकृत । इसके बाद, ट्यूबों को बर्फ पर रखें और संघनित एकत्र करने के लिए उन्हें संक्षेप में स्पिन करें। नमूना को एसडीएस-पेज जेल पर लोड करें और एक घंटे के लिए 100 वोल्ट पर जेल चलाएं।फिर रात भर जेल पर दाग लगाते हैं। और लगातार तीन वॉश के दौरान इसे डिदागें। सबसे पहले प्रत्येक स्पिन कॉलम में संतुलन बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।तीन मिनट के लिए कॉलम को सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और एक बार और अपकेंद्री दोहराएं। इसके बाद कॉलम में सैंपल के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।तीन मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा । फिर कॉलम प्रवाह के माध्यम से विश्लेषण के रूप में पहले वर्णित है । कॉलम में वॉश बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।तीन मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा । कॉलम को एक नए लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। कॉलम में हिस्टोन एल्यूशन बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।कॉलम को अपकेंद्री करने के बाद प्रवाह-थ्रू हिस्टोन प्रोटीन युक्त को बचाएं। एक रासायनिक हुड के तहत 4% परक्लोरिक एसिड की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए शुद्ध हिटोन में परक्लोरिक एसिड जोड़ें। पिपेट को मिलाने के लिए छह बार ऊपर और नीचे।यदि नमूने में हिस्टन बहुत केंद्रित हैं, तो पर्लरोनिक एसिड के अलावा समाधान बादल बन जाएगा। इसके बाद 24 घंटे तक ट्यूब को चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि रातभर हिस्टोन वर्षा सफल होती है, तो अपकेंद्रित्र चरण के बाद शीशी के तल पर एक छोटा सफेद गोली दिखाई देगी।लगातार चरणों में गोली धोने पर आश्वासन देते हैं कि गोली परेशान नहीं होती है क्योंकि यह आसानी से शीशी के नीचे से अलग हो सकती है। अगले दिन पूर्व ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में 75 मिनट के लिए नमूनों को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को सावधानीपूर्वक एस्पिएरेट करें और पैलेट किए गए नमूने में 500 माइक्रोलीटर बर्फ-ठंडे परक्लोरिक एसिड जोड़ें।अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। पैलेट को परेशान न करने का ध्यान रखते हुए सैंपल में आइस-कोल्ड एसीटोन के 500 माइक्रोलीटर डालें। इसके बाद सुपरनेट निकालें और ट्यूबों को 30 मिनट के लिए बर्फ पर अनकैप्ड सूखने दें।फिर बर्फ से ट्यूबों को हटा दें और नमूना पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें। गोली के सूखने के बाद इसे बाँझ पानी के 30 माइक्रोलीटर में रीसस्ट करें। ट्यूबों को कैप करें और हिस्टोर्स को 30 से 50 मिनट के लिए बर्फ पर पुनर्गठन करने की अनुमति दें।यह जांचने के बाद कि गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया है, ट्यूबों को संक्षिप्त करें और उन्हें बर्फ से हटा दें। इस प्रोटोकॉल में मानव माइक्रोग्लियल बीवी-2 कोशिकाओं से हिटोन शुद्ध किए गए थे और अर्क संरचना का विश्लेषण किया गया था। दाग जेल दर्शाता है कि 15 मिनट और 24 घंटे के बीच निष्कर्षण समय कच्चे हिस्टोन अर्क की समग्र संरचना को प्रभावित नहीं किया ।कॉलम के मैट्रिक्स के लिए बाध्यकारी हिस्टोन की दक्षता का विश्लेषण जेल के धुंधला के माध्यम से किया गया था। कॉलम दक्षता लगभग 100% थी जैसा कि कॉलम फ्लो-थ्रू में पता लगाने योग्य हिस्टोन प्रोटीन की अनुपस्थिति का सबूत था। निष्कर्षण समय अवधि की परवाह किए बिना, यानी15 मिनट, दो घंटे या 24 घंटे। पहला कॉलम वॉश निकालने से गैर-हिस्टोन प्रोटीन की सबसे बड़ी मात्रा समाप्त हो जाता है। 24 घंटे के निष्कर्षण समूह से शुद्ध हिस्टोन प्रोटीन अंशों में 15 मिनट और दो घंटे के निष्कर्षण समय की तुलना में अधिक H3 और H4 हस्टोन निहित थे ।पहला कॉलम एल्यूशन लगभग 100% कुशल था जैसा कि दूसरे एलुएट में हिस्टोन प्रोटीन की कमी का सबूत था। कच्चे हिटोन तो पूरे माउस मस्तिष्क से निकाले गए थे और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को मापा गया था। मोटे तौर पर अभिनय हैडीसी अवरोधक, ट्रिब्यूटिरिन, H4K12 एसीटिलेशन के जवाब में निकालने में वृद्धि हुई ।हालांकि, क्रूड एक्सट्रैक्ट में अशुद्धियों की मौजूदगी के कारण एंटीबॉडी की विशिष्टता में कमी आई। हिस्टोन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल को कक्षा 1 और आईआईबी एचडीएसी अवरोधक, एम 344 के साथ इलाज किए गए ट्रिपल ट्रांसजेनिक ए/डी चूहों के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के साथ पूरा किया गया था, और एच4के12 एसीटिलेशन में परिवर्तन के लिए एकल शुद्ध कोर हिस्टोन अंश का मूल्यांकन किया गया था। कुल हिकटोन का पता लगाया गया और M344 के जवाब में H4K12 एसीटिलेशन की महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई ।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय इस प्रक्रिया में सफल हिस्टोन शुद्धिकरण को मान्य करने के लिए प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित कई चौकियों को करना याद रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, हिस्टोन फॉस्फोरिलेशन और मिथाइलेशन स्थिति के बारे में अतिरिक्त प्रश्नों को संबोधित किया जा सकता है। इस तकनीक के विकास ने हमारी प्रयोगशाला में शोधकर्ताओं के लिए अल्जाइमर रोग में शामिल आनुवंशिक तंत्र का विश्लेषण करने का मार्ग प्रशस्त किया ।हालांकि इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के रोग मॉडलों में किया जा सकता है जहां क्रोमेटिन संशोधन को महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की जाती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Mouse Brain Vessels

माउस ब्रेन वेसल्स की शुद्धि

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

अलगाव और तंत्रिका Progenitors की खेती के बाद क्रोमेटिन-Immunoprecipitation के citrullinated 3 Lysine ७९ Dimethylation निशान

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का शुद्धिकरण

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

मस्तिष्क ऊतक में एमिलॉयड प्लेक की लेबलिंग और इमेजिंग प्राकृतिक पॉलीफेनोल करक्यूमिन का उपयोग करते हुए

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

विट्रो में संवेदी और मोटर नसों से फाइब्रोब्लास्ट और श्वार्न कोशिकाओं का शुद्धिकरण

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और उनके तंत्रिका और ग्लियल डेरिवेटिव में कई माइटोकॉन्ड्रियल मापदंडों का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Psychophysics Paradigm for the Collection and Analysis of Similarity Judgments

समानता के फैसले के संग्रह और विश्लेषण के लिए एक साइकोफिजिक्स प्रतिमान

Similarity judgments are commonly used to study mental representations and their neural correlates. This approach has been used to characterize perceptual ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

मस्तिष्क से एमिलॉयड फाइब्रिल कोर के जैव रासायनिक शुद्धिकरण और प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...