Name: purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue
Uploaded: 2018-11-30T15:00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue at JoVE.com

Forfatterne uttrykker sin takknemlighet til Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimers Research Program (tilskudd 6AZ08 og 7AZ26), NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) og American Heart Association (grant 17PRE33660831).

Alle mus ble plassert i en fuktighet og temperatur-kontrollert, AAALAC-akkreditert dyr anlegget ved Universitetet i Miami Miller School of medisin. Alle eksperimentene ble godkjent av University of Miami Miller skolen av medisin institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og følge spesifikasjonene for NIH.
1. utarbeidelse av eksempel ekstrakt
<ol><li>
Tilhenger celler
	<ol>
<li>Plate cellene i 10 cm retter i det aktuelle kultur mediet (1 x 106 til 1 x 109 celler per parabolen for linjer, for eksempel BV2, HEK-293, og SH-SY5Y, men ~ 1 x 1015 celler per parabolen for primær celler, for eksempel primære kortikale nevroner). Forsikre at cellene er likt fordelt på hele overflaten av platen, og at cellene å vokse i 48 timer å nå ~ 100% samløpet (37 ° C, 5% CO2).</li>
		<li>Når cellene har nådd den ønskede confluency, forsiktig Sug opp kultur media og vaske cellene 2 x med prewarmed serum-frie medier under vev kultur hette.</li>
		<li>Sug opp serum-free media fra retten og legge 1 mL av iskalde utvinning buffer (0,4 M svovelsyre, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0] og 1 x protease hemmer cocktail) til hver rett.</li>
		<li>Bruke plast celle skraper å samle alle celler i utvinning bufferen (ved skraping) og overføre dem til en 1,5 mL merket rør med en 1000 µL pipette. Pipetter cellene opp og ned 3 x å lette homogenisering.</li>
		<li>Lukk alle rør og umiddelbart setter dem på isen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hjernevev
	<ol>
<li>Hvis frossent brukes, plassere vevet i en prechilled 1,5 mL tube og kort tine det på is. Hvis ferskt vev brukes, går umiddelbart gå 1.2.2. Merk: Gjeldende protokollen beskriver fremgangsmåter frosne mus hjernen og mus prefrontal cortex prøver.</li>
		<li>Homogenize vev ved hjelp av en håndholdt Dounce homogenizer med riktig mengde utvinning buffer og anbefalt antall slag (tabell 1). For å unngå overdreven chromatin shredding, ikke overstige antall anbefalt slag.</li>
		<li>Bruker en enkelt kanal 1000 µL pipette, overføring av homogenate til en prechilled 1,5 mL tube. Lukk alle rør og umiddelbart setter dem på isen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utarbeidelse av råolje Histone ekstrakt
<ol><li>Plasser 1,5 mL rør som inneholder celler eller vev suspendert i utvinning bufferen på en roterende plattform og vri på 15 rpm på 4 ° C at utvinning av olje histones. Merk: Trekkingen tid kan variere for ulike celle og vev og må være optimalisert for hver prosedyre. Gjeldende protokollen presenterer resultatene etter 15 minutter og 2 h 24 h utvinning (figur 2, Figur 3, Figur 4og figur 5).</li>
	<li>Prechill microcentrifuge til 4 ° C. Etter ønsket trekkingen tid har gått, sentrifuge rør med maksimal hastighet på 10 min på 4 ° C.</li>
	<li>Overføre nedbryting inkludert de rå histones til en ny, prechilled 1,5 mL tube. Kast pellet.</li>
	<li>Lagre nedbryting ved-80 ° C (utvinning kan stoppes på dette trinnet, se "Stopp skritt" i figur 1) eller umiddelbart videre til neste trinn.</li>
	<li>Nøytralisere de rå histones med 1/4 volum 5 x nøytralisering buffer (f.ekslegge til 250 µL av 5 x nøytralisering buffer 1 mL av rå histones). Bland godt av pipettering opp og ned 6 x.</li>
	<li>Sjekk pH i blanding med pH strimler. Justere tilsvarende ved å legge mer nøytralisering buffer for å nå en pH på 7.</li>
	<li>Evaluere tilstedeværelsen av histone og nonhistone protein i råolje histone pakke som følger (figur 2).<ol>
<li>Legg 37,5 µL av utvalget til 12,5 µL av 4 x (Laemmli) eksempel buffer og denature i 10 min på 99 ° C.</li>
		<li>Laste inn prøven på en SDS side gel og kjøre gel 1t 100 V.</li>
		<li>Stain gel natten med Coomassie briljant blå R-250 flekker løsning og destain under tre påfølgende vasker (1 h/vask) med Coomassie briljant blå R-250 destaining løsning. Merk: Rå histones (figur 2) kan sammenlignes med elut og renset histones (dvs., kolonnen inndata [figur 5A]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rensing av Core Histones
<ol><li>
Spin kolonnen balanse
	<ol>
<li>Legg til 500 µL balanse bufferen hver spinn kolonne brukes. Berør ikke kolonnen membranen.</li>
		<li>Sentrifuger på 4 ° C til 3 min 800 x g. Kast gjennomflytsenhet. Gjenta 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Histone rensing
	<ol>
<li>Legge til 500 µL av utvalget av interesse fra trinn 2.6 i kolonnen. Sentrifuger på 4 ° C til 3 min 800 x g. Samle gjennomflytsenhet.</li>
		<li>Gjenta så mange ganger som nødvendig å laste hele prøven på kolonnen. Tanken må ikke overfylles kolonnen spinn.</li>
		<li>Kombinere gjennomflytsenhet fra hver sentrifugering trinn å analysere kolonne-bindende effektivitet (Figur 3).</li>
		<li>Følg trinn 2.7 analysere gjennomflytsenhet kolonnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kolonnen vask
	<ol>
<li>Legg til 500 µL vaske bufferen i hver kolonne. Sentrifuger på 4 ° C til 3 min 800 x g. Samle gjennomflytsenhet vask (vask #1).</li>
		<li>Gjenta trinn 3.3.1 totalt tre vasker. Samle gjennomflytsenhet vasker #2 og #3. Ikke basseng rad kolonnen gjennomflytsenhet vasker.</li>
		<li>For å ytterligere evaluere kolonnens histone bindende effektivitet, analysere tre kolonner vasker ved å følge trinn 2.7 (Figur 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Histone elueringsrør
	<ol>
<li>Overføre kolonnen til en ny merket 1,5 mL tube.</li>
		<li>Legge til 50 µL av histone elueringsbufferen. Sentrifuger på 4 ° C til 3 min 800 x g. Lagre gjennomflytsenhet inneholder histone proteiner.</li>
		<li>For en ekstra elueringsrør, gjentar du trinn 3.4.2. Kombiner ikke de første og andre eluates gjennomflytsenhet som de forskjellige histone antall og renhet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. utfelling av Core Histones
<ol><li>Legg perchloric acid (PCA) til de renset histones til en siste konsentrasjon på 4% PCA (f.ekslegge 3 µL av 70% PCA til 50 µL av renset histones fra trinn 3.4.2.</li>
	<li>Sentrifuger for 3 s å samle alle gjenværende væske fra rør veggen. Bland ved pipettering opp og ned 6 x.</li>
	<li>Plasser rør i en rack og ruge 24 h på 4 ° C.</li>
	<li>Neste dag, prechill en microcentrifuge 4 ° c og sentrifuge prøvene for 75 min med maksimal hastighet på 4 ° C.</li>
	<li>Når sentrifugering er fullført, vil små hvite pellets inneholder utfelt histones vises på bunnen av røret. Gjør ikke vortex prøven.</li>
	<li>Nøye Sug opp nedbryting, og uten å forstyrre pellet, legge 500 µL av iskalde 4% PCA til prøven.</li>
	<li>Sentrifuge ved 4 ° C i 10 min med maksimal hastighet. Nøye Sug opp nedbryting.</li>
	<li>Gjenta trinn 4.7 2 x.</li>
	<li>Uten å forstyrre pellet, legger du til 500 µL av iskalde aceton. Sentrifuge ved 4 ° C i 10 min med maksimal hastighet. Nøye Sug opp nedbryting.</li>
	<li>Gjenta trinn 4,9 2 x.</li>
	<li>Nøye Sug opp nedbryting, forlater rørene uncapped og lar prøve å tørke på is 30 min. sjekk hvis alle gjenværende aceton har fordampet.</li>
	<li>La rør uncapped og tillate prøven tørke ved romtemperatur (RT) 5 min.</li>
	<li>Resuspend pellet i 30 µL av sterilt vann. Gjør ikke Pipetter opp og ned. Sveip røret forsiktig med en finger.</li>
	<li>Cap alle rør og tillate histones å gjeninnføre på is 30-50 min., avhengig pellets. Sjekk Hvis pellet er resuspended.</li>
	<li>Cap alle rør og tillate pellets til ytterligere resuspend på RT i 5 min. Merk: Denne løsningen (første og andre elueringsrør fra trinn 3.4.3) er sammensatt av renset og avsalte histones og kan brukes for ytterligere kvantifisering og histone acetylation analyse.</li>
</ol>5. kvantifisering av elut Histone proteiner
<ol><li>Bruk et spektrofotometer etter produsentens protokollen for å kvantifisere totale histone proteiner innhentet etter siste tilsettes i trinn 4.15. Måle absorbansen på 230 nm. Registrere A260/A280 forholdet indikativ av den prøven med nukleinsyre.</li>
	<li>Bruk følgende formel til å beregne histone konsentrasjonen (x): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58648/58648eq1.jpg"> Her er OD optisk densitet avmålt for A230 nm.</li>
	<li>En histone konsentrasjon av ~1.5 mg/mL er betraktet som en gjennomsnittlig avkastning for cellelinjer, mens en histone konsentrasjon av ~5.0 mg/mL regnes som en gjennomsnittlig avkastning for 30 mg av vev.</li>
</ol>6. Western Blot analyse
<ol><li>Justere den renset og elut histone fra trinn 4.15 til ~ 10 µg av histone protein/prøve.</li>
	<li>Legge til riktige volumet av vann og 4 x Laemmli eksempel buffer for å justere lasting volum.</li>
	<li>Denature prøver i 10 min på 99 ° C. Avkjøle dem på isen. Sentrifuger for 3 å samle alle gjenværende væske og kondens fra rør veggen.</li>
	<li>Laste inn eksemplene på en SDS side gel og kjøre gel 1t 100 V.</li>
	<li>For å se totale histone protein, flekken gel natten med Coomassie briljant blå R-250 flekker løsning og destain under tre påfølgende vasker (1 h/vask) med Coomassie briljant blå R-250 destaining løsning. Merk: Første tilsettes histone proteiner inneholder høykvalitets histones (figur 5A) mens andre tilsettes inneholder lav til ingen nivåer av histones (figur 5B).</li>
	<li>For å kvantifisere histone PTMs, bruke en overføring systemet (se Tabellen for materiale) overføre histone protein fra SDS side gel (trinn 6.4) på en PVDF membran.<ol>
<li>For å montere overføring sandwich, åpne overføring systemet kassetten og plasser PVDF membran stakken (merket som bunnen +) på bunnen av kassetten med membran grossist. Roll membranen forsiktig med en klatt roller å fjerne alle mellom stakken og membranen.</li>
		<li>Lå gel på membranen roll gel forsiktig med en klatt roller å fjerne alle mellom membranen og gel og plasser toppen stabelen på gel. Rulle forsiktig igjen og plassere kassett dekselet over sandwich, trykk ned fast og drei nob klokkeretning for å låse.</li>
		<li>Sett inn kassetten for å overføre systemsporet. Velg Turbo protokollpå skjermbildet apparater. Bruk en 3 min protokoll for en enkelt mini gel eller en 7 min protokoll for mer enn to mini gels.</li>
		<li>Stain membranen med Ponceau S flekken i 5 min og visualisere totale histone proteiner.</li>
		<li>Vask dem i 1 x Tris-bufret saltvann (TB) med 0,1% mellom 20 for 2t og blokkere dem i 5% melk for 1 h. Incubate med primære og sekundære antistoff (overnatting på 4 ° C eller 1 h på RT, henholdsvis) eller etter en tidligere optimalisert protokoll. Merk: I gjeldende protokollen, antistoffer mot acetylated histones H4K12 (figur 6 og figur 7) og H3K27 (Figur 8) ble brukt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+an+Epigenetic+Component+in+Long-term+Memory?.">Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory?.</a> Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).</li><li>DeWoskin, V. A., Million, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epigenetics+pipeline.">The epigenetics pipeline.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).</li><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation:+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin.">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).</li><li>Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+in+chromatin+structure+and+transcription.">Histone acetylation in chromatin structure and transcription.</a> Nature. 389, 349-352 (1997).</li><li>Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Readers+of+Lysine+Acetylation+Regulate+Cocaine-Induced+Plasticity.">Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).</li><li>Komatsu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAHA,+a+HDAC+inhibitor,+has+profound+anti-growth+activity+against+non-small+cell+lung+cancer+cells.">SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells.</a> Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).</li><li>Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-acetylation:+a+link+between+Alzheimer's+disease+and+post-traumatic+stress+disorder.">Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).</li><li>Roh, T. -. Y., Cuddapah, S., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+domains+are+defined+by+acetylation+islands+revealed+by+genome-wide+mapping.">Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping.</a> Genes &amp; Development. 19, 542-552 (2005).</li><li>Mutskov, V., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+transgene+transcription+precedes+methylation+of+promoter+DNA+and+histone+H3+lysine+9.">Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9.</a> The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).</li><li>Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+complexes+and+their+link+to+transcription.">Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li><li>Bowman, G. D., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Translational+Modifications+of+Histones+That+Influence+Nucleosome+Dynamics.">Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics.</a> Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).</li><li>Volmar, C. -. H., Wahlestedt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+(HDACs)+and+brain+function.">Histone deacetylases (HDACs) and brain function.</a> Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).</li><li>Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Acetylation+of+Histone+H4+at+Lysine+12+(H4K12)+in+Monocytes+of+Transgenic+Alzheimer's+Mice+and+in+Human+Patients.">Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients.</a> Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability.">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylase+Inhibitors+in+Clinical+Studies+as+Templates+for+New+Anticancer+Agents.">Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents.</a> Molecules. 20, 3898-3941 (2015).</li><li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+1+and+6+modulate+cell+invasion+and+migration+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma.">HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma.</a> BMC Cancer. 16, 617 (2016).</li><li>Wapenaar, H., Dekker, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferases:+challenges+in+targeting+bi-substrate+enzymes.">Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes.</a> Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).</li><li>Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Purification+of+Recombinant+Histones.">Rapid Purification of Recombinant Histones.</a> PLoS ONE. 9, e104029 (2014).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).</li><li>Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Proteomics+and+Targeted+Metabolomics+to+Understand+Global+Changes+in+Histone+Modifications.">Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications.</a> Proteomics. , (2018).</li><li>Volmar, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epigenetic+Approach+for+the+Modulation+of+Amyloid+Precursor+Protein+(APP)+Processing+and+Improvement+of+Memory+in+Alzheimer's+Disease.">An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease.</a> Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).</li><li>Volmar, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M344+promotes+nonamyloidogenic+amyloid+precursor+protein+processing+while+normalizing+Alzheimer’s+disease+genes+and+improving+memory.">M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

I den nåværende arbeidet viste vi en optimalisert metoden å rense kjernen histone proteiner og kvantifisere histone H3 og H4 PTMs (f.eks, acetylation). Presentert protokollen er en omfattende arbeidsflyt som inkorporerer optimalisert prosedyrer vedrørende celler og hjernen vev forberedelse, råolje histone rensing og detaljert histone nedbør, elueringsrør og kvantifisering, som er etterfulgt av histone gelelektroforese og robust histone PTM kvantifisering. Den store mengden av detaljer her gir en repliserbar generasjon av høy kvalitet data, til tross for behovet for lange manipulasjoner av histone prøvene.
Mange gjeldende publiserte protokoller krever bruk av HPLC isolere ren brøker histones H3 og H419. Selv om HPLC er en kraftfull teknikk, avskrekke sin kompleksitet og lav gjennomstrømming de fleste molekylær biologer og nonexperts av hyppig bruk. Faktisk HPLC er ikke tilgjengelig for mange labs, og dyktige personell er nødvendig for å betjene apparatet. HPLC er ofte tidkrevende, dyrt og potensielt farlige. Presenteres her er en billig, medium gjennomstrømming strategi for å oppnå resultater av tilsvarende kvalitet uten HPLC. Rapportert strategien er også mer praktisk og egnet for bruk i nesten alle lab som den bruker en enkel spinn kolonnen tilnærming som ikke krever spesialisert instrument operasjonen ferdigheter. I tillegg ut histone H3/H4 tetramer som en enkelt, rent, og rikelig brøk, aktivere en pålitelig kvantifisering av bevarte PTMs på hver av proteiner.
PTMs er svært følsomme for endringer i oksidativt stress og endringer i pH20,21. Således, i motsetning til tidligere publiserte metoder18, vi rapportere en effektiv strategi med å skylle cellene i serum-frie medier å sikre et minimum metabolske forstyrrelser i cellene, og for å unngå forstyrrelser av de opprinnelige PTMs med serum komponenter. Gjeldende protokollen ikke bare forbigår tradisjonelle kjerner isolasjon, men også gir optimale tidspunkt for cellen lyse og nøyaktig vev homogenisering prosedyren som gir mulighet for bevaring av den kjernefysiske konvolutten og unngå kjernefysiske aggregering. Selv om trekkingen tid kan manipuleres basert på antall celler, samme celle type, vev størrelse, etc., er utvidet lysis ikke ønskelig som det kan føre til lysis av kjerner og DNA utgivelse, gjør prøven vanskelig å håndtere. Viktigere, finnes flere sjekkpunkter i protokollen for validering av vellykket histone rensing (f.eks, trinn 2.7 og 3.2.3). Denne strategien Letter også feilsøking gjennom lange prosedyren.
En annen viktig og enestående del av presentert protokollen er full kompatibilitet med nedstrøms western blot analyseverktøy og andre hvis ønskelig. Histone proteiner oppdages ~ 15 kDa13,22,23 , og lignende andre små molekylvekt proteiner, har vist seg vanskelig å oppdage ved standard immunoblotting teknikker. Bruk av en høy ytelse og høy gjennomstrømming system i kombinasjon med optimal oppløsning protein gels tillater for vedlikehold av protein innfødt bekreftelse (i fravær av SDS) og aktivitet i fravær av SDS og høy overføring effektivitet lav molekylvekt histone proteiner, dermed sikre en pålitelig histone PTM kvantifisering.

Begrepet epigenetics gjelder arvelige endringer i genet aktivitet som skjer uavhengig av endringer i DNA sekvens1,2. Gene transkripsjon og undertrykkelse bestemmes av (1) tilgjengelighet av chromosomal DNA pakket rundt en octamer kjerne histone proteiner (to kopierer hver av H2A, H2B, H3 og H4) og (2) tilgjengeligheten av transkripsjonsfaktorer stillas proteiner vervet til bestemte promoter nettsteder3,4. Gene transkripsjon er regulert av enzym-mediert endringer av bestemte DNA promoter nettsteder og PTMs histone haler5,6,7. N-jernbanestasjonen termini av histone H3 og H4 er blant de mest høyt konservert sekvensene i eukaryote organismer3, og deres posttranslational modifikasjoner er grundig dokumentert for å spille en sentral rolle i å bestemme chromatin struktur og funksjonen8,9. PTMs på histone haler (dvs., acetylation, metylering, fosforylering og ubiquitination) endre samhandling potensialet av mynt, påvirke strukturelle staten og chromatin fiber, og dermed regulere DNA tilgjengelighet og4,10,11,12. Acetyl grupper er lagt til og fjernet fra K rester på histone haler av et sett med spesifikke histone-samspill epigenetic enzymer, nemlig hatter og HDACs, henholdsvis13. For eksempel har acetylation av histone H4 på lysin 12 (H4K12ac) tidligere vist å aktivere Transkripsjonen til gener knyttet til minne oppkjøp og konsolidering14. I tillegg tyder flere linjer av bevis på at enzym-mediert epigenetic kontroll av genet transkripsjon er en avgjørende del av sunn mobilnettet vekst og differensiering6,15. Veksling i epigenetic regulering av genuttrykk, ved epigenetic endringer av DNA eller en mutasjon av epigenetic enzymer, har vist seg å være dysregulated i menneskelige sykdommer der endring i en bestemt gen-aktivitet er et kjennetegn patologi (f.eks, kreft)6,16,17. Dermed evalueringen av endringer i kjernen histone PTMs fremstår som en høy verdi mål for potensielle terapeutiske tiltak. Imidlertid har bestemme overflod, samspill partnere og spesifikke roller av histones PTMs vist utfordrende18.
En optimalisert, medium gjennomstrømming strategi å rense kjernen histones fra celler og hjernen vev i en enkelt del, og en komplett protokoll for kvantifisering av histones H3 og H4 PTMs er beskrevet i den gjeldende rapporten. Av notatet, selv om er publisert syrebasert rensing teknikker og antistoff-baserte histone oppdagelsen strategier har vært allment vedtatt for histone karakterisering, de mangler beskrivende detaljer om avgjørende skritt av prosedyren, dermed hindrer rask og replicable histone utvinning og kvantifisering. For eksempel behandling av cellen ekstra og vev biopsier krever forskjellige verktøy og teknologier for vellykket utvinning. Videre viser optimalisert protokollen presentert i gjeldende manuskriptet en praktisk, medium gjennomstrømming tilnærming. Kjernen histones pakkes som en enkel, ren brøk, som gir pålitelig nedstrøms antistoff-mediert PTM gjenkjenning uten forstyrrelser fra urenheter. Videre i gjeldende manuskriptet, har utfordringene som histone gjenkjenning på grunn av deres små molekylvekt blitt omgått. Manglende kompatibilitet mellom rensing, kvantifisering og gel geleelektroforese protokoller hindrer vanligvis forskere å få repliserbar og avgjørende resultater. Her vises en optimalisert arbeidsflyt å rense kjernen histones fra celler og vev og forberede dem for nedstrøms PTM analyser via western blot.
Gjeldende protokollen gjør rensing av kjernen histone proteiner samtidig bevare sine opprinnelige posttranslational modifikasjoner (dvs., acetylation, metylering og fosforylering). Figur 1 viser tidslinjen av histone rensing protokollen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-230-204</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% perchloric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270725</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator strips, non-bleeding</td>
			<td>Milliipore Sigma</td>
			<td>1095310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x SDS sample buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop rotor</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-04397-34</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube rack</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>05-541</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone purification mini kit</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>40026</td>
			<td>spin columns included in the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>78430</td>
			<td>or equivalent from other sources</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop instrument</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-880</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culute media</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>varies based on cell line used</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-serum media</td>
			<td>ThermoFiser Scientific</td>
			<td>51985091</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353086</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gradient gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-9035</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610436</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610438</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1704156</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>RIO-RAD</td>
			<td>1704150</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S stain</td>
			<td>CellSignalling</td>
			<td>59803S</td>
			<td>required for histone extraction from cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885302-0007</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>68973</td>
			<td>required for histone extraction from tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4K12ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39166</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39134</td>
			<td>required for PTMs quantification via WB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of h3 and h4 histone proteins and the quantification of acetylated histone marks in cells and brain tissue

I alle eukaryote organismer er chromatin, fysiologiske malen all genetisk informasjon, avgjørende for arv. Chromatin er en rekke varierte posttranslational endringer (PTMs) som hovedsakelig finnes inne amino jernbanestasjonen termini histone proteiner (dvs., histone halen) og regulere tilgjengelighet og funksjonell status for det underliggende DNA. Histone haler strekker seg fra kjernen av nucleosome og kan i tillegg acetyl grupper histone acetyltransferases (luer) og fjerning av acetyl grupper av histone deacetylases (HDACs) under mobilnettet vekst og differensiering. Bestemt acetylation mønstre på lysin (K) rester på histone haler bestemme en dynamisk homeostase mellom transcriptionally aktiv eller transcriptionally fortrengte chromatin av (1) påvirke kjernen histone forsamlingen og (2) rekruttering synergistisk eller antagonistiske chromatin-assosiert proteiner til webområdet transkripsjon. Grunnleggende regulatoriske mekanismen av den komplekse naturen av histone hale PTMs påvirker chromatin mal prosesser og resulterer i endringer i celle modning og differensiering i både vanlig og patologisk utvikling. Målet med gjeldende rapport er å gi nybegynnere en effektiv måte å rense kjernen histone proteiner fra celler og hjernevevet og pålitelig kvantifisere acetylation merkene på histones H3 og H4.

For å illustrere progresjon av histone rensing protokollen og sammensetningen av alle analysert fraksjoner, vurdert vi forskjellige histone utdrag fra menneskelig microglial BV2 celler. For å demonstrere kvantifisering av histones H3 og H4 PTMs (dvs., acetylation), brukte vi hjernen vev lysates.
BV2 celler var belagt på 5 x 106 celler per fat i 10 cm vev kultur-behandlet retter og lov til å vokse til confluency for 48 h. celler ble deretter samlet, og histones ble løslatt fra chromatin av en inkubasjon utvinning buffer med 0,4 M svovelsyre, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) og 1 x protease inhibitor. Trekkingen tid, mellom 15 minutter og 24 h, påvirke ikke den generelle sammensetningen av råolje histone ekstrakter som bestemmes av Coomassie briljant blå flekker (figur 2). Neste, rå histones ble sendt gjennom kolonnene equilibrated histone og gjennomflytsenhet ble analysert. Høy kolonne-bindende effektivitet bestemmes av fravær av histone protein i gjennomflytsenhet når analysert av Coomassie briljant blå flekker. Vi bestemt kolonne-bindende effektiviteten til 100% som det var ingen synlig histone proteiner tilstede i de analyserte gjennomflytsenhet (Figur 3). Alle membraner med bundet histones ble deretter vasket tre ganger med vaskebuffer fjerne urenheter gjenværende, forlater bare histone proteiner bundet til silica gel. Vi funnet ut at for alle histone utvinning ganger (dvs., 15 min, 2t og 24 h), den første membran vasken var viktigst å fjerne nonhistone forurensing fra kolonnene, mens de andre og tredje vasker ikke påvirke eksempel renhet. Dermed avhengig eksempel, kan de siste to vasker utelates. Etter første tilsettes histone protein fra kolonnen (med elueringsbufferen som inneholder 1mM NaCl og EDTA), histones ble påskyndet natten med 4% perchloric syre og deretter pelleted vasket og analysert for anriking av renset histones H3 og H4. Vi observerte at 24 timer trekking tid øker mengden av H3 og H4 histones i renset fraksjonen sammenlignet med 15 minutter og 2 timer trekking tid (figur 5A). Andre tilsettes kolonnen resulterte ikke i høy kvalitet eller høy-antall histones (figur 5B).
Neste, vi brukte hjernen vev homogenates for å kvantifisere histone H3 og H4 PTMs, nemlig acetylation. Vill-type (C57BL6/J) mannlige mus var administrert et bredt fungerende HDAC hemmer (tributyrin) på en dose av 5 g/kg muntlig i 3 d. hele-hjernen vev var samlet på dag 4 og råolje histones ble trukket ut i henhold til beskrevet protokollen. Ved hjelp av en kort t-test, vi funnet ut at tributyrin øker acetylation i histones i grove ekstraktet (t(6) = 6.184, P = 0,0004); imidlertid oppdages urenheter i ekstraktet (histone band ikke er klart definert). H4K12ac antistoffer har derfor ikke en høy spesifisitet (figur 6). For å ytterligere evaluere anvendelse av presentert protokollen til mindre vev deler, vi samlet prefrontal cortex av trippel transgene Alzheimers sykdom (3 x vs-AD) mus behandlet daglig med 10 mg/kg M344, en klasse jeg og IIb HDAC inhibitor, for fire måneder. Histone rensing og nedbør ble utført i henhold til her beskrevet protokollen. Bruke renset histone H3 og H4 brøkdel, vi funnet ut at M344 øker H4K12 acetylation 2.4-fold (t(6) = 13.03, P < 0,0001), med en høy spesifisitet H4K12ac antistoff (figur 7). Tilsvarende observerte vi en økning i histone H3 acetylation i BV2 celler som svar på en annen HDAC inhibitor, nemlig den selektive HDAC3 inhibitor, RGFP-966. 10 µM RGFP-966 årsaker en ca todelt økning av acetylation på histone H3K27 etter 24 timer for behandling. Student er unpaired t-test ble brukt til å sammenligne kontroll versus behandlet celler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig1.jpg"> Figur 1: tidslinje av histone rensing protokollen. Alle trinnene for histone analyser vises nedenfor sammen med den estimerte tiden som trengs for hvert trinn. Figurer som viser resultatet av bestemt trinn og presentert i manuskriptet omtales i parentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig2.jpg"> Figur 2: Representative Coomassie briljant blå-farget gel demonstrere råolje histones utdraget fra BV2 cellene. BV2 celler ble kultivert for 48 timer før histone utvinning protokollen begynte. Grov histones var utdraget for 15 min, 2t og 24 h, med tre gjentak for hvert punkt (dette er også saken i Figur 3 Figur 4, og figur 5). Både nonhistone og histone proteiner finnes i rå histone utdrag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig3.jpg"> Figur 3: Representative Coomassie briljant blå-farget gel demonstrere kolonnen gjennomflytsenhet følgende histone rensing skritt fra BV2 cellene. Etter råolje histone passerer gjennom kolonnen histone bindende, er bare nonhistone proteiner tilstede i gjennomflytsenhet. Histone proteiner er fraværende i denne fraksjonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig4.jpg"> Figur 4: representant Coomassie briljant blå-farget gel demonstrere en kolonne vask etter et histone rensing skritt fra BV2 cellene. Uavhengig av histone utvinning ganger var som var (A) 15 min, (B) 2 h, eller (C) 24 h, lave mengder nonhistone proteiner bare i kolonnen første-vask histonebinding. Histone proteiner var fraværende i alle vasker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig5.jpg"> Figur 5: Representative Coomassie briljant blå-farget gel demonstrere elutions etter et histone rensing skritt fra BV2 cellene. (A) høy kvalitet renset og avsalte histone H3 og H4 ble oppdaget etter første tilsettes histone rensing-kolonnen. (B) andre tilsettes av histone rensing kolonnen ikke gi en høy kvalitet eller antall histones H3 eller H4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig6.jpg"> Figur 6: den bredt fungerende HDAC inhibitor, tributyrin, øker H4K12 acetylation i hele hjernen av vill-type mus. (A) dette panelet viser en representant for western blot som viser en økning av H4K12 acetylation i den rå histone ekstra samlet fra hele hjernen av vill-type mus som svar på den forstand fungerende HDAC hemmer, tributyrin. (B) dette panelet viser kvantifisering av økningen i H4K12 acetylation i vivo. Unpaired t-test ble brukt til å sammenligne grupper (t(6) = 6.076, P = 0,0005). Bars forestiller det gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM). N = 8. P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig7.jpg"> Figur 7: klassen jeg og IIb HDAC inhibitor, M344, øker H4K12 acetylation i prefrontal cortex av trippel transgene Alzheimers sykdom (3 x vs-AD) mus. (A) dette panelet viser en representant western blot som viser en økning av H4K12 acetylation i den renset og avsalte histone ekstrakt samlet inn fra prefrontal cortex av 3 x vs-AD mus svar på hemming av HDACs av M344. (B) dette panelet viser kvantifisering av økningen av H4K12 acetylation i svar på M344 administreres på en 10 mg/kg daglig dose i fire måneder. Unpaired t-test ble brukt til å sammenligne grupper (t(6) = 13.30, P < 0,0001). Bars forestiller det gjennomsnittlig ± det SEM. N = 8. P < 0,00001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58648/58648fig8.jpg"> Figur 8: den selektive HDAC3 inhibitor, RGFP-966, øker H3K27 acetylation i BV2 microglial celler. (A) dette panelet viser en representant western blot som viser en økning av H3K27 acetylation i renset og avsalte histone utdrag samlet inn fra BV2 cellene som svar på HDAC3 hemming av RGFP-966. (B) RGFP-966 forårsaker en ca todelt økning av acetylation på histone H3 og lysin (K) 27 etter 24 timer for behandling. Unpaired t-test ble brukt til å sammenligne kontroll versus behandlet celler (t(4) = 5.981, P = 0,002). Bars forestiller det gjennomsnittlig ± det SEM. N = 6. P < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58648/58648fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Representant vev (en halvkule) *</td>
			<td>Gjennomsnittlige vev vekt (mg)</td>
			<td>Utvinning Buffer (mL)</td>
			<td>Antall streker</td>
		</tr>
<tr>
<td>Musen lillehjernen</td>
			<td>40</td>
			<td>1</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Musen frontal cortex</td>
			<td>30</td>
			<td>0,3</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Musen hippocampus</td>
			<td>27</td>
			<td>0,3</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mus entorhinal cortex</td>
			<td>19</td>
			<td>0,3</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* Alle eksperimentene ble utført på voksne mannlige mus.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Gjennomsnittlig alder: 16 måneder. Gjennomsnittlig vekt: 30 gram.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Optimalisert betingelse for hjernen vev homogenisering.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue at JoVE.com

Purification of H3 and H4 Histone Proteins and the Quantification of Acetylated Histone Marks in Cells and Brain Tissue

Formålet med denne artikkelen er å gi en omfattende, systematisk guide til effektiv rensing av histones H3 og H4 og måling av acetylated histone rester.

Rensing av H3 og H4 Histone proteiner og kvantifiseringen Acetylated Histone merker i celler og hjernevev

In all eukaryotic organisms, chromatin, the physiological template of all genetic information, is essential for heredity. Chromatin is subject to an array ...

Denne metoden muliggjør presis kvantifisering av kjerne histoner H3 og H4 og deres post-translasjonelle modifikasjoner fra celle- og vevsekstrakter som dermed fører til generering av høy kvalitet, reproduserbare resultater. Den presenterte teknikken har tre hovedfordeler. For det første bevarer den innfødte post-translasjonelle modifikasjoner av histoner.For det andre omgår det dyre lavgjennomstrømningsmetoder. Endelig er den fullt kompatibel med nedstrøms medium-throughput applikasjoner. Demonstrere prosedyren vil være Karolina Janczura en talentfull graduate student fra laboratoriet mitt som fullt optimalisert denne protokollen og ansatt teknikken for å svare på viktige spørsmål om epigenetisk regulering i Alzheimers sykdom.For å begynne plate cellene i 10-centimeter vev kulturbehandlede retter med riktig cellekultur media i henhold til tekstprotokollen. La cellene vokse til de når ca 90% samløpet. Etter at cellene har nådd ønsket samløpet, aspirerer du forsiktig kulturmediet og vasker cellene to ganger med forhåndswarmed serumfritt medium.Etter dette fjerner du det serumfrie mediet fra cellene og legger de 10 centimeter høye rettene på is. Tilsett en milliliter iskald ekstraksjonsbuffer til hver tallerken. Ved hjelp av en plastcelleskraper samler cellene i ekstraksjonsbufferen og overfører dem til et merket 1,5-milliliter rør.Legg deretter rørene på is. Hvis frosset vev brukes, legg vevet i et forkjølt 1,5-milliliter rør og tin det kort på is. Deretter homogenisere hjernevevet med en håndholdt homogenisator ved hjelp av den anbefalte mengden ekstraksjonsbuffer og antall slag.Homogenisering er fullført når det ikke er synlige vevfragmenter og løsningen tar på seg et melkeaktig utseende. Etter dette, bruk en enkeltkanals 1, 000 mikroliter pipette for å overføre homogenatet til et forhåndskjølt 1,5-milliliter rør og legg rørene på is. Plasser røret som inneholder cellelylatene og homogenisert hjernevev på en roterende plattform som roterer ved 15 RPMer ved fire grader Celsius.Etter dette sentrifuger røret med maksimal hastighet i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør deretter supernatanten til et nytt forkjølet 1,5 milliliter rør og kast pelleten. Deretter nøytraliserer histonene med et 1/4-volum nøytraliseringsbuffer, og bland ved å pipetter opp og ned.Bruk pH-strimler til å kontrollere pH-en til blandingen, og juster pH-en ytterligere med nøytraliseringsbuffer om nødvendig. Hvis sure histoner ikke nøytraliseres i løpet av dette trinnet, vil de ikke binde seg til kolonnemembranen riktig, vil passere gjennom den og vil bli oppdaget i gjennomstrømningen. Legg til 37,5 mikroliter av prøven til 12,5 mikroliter prøvebuffer.Etter en kort sentrifugasjon denatur blandingen på 99 grader Celsius i 10 minutter. Etter dette, plasser rørene på is og spinn dem kort for å samle kondensat. Legg prøven på en SDS-PAGE gel og kjør gelen på 100 volt i en time.Deretter flekker gelen over natten. Og destain det under tre påfølgende vasker. Legg først til 500 mikroliter med likevektsbuffer i hver spinnkolonne.Sentrifuger kolonnen i tre minutter. Kast gjennomstrømningen og gjenta sentrifugering en gang til. Etter dette legger du til 500 mikroliter av prøven i kolonnen.Sentrifuger kolonnen i tre minutter og samle gjennomstrømningen. Analyser deretter kolonneflyten som tidligere beskrevet. Legg til 500 mikroliter vaskebuffer i kolonnen.Sentrifuger kolonnen i tre minutter og samle gjennomstrømningen. Overfør kolonnen til et nytt merket 1,5-milliliter rør. Legg til 50 mikroliter histone elution buffer i kolonnen.Etter sentrifugering kolonnen lagre gjennomstrømning inneholder histone proteiner. Under en kjemisk hette tilsett perklorsyre til rensede histoner for å oppnå en endelig konsentrasjon på 4% perklorsyre. Pipetten opp og ned seks ganger for å blande.Hvis histonene i prøven er svært konsentrert, vil løsningen bli overskyet etter tilsetning av perklorsyre. Etter dette inkubere røret ved fire grader Celsius i 24 timer. Hvis natten histone nedbør er vellykket, vil en liten hvit pellet være synlig på bunnen av hetteglasset etter sentrifugering trinn.Når du vasker pelleten i de påfølgende trinnene, forsikrer pelleten at pelleten ikke forstyrres, da det lett kan løsne fra hetteglassbunnen. Neste dag sentrifuger prøvene i 75 minutter i forkjølte mikrocentrifuge rør. Aspirer forsiktig det overnaturante og tilsett 500 mikroliter iskaldt perklorsyre til pelletsprøven.Etter sentrifugering prøven i 10 minutter ved maksimal hastighet, aspirere supernatant. Tilsett 500 mikroliter iskalde aceton til prøven som tar vare på å ikke forstyrre pelleten. Fjern deretter supernatanten og la rørene tørke av is i 30 minutter.Fjern deretter rørene fra isen og la prøven tørke ved romtemperatur i fem minutter. Etter pelleten er tørr resuspend det i 30 mikroliter sterilt vann. Cap rørene og la histonene rekonstituere på is i 30 til 50 minutter.Etter å ha sjekket at pelleten er resuspended, oppsummerer rørene og fjerner dem fra isen. I denne protokollen ble histoner fra humane mikrogliale BV-2-celler renset og ekstraktsammensetningen ble analysert. Den fargede gelen viser at ekstraksjonstider mellom 15 minutter og 24 timer ikke påvirket den generelle sammensetningen av de rå histonekstraktene.Effektiviteten av histonebinding til kolonnens matrise ble analysert via farging av gelen. Kolonneeffektivitet var ca 100%, noe som fremgår av fraværet av påvisbare histonproteiner i kolonnens gjennomstrømning. Uavhengig av ekstraksjonstidsvarigheten, det vil vil at15 minutter, to timer eller 24 timer. første kolonnevask eliminerer den største mengden ikke-histonproteiner fra ekstraktet. De rensede histonproteinfraksjonene fra den 24-timers ekstraksjonsgruppen inneholdt flere H3- og H4 histoner sammenlignet med 15-minutters og to timers ekstraksjonstider.Den første kolonnen elution var ca 100% effektiv som det fremgår av mangelen på histone proteiner i den andre eluate. Rå histoner ble deretter hentet fra hele musen hjernen og post-translasjonelle modifikasjoner ble målt. Som svar på den bredt virkende HADC-hemmeren økte sideebutyrin, H4K12 acetylering i ekstraktet.Imidlertid ble spesifisiteten av antistoffet redusert på grunn av tilstedeværelsen av urenheter i råoljeekstraktet. Histonerenseprotokollen ble fullført med prefrontal cortex av trippeltransgene A/D-mus behandlet med klasse I- og IIb HDAC-hemmeren M344, og den enkle rene kjernehtonekken ble evaluert for endringer i H4K12 acetylering. Totalt histoner ble oppdaget og en signifikant økning av H4K12 acetylering ble observert som svar på M344.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å utføre flere kontrollpunkter som er beskrevet i protokollen for å validere vellykket histone rensing gjennom hele prosessen. Etter denne prosedyren kan ytterligere spørsmål om histonfosforylering og metyleringsstatus tas opp. Utviklingen av denne teknikken banet vei for forskere i laboratoriet vårt for å analysere de genetiske mekanismene som er involvert i Alzheimers sykdom.Men det kan brukes i en rekke sykdomsmodeller hvor kromatinmodifisering er hypotetisk for å spille en betydelig rolle.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolasjon og dyrking av nevrale Progenitors etterfulgt av Chromatin-Immunoprecipitation av Histone 3 lysin 79 Dimethylation

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Rensing av dendrittiske Filopodia-rik brøk

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Merking og Imaging av amyloid plaketter i Brain tissue bruke Natural polyphenol curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Rensing av fibroblaster og Schwann-celler fra sensoriske og motornerver in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Flowcytometrisk analyse av multiple mitokondrielle parametere i humaninduserte pluripotente stamceller og deres nevrale og gliaderivater

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

A Psychophysics Paradigm for the Collection and Analysis of Similarity Judgments

Et psykofysikkparadigme for innsamling og analyse av likhetsdommer

Similarity judgments are commonly used to study mental representations and their neural correlates. This approach has been used to characterize perceptual ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Biokjemisk rensing og proteomisk karakterisering av Amyloid Fibril-kjerner fra hjernen

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...