Reproducerbare dsRNA mikroinjektion og Oviposition Bioassay i myg og stuefluer

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i biopesticide-området, såsom hvordan dobbelt streng RNA's indvirkning genekspression, og frugtbarhed i voksne dipterans. Den største fordel ved denne teknik er, at kvantificerbare doser af dobbelt streng RNA leveres til myg eller flue, og deraf følgende påvirker på flere generationer dødelighed kan derefter vurderes. Selv om denne metode præsenteres for myg, aedes aegypti, og huset flyve, musca domestica, kan det også anvendes til andre arter af myg og fluer.

Generelt, enkeltpersoner nye til denne metode vil kæmpe, fordi beherske injektion procedure i sig selv er en tid investering. Indsprøjtning hvert insekt med den optimale nål spids størrelse er afgørende for at sikre levering og samtidig minimere skade og dødelighed. Til at begynde, skal du bruge hndesyge til omhyggeligt fase myg, så de i sidste ende udsættes på et mikroskop glide cirka en halv centimeter fra hinanden.

For at hjælpe slide håndtering, lad en en til en og en halv centimeter plads i venstre eller højre ende af diaset. Derefter placere dias af iscenesatte insekter på fire grader Celsius i en stor petriskål. Opsæt et dissekerende mikroskop og mikroinjektor over et chillbord.

Når du har trukket glaskapillærer til en fin spids, skal du placere kapillærn i mikroinjektoren og bryde nålespidsen med scepinces. Skyl derefter nålen ved at opslænke og udvise nukleasefrit vand tre gange. Bemærk, at glas nål åbning størrelser varierer mellem myg og hus fluer.

Dernæst forberede en injektion løsning med en passende koncentration for myg. Tilføj tre mikrogram pr. milliliter Rhodamin B til opløsningen for at hjælpe med visualisering. Brug en pipette til at overføre tre til fire mikroliter opløsning til en ren overflade, og træk den ind i glasnålen uden at tage luft ind.

Tryk på injiceringsknappen gentagne gange, indtil væsken begynder at dispensere fra nålen. Brug en ultra fin punkt markør til at tegne hash mærker omkring en millimeter fra hinanden, startende fra den flydende menisk til nålen skaft. Indstil rutsjebanen af myg under nålen og sikre, at synsfeltet er bredt nok til at se opløsningen menisk i nålen.

Juster nålen med den midterste tredjedel af mesocarape brystbenet. Afbered myggeskigen mod nålen med syrbånd placeret på mygens modsatte side, og punkter forsigtigt neglebåndet med nålespidsen. Skub forsigtigt nålen ind i myggen, indtil spidsen er passeret gennem midterlinjen.

Tryk på injiceringsknappen, indtil den ønskede mængde væske er blevet injiceret. Hvis menisken ikke bevæger sig, langsomt skubbe myg eller flyve ud af nålen, mens du ser for menisk bevægelse. Hvis en del af den injicerede opløsning perler ud af neglebånd ved nålen fjernelse, eller hvis menisken undlader at bevæge sig, kassere insektet som injektionen ikke var vellykket.

På huset flyve, tilpasse nålen med mesopleuron. Afbered fluen mod nålen med spinces placeret på fluens modsatte side, og punkter forsigtigt neglebåndet med nålespidsen. Overfør de injicerede insekter til at klare 3,5 ounce bedrift kopper i grupper på ti til 15.

Derefter dække koppen med netting, og lad dem komme sig ved stuetemperatur. Når insekterne er kommet sig, vendes bedriften kop over en vat dyppet i 10% saccharose opløsning. Først fylde en 12 tommer kunstig membran med frisk blod, og varme det til 60 grader Celsius i et varmt vandbad.

Tør membranen med en køkkenrulle, og læg den hen over nethætten på holdereknægten. Efter myggene foder, erstatte vat og lad myg til at hvile i 24 timer. Dernæst konstruere oviposition kopper ved at fylde klare 3,5 ounce bio acetat kopper med ca 30 millimeter deioniseret vand.

Derefter placere et stykke frø spiring papir i bunden af koppen. Dæk koppen med net, og skær en lille slids i nethætten. 24 timer efter fodring, skæres en lille slids i hætten af bedriften kop og overføre hunnerne, der med succes fodret til oviposition kopper.

Derefter forsegle den lille slids i oviposition cap med en 10% saccharose mættet vat. Overvåge myg, og spore daglige dødelighed. Efter at have tilladt myg til oviposit i fem til syv dage, tælle æggene under en dissekere mikroskop.

Demonstration af proceduren vil blive Dr.Christopher Geden, en USDA ARS Research Entomolog. Tre dage efter injektion, bedøve fluerne med kuldioxid. Derefter overføre fluerne til et rent bur med vand og forberedt flyve kost.

Optag dødelighedsdata, og fjern døde fluer dagligt. Dernæst blandes 75% hvedeklid med 25% pelleteret levende bestand foder efter vægt for at forberede larve opdræt medium. Tilsæt vand til blandingen, indtil 62% fugt er opnået.

Tilføj fugtet hvede klid levende bestand foder blanding til et kvadrat af sort klud, og rul det ind i en bold. Brug en elastik til at holde kluden på plads, og klem forsigtigt, indtil det flydende medium siver igennem. Placer bolden i en 60 milliliter kop, og læg den i flyve buret i fem timer.

Derefter skylles æggene af bolden, og det sikres, at æggene fjernes under kludens folder. Ryst æggene for at forstyrre eventuelle klynger, og overføre dem til en gradueret 20 milliliter centrifuge rør. Lad æggene til at bosætte sig, og bemærk mængden af faste æg i røret.

Derefter tilsættes tilstrækkeligt vand til at bringe volumen til 20 gange mængden af de afregnede æg. Dernæst skal du bruge en magnetisk røre bar til at blande vand og æg suspension. Endelig skal du bruge en modificeret pipettespids til at dispensere 0,5 milliliter af suspensionen på et stykke forfugtet sort klud i en række linjer.

I denne protokol blev kvindelige myg mikroinjekt for at evaluere genekspression. Intravenøse hunner med dobbelt streng RNA viste signifikant reduktion i relativt udtryk på tværs af flere ovipositionscyklusser. Gennemsnitlige koblingsstørrelser i myg i den første gonotrofiske cyklus blev reduceret betydeligt for både dsRPS6 og dsRPL26 behandlede grupper.

En indlysende dosiseffekt blev observeret i koblingsstørrelser ved injektion af dsRPS6 fra et mikrogram til 50 nanogram i kvindelige myg. Hus fluer blev også injiceret med fem mikrogram dobbelt streng RNA konstruktioner. Svarende til myg observationer, betydelig reduktion i både specifikke udskrift udtryk og kobling størrelse blev bemærket.

Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at kassere insekter, der ikke blev injiceret. Ved hjælp af denne procedure, enhver dobbelt streng RNA konstruere eller andre biorationelle kan leveres til myg eller fluer. Glem ikke, at arbejde med glasnåle kan være farligt, og de bør altid bortskaffes i passende skarpe affaldsbeholdere.