8.5K Views
•
08:41 min
•
November 8th, 2018
DOI :
November 8th, 2018
•0:04
Title
0:53
Insect Preparation
1:21
Insect Injection
3:57
Aedes aegypti Mortality and Oviposition Bioassay
5:22
Musca domestica Mortality and Oviposition Bioassay
7:08
Results: Microinjection with dsRNA Leads to Reduced Specific Transcript Expression and Clutch Size in Aedes aegypti and Musca domestica
8:10
Conclusion
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het biopesticideveld, zoals hoe de impact van RNA's impact genexpressie van double streng en fecundity in volwassen dipterans. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat kwantificeerbare doses dubbelstreng RNA worden geleverd aan de mug of vlieg, en de daaruit voortvloeiende invloed op multi-generationele letaliteit kan vervolgens worden beoordeeld. Hoewel deze methode wordt gepresenteerd voor de mug, aedes aegypti, en het huis vliegen, musca domestica, het kan ook worden toegepast op andere soorten muggen en vliegen.
Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat het beheersen van de injectieprocedure zelf is een tijd investering. Het injecteren van elk insect met de optimale naaldtipgrootte is van cruciaal belang om de levering te garanderen terwijl letsel en sterfte worden geminimaliseerd. Om te beginnen, gebruik tangen om muggen zorgvuldig te faseren, zodat ze uiteindelijk worden blootgesteld aan een microscoopdia van ongeveer een halve centimeter uit elkaar.
Om de glijbehandeling te helpen, laat u een tot een tot een halve centimeter ruimte links of rechts van de dia. Plaats vervolgens de glijbaan van geënsceneerde insecten op vier graden Celsius in een grote petrischaal. Zet een ontleedmicroscoop en microinjector over een chill tafel.
Na het trekken van glazen haarvaten aan een fijne punt, plaats de capillaire naald in de microinjector en breek de naaldpunt met tangen. Spoel vervolgens de naald door het opstellen en verdrijven van nuclease gratis water drie keer. Merk op dat glazen naald opening maten variëren tussen muggen en huis vliegen.
Bereid vervolgens een injectieoplossing voor met een geschikte concentratie voor muggen. Voeg drie microgram per milliliter Rhodamine B toe aan de oplossing om te helpen bij het visualiseren. Gebruik een pipet om drie tot vier microliters van de oplossing over te brengen naar een schoon oppervlak, en trek het in de glazen naald zonder rekening te houden in enige lucht.
Druk de injecteerknop herhaaldelijk in totdat de vloeistof van de naald begint af te geven. Gebruik een ultra fijne puntmarkering om hashmarkeringen van ongeveer een millimeter uit elkaar te trekken, te beginnen met de vloeibare meniscus tot de naaldsteel. Stel de dia van muggen onder de naald en zorg ervoor dat het gezichtsveld breed genoeg is om de oplossingsmeniscus in de naald te zien.
Lijn de naald met het midden een derde van het mesocarape borstbeen. Zet de mug tegen de naald met tangen geplaatst aan de andere kant van de mug, en steek de cuticula voorzichtig door met de naaldpunt. Schuif de naald voorzichtig in de mug totdat de punt door de middellijn is gegaan.
Druk op de injecteerknop totdat de gewenste hoeveelheid vloeistof is geïnjecteerd. Als de meniscus niet beweegt, schuif de mug langzaam of vlieg van de naald tijdens het kijken naar meniscusbeweging. Als een deel van de geïnjecteerde oplossing kralen uit de nagelriem bij het verwijderen van de naald, of als de meniscus niet beweegt, gooi het insect als de injectie niet succesvol was.
Op de huisvlieg, lijn de naald met mesopleuron uit. Zet de vlieg tegen de naald met tangen geplaatst op de andere kant van de vlieg, en zachtjes doorboren de cuticula met de naald tip. Breng de geïnjecteerde insecten om duidelijk 3,5 ounce bedrijf bekers in groepen van tien tot 15.
Bedek vervolgens de beker met netten, en laat ze herstellen bij kamertemperatuur. Nadat de insecten zijn hersteld, omkeren de holding beker over een katoenen bal gedrenkt in 10% sacharose oplossing. Vul eerst een 12 inch kunstmatig membraan met vers bloed en verwarm het tot 60 graden Celsius in een warmwaterbad.
Droog het membraan met een papieren handdoek, en leg het over de nettendop van de holding cup. Na de muggen voeden, vervang de katoenen bal en laat de muggen te rusten voor 24 uur. Vervolgens bouwen ovipositie bekers door het vullen van duidelijke 3,5 ounce bio acetaat bekers met ongeveer 30 millimeter gedeïmiseerd water.
Plaats vervolgens een stuk zaadkieming papier aan de onderkant van de beker. Bedek de beker met netten, en snijd een kleine gleuf in de nettendop. 24 uur na het voeden, snijd een kleine spleet in de dop van de holding beker en breng de vrouwtjes die met succes gevoed naar oviposition cups.
Sluit vervolgens de kleine spleet in de ovipositiedop af met een 10%sucrose verzadigde katoenen bal. Monitor de muggen en volg de dagelijkse sterfte. Nadat de muggen vijf tot zeven dagen oviposit hebben toegestaan, tel de eieren onder een ontledenmicroscoop.
Het aantonen van de procedure zal Dr.Christopher Geden, een USDA ARS Research Entomologist. Drie dagen na injectie verdoven de vliegen met kooldioxide. Breng vervolgens de vliegen naar een schone kooi met water en bereidvliegdieet.
Nota van sterftegegevens en verwijder dagelijks dode vliegen. Meng vervolgens 75%tarwezemelen met 25% gepelt levend voorraadvoer per gewicht om het larventeeltmedium voor te bereiden. Voeg water toe aan het mengsel tot 62% vocht is bereikt.
Voeg de bevochtigde tarwezemelen live voorraad feed mengsel aan een vierkant van zwarte doek, en rol het in een bal. Gebruik een elastiekje om de doek op zijn plaats te houden, en knijp zachtjes tot het vloeibare medium doorsijpelt. Plaats de bal in een beker van 60 milliliter en plaats deze vijf uur in de vliegkooi.
Spoel hierna de eieren van de bal af, zodat de eieren onder de plooien van de doek vandaan worden gehaald. Schud de eieren om eventuele clusters te verstoren, en breng ze naar een afgestudeerde 20 milliliter centrifuge buis. Laat de eieren te regelen, en let op het volume van de vaste eieren in de buis.
Voeg vervolgens voldoende water toe om het volume op 20 keer het volume van de afgewikkelde eieren te brengen. Gebruik vervolgens een magnetische roerbalk om het water en de eiersuspensie te mengen. Ten slotte, gebruik maken van een gemodificeerde pipet tip om 0,5 milliliter van de suspensie af te geven op een stuk voorbevochtte zwarte doek in een reeks van lijnen.
In dit protocol werden vrouwelijke muggen micro-geïnjecteerd om genexpressie te evalueren. Injecterende vrouwtjes met dubbele streng RNA toonde een aanzienlijke vermindering van de relatieve expressie over meerdere ovipositie cycli. De gemiddelde koppelingsgrootte bij muggen in de eerste gonotrofische cyclus werd aanzienlijk verminderd voor zowel dsRPS6- als dsRPL26-behandelde groepen.
Een duidelijk dosiseffect werd waargenomen in koppelingsgroottes bij het injecteren van dsRPS6 van één microgram tot 50 nanogram bij vrouwelijke muggen. Huis vliegen werden ook geïnjecteerd met vijf microgram van dubbele streng RNA constructies. Vergelijkbaar met de muggenwaarnemingen, werd een aanzienlijke vermindering van zowel specifieke transcriptieexpressie als koppelingsgrootte opgemerkt.
Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om insecten die niet met succes werden geïnjecteerd, weg te gooien. Met behulp van deze procedure kan elke dubbele streng RNA-constructie of andere biorational worden geleverd aan muggen of vliegen. Vergeet niet dat het werken met glazen naalden gevaarlijk kan zijn, en ze moeten altijd worden verwijderd in de juiste scherpe afvalcontainers.
Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved