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November 8th, 2018
DOI :
November 8th, 2018
•0:04
Title
0:53
Insect Preparation
1:21
Insect Injection
3:57
Aedes aegypti Mortality and Oviposition Bioassay
5:22
Musca domestica Mortality and Oviposition Bioassay
7:08
Results: Microinjection with dsRNA Leads to Reduced Specific Transcript Expression and Clutch Size in Aedes aegypti and Musca domestica
8:10
Conclusion
Transcript
यह विधि बायोपेस्टिकाइड क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि डबल स्ट्रैंड आरएनए की प्रभाव जीन अभिव्यक्ति, और वयस्क डिप्टेरन में fecundity। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि डबल स्ट्रैंड आरएनए की मात्रात्मक खुराक मच्छर या फ्लाई को वितरित की जाती है, और जिसके परिणामस्वरूप बहु-पीढ़ीगत घातकता पर प्रभाव पड़ता है तो मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि यह विधि मच्छर, एडीज एजिप्टी और घर की फ्लाई, मस्का डोमेस्टिका के लिए प्रस्तुत की जाती है, इसे मच्छरों और मक्खियों की अन्य प्रजातियों पर भी लागू किया जा सकता है।
आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे, क्योंकि इंजेक्शन प्रक्रिया में महारत हासिल करना एक समय निवेश है। चोट और मृत्यु दर को कम करते हुए प्रसव सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम सुई टिप आकार के साथ प्रत्येक कीट इंजेक्शन महत्वपूर्ण है। शुरू करने के लिए, मच्छरों को सावधानीपूर्वक चरण में करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि वे अंततः माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लगभग आधा सेंटीमीटर अलग हो जाएं।
स्लाइड हैंडलिंग सहायता करने के लिए, स्लाइड के बाएं या दाएं छोर पर एक डेढ़ सेंटीमीटर जगह पर एक छोड़ दें। फिर एक बड़े पेट्री डिश में चार डिग्री सेल्सियस पर मंचन कीड़ों की स्लाइड रखें। एक चिल टेबल पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और माइक्रोइंजेक्टर सेट करें।
एक ठीक टिप करने के लिए कांच केशिकाओं खींचने के बाद, माइक्रोइंजेक्टर में केशिका सुई जगह है और संदंश के साथ सुई टिप तोड़ । फिर तीन बार नाभिक मुक्त पानी को तैयार करके और निष्कासित करके सुई को कुल्लाएं। ध्यान दें कि कांच की सुई खोलने के आकार मच्छरों और घर मक्खियों के बीच भिन्न होते हैं।
इसके बाद, मच्छरों के लिए उचित एकाग्रता के साथ एक इंजेक्शन समाधान तैयार करें। दृश्य में सहायता के समाधान के लिए रोडामाइन बी के तीन माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर जोड़ें। एक साफ सतह के समाधान के तीन से चार माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, और इसे किसी भी हवा में उठाए बिना कांच की सुई में खींचें।
जब तक तरल सुई से बांटना शुरू नहीं करता तब तक इंजेक्ट बटन को बार-बार दबाना। एक अल्ट्रा फाइन पॉइंट मार्कर का उपयोग एक मिलीमीटर के अलावा हैश मार्क्स आकर्षित करने के लिए, तरल meniscus से सुई टांग के लिए शुरू । सुई के नीचे मच्छरों की स्लाइड सेट करें और यह सुनिश्चित करें कि देखने का क्षेत्र सुई में समाधान मेनिस्कस देखने के लिए पर्याप्त व्यापक है।
मेसोकारापे स्टर्नम के मध्य एक तिहाई के साथ सुई को संरेखित करें। मच्छर के विपरीत दिशा में रखे गए संदंश के साथ सुई के खिलाफ मच्छर को संभालो, और धीरे-धीरे सुई टिप के साथ छल्ली को पंचर करें। धीरे-धीरे सुई को मच्छर में तब तक स्लाइड करें जब तक कि टिप मिडलाइन से नहीं गुजरी हो।
इंजेक्ट बटन को तब तक दबाना जब तक कि वांछित मात्रा में तरल इंजेक्ट नहीं किया जाता है। यदि मेनिस्कस आगे नहीं बढ़ता है, तो मच्छर को धीरे-धीरे स्लाइड करें या मेनिस्कस आंदोलन के लिए देखते समय सुई से उड़ें। यदि इंजेक्शन समाधान मोतियों का एक हिस्सा सुई हटाने पर क्यूटिकल से बाहर निकलता है, या यदि मेनिस्कस स्थानांतरित करने में विफल रहता है, तो कीट को त्याग दें क्योंकि इंजेक्शन सफल नहीं था।
घर उड़ने पर, सुई को मेसोप्लेरॉन के साथ संरेखित करें। फ्लाई के विपरीत दिशा में रखे गए संदंश के साथ सुई के खिलाफ फ्लाई को संभालो, और धीरे-धीरे सुई टिप के साथ क्यूटिकल को पंचर करें। दस से 15 के समूहों में 3.5 औंस होल्डिंग कप को साफ करने के लिए इंजेक्शन कीड़ों को स्थानांतरित करें।
फिर कप को जाल से कवर करें, और उन्हें कमरे के तापमान पर ठीक होने दें। कीड़ों के बरामद होने के बाद, 10% सुक्रोज समाधान में भिगोई गई कपास की गेंद पर होल्डिंग कप को उलटें। सबसे पहले, ताजा रक्त के साथ एक 12 इंच कृत्रिम झिल्ली भरें, और गर्म पानी के स्नान में इसे 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
एक कागज तौलिया के साथ झिल्ली सूखी, और यह होल्डिंग कप के जाल टोपी भर में रखना । मच्छरों को खिलाने के बाद, कपास की गेंद को बदलें और मच्छरों को 24 घंटे तक आराम करने दें। इसके बाद, लगभग 30 मिलीमीटर डिओनाइज्ड पानी के साथ स्पष्ट 3.5 औंस बायो एसीटेट कप भरकर ओविपोजिशन कप का निर्माण करें।
इसके बाद बीज अंकुरण कागज का एक टुकड़ा कप के नीचे रखें। कप को नेटिंग से कवर करें, और नेटिंग कैप में एक छोटा सा भट्ठा काट लें। खिलाने के 24 घंटे बाद, होल्डिंग कप की टोपी में एक छोटा सा भट्ठा काटें और उन महिलाओं को स्थानांतरित करें जो सफलतापूर्वक ओविपोशन कप को खिलाया जाता है।
फिर 10% सुक्रोज संतृप्त कपास गेंद के साथ ओविपोजिशन कैप में छोटे भट्ठा को सील करें। मच्छरों की निगरानी करें, और दैनिक मृत्यु दर को ट्रैक करें। मच्छरों को पांच से सात दिनों तक ओविपोसिट करने की अनुमति देने के बाद, अंडों को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे गिनें।
प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ क्रिस्टोफर Geden, एक USDA ARS अनुसंधान कीट विज्ञानी होगा । इंजेक्शन के तीन दिन बाद, कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। फिर मक्खियों को पानी के साथ एक साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें और फ्लाई डाइट तैयार करें।
मृत्यु दर डेटा रिकॉर्ड करें, और मृत मक्खियों को दैनिक रूप से हटा दें। इसके बाद, लार्वा पालन माध्यम तैयार करने के लिए वजन से 25% पेलेट लाइव स्टॉक फीड के साथ 75% गेहूं चोकर मिलाएं। मिश्रण में पानी जोड़ें जब तक 62% नमी प्राप्त न हो जाए।
गीले गेहूं चोकर लाइव स्टॉक फ़ीड मिश्रण को काले कपड़े के एक वर्ग में जोड़ें, और इसे एक गेंद में रोल करें। कपड़े को जगह में रखने के लिए एक रबर बैंड का उपयोग करें, और तरल माध्यम के माध्यम से रिसता है जब तक धीरे निचोड़ । गेंद को 60 मिलीलीटर कप में रखें, और इसे पांच घंटे के लिए फ्लाई पिंजरे में रखें।
इसके बाद, अंडे को गेंद से धोएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि अंडे कपड़े के गुंबदों के नीचे से हटा दिए जाते हैं। किसी भी समूह को बाधित करने के लिए अंडे हिलाएं, और उन्हें स्नातक 20 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंडे को व्यवस्थित करने की अनुमति दें, और ट्यूब में बसे अंडों की मात्रा पर ध्यान दें।
फिर बसे अंडों की मात्रा को 20 गुना तक लाने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें। इसके बाद, पानी और अंडे के निलंबन को मिलाने के लिए एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करें। अंत में, लाइनों की एक श्रृंखला में पूर्व-गीला काले कपड़े के एक टुकड़े पर निलंबन के 0.5 मिलीलीटर को वितरित करने के लिए एक संशोधित पिपेट टिप का उपयोग करें।
इस प्रोटोकॉल में, मादा मच्छरों को जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए माइक्रो-इंजेक्ट किया गया था। डबल स्ट्रैंड आरएनए के साथ महिलाओं को इंजेक्शन कई अंडाशय चक्र में सापेक्ष अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी दिखाई । पहले गोनोट्रोफिक चक्र में मच्छरों में औसत क्लच आकार DsRPS6 और dsRPL26 उपचारित समूहों दोनों के लिए काफी कम हो गए थे।
मादा मच्छरों में एक माइक्रोग्राम से 50 नैनोग्राम तक dsRPS6 इंजेक्शन देते समय क्लच आकारों में एक स्पष्ट खुराक प्रभाव देखा गया था। घर मक्खियों को भी पांच माइक्रोग्राम डबल स्ट्रैंड आरएनए निर्माण के साथ इंजेक्ट किया गया था । मच्छर टिप्पणियों के समान, विशिष्ट प्रतिलिपि अभिव्यक्ति और क्लच आकार दोनों में महत्वपूर्ण कमी नोट की गई थी।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, उन कीड़ों को त्यागना याद रखना महत्वपूर्ण है जिन्हें सफलतापूर्वक इंजेक्शन नहीं दिया गया था। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, किसी भी डबल स्ट्रैंड आरएनए निर्माण या अन्य बायोरेशनल मच्छरों या मक्खियों को वितरित किया जा सकता है। यह न भूलें कि कांच की सुइयों के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है, और उन्हें हमेशा उचित शार्प्स अपशिष्ट कंटेनरों में निपटाया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक microinjection पद्धति है कि हम मानकीकृत किया है और कई वर्षों के लिए इस्तेमाल के लिए न्यूक्लिक एसिड की विशिष्ट मात्रा में मच्छरों और घर मक्खियों के hemolymph सीधे देने के लिए । इस प्रोटोकॉल न्यूनतम इंजेक्शन मृत्यु दर में परिणाम और खुराक fecundity की माप संबंधित अनुमति देता है.
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