Reproduserbar dsRNA Microinjection og Oviposition Bioassay i mygg og huse fluene

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i biopesticide-feltet, for eksempel hvordan dobbel tråd RNA innvirkning genuttrykk, og fecundity i voksne dipterans. Den største fordelen med denne teknikken er at kvantifiserbare doser av dobbel tråd RNA leveres til mygg eller fly, og resulterende påvirkninger på flergenerasjonsdødelighet kan deretter vurderes. Selv om denne metoden presenteres for myggen, aedes aegypti, og huset flyr, musca domestica, kan den også brukes på andre arter av mygg og fluer.

Generelt vil enkeltpersoner som er nye på denne metoden slite, fordi å mestre injeksjonsprosedyren i seg selv er en tidsinvestering. Injisere hvert insekt med optimal nål tips størrelse er avgjørende for å sikre levering samtidig minimere skade og dødelighet. For å begynne, bruk tang til å forsiktig iscenesette mygg slik at de til slutt blir utsatt på et mikroskop, gli omtrent en halv centimeter fra hverandre.

For å hjelpe skyvehåndtering, la en til en og en halv centimeter plass på venstre eller høyre ende av lysbildet. Plasser deretter lysbildet av iscenesatte insekter ved fire grader Celsius i en stor petriskål. Sett opp et dissekerende mikroskop og mikroinjektor over et kjølebord.

Etter å ha trukket glasskapillærer til en fin spiss, plasser kapillærnålen i mikroinjektoren og bryte nålespissen med tang. Skyll deretter nålen ved å tegne opp og utvise kjernefritt vann tre ganger. Merk at glass nål åpningsstørrelser varierer mellom mygg og husfluer.

Deretter forbereder du en injeksjonsløsning med en passende konsentrasjon for mygg. Tilsett tre mikrogram per milliliter Rhodamine B til løsningen for å hjelpe til med visualisering. Bruk en pipette til å overføre tre til fire mikroliter oppløsning til en ren overflate, og trekk den inn i glassnålen uten å ta inn luft.

Trykk inn injeksjonsknappen gjentatte ganger til væsken begynner å komme ut av nålen. Bruk en ultra fin punktmarkør for å tegne hash merker omtrent en millimeter fra hverandre, fra flytende menisk til nåleskanftet. Sett mygglysbildet under nålen og sørg for at synsfeltet er bredt nok til å se løsningen menisken i nålen.

Juster nålen etter den midterste tredjedelen av mesocarape brystbenet. Brace myggen mot nålen med pinsett plassert på myggens motsatte side, og punkter forsiktig skjellaget med nålespissen. Skyv forsiktig nålen inn i myggen til spissen har gått gjennom midtlinjen.

Trykk inn injeksjonsknappen til ønsket mengde væske er injisert. Hvis menisken ikke beveger seg, skyv myggen langsomt eller fly av nålen mens du ser etter meniskbevegelse. Hvis en del av den injiserte oppløsningen perler ut av skjellaget ved nålfjerning, eller hvis menisken ikke beveger seg, kast insektet da injeksjonen ikke var vellykket.

På huset fly, justere nålen med mesopleuron. Brace fly mot nålen med tang plassert på flyets motsatte side, og forsiktig punktere skjellaget med nålespissen. Overfør de injiserte insekter for å fjerne 3,5 unse holde kopper i grupper på ti til 15.

Dekk deretter koppen med netting, og la dem gjenopprette ved romtemperatur. Etter at insektene har gjenopprettet, inverter holdekoppen over en bomullsdott gjennomvåt i 10% sukroseløsning. Først fyller du en 12 tommers kunstig membran med friskt blod, og varm den opp til 60 grader Celsius i et varmt vannbad.

Tørk membranen med et papirhåndkle, og legg den over nettinghetten på holdekoppen. Etter myggene spiser, bytt bomullsdotten og la myggene hvile i 24 timer. Deretter konstruerer du oviposisjonskopper ved å fylle klare 3,5 unse bioacetatkopper med ca. 30 millimeter avionisert vann.

Legg deretter et stykke frøspiringspapir nederst i koppen. Dekk koppen med netting, og kutt en liten spalte i nettinghetten. 24 timer etter fôring, kutt en liten spalte i hetten på holdekoppen og overfør hunnene som vellykket matet til oviposisjonskopper.

Forsegle deretter den lille spalten i oviposisjonshetten med en 10% sukrose mettet bomullsdott. Overvåk myggene, og spor daglig dødelighet. Etter å ha tillatt myggene å oviposit i fem til syv dager, telle eggene under et dissekerende mikroskop.

Demonstrere prosedyren vil være Dr.Christopher Geden, en USDA ARS Research Entomologist. Tre dager etter injeksjon, bedøve fluene med karbondioksid. Deretter overfører fluene til et rent bur med vann og forberedt flydiett.

Registrer dødelighetsdata, og fjern døde fluer daglig. Deretter blander du 75% hvetekli med 25% pelleted live lager feed etter vekt for å forberede larve oppdrettsmediet. Tilsett vann til blandingen til 62% fuktighet er oppnådd.

Tilsett fuktet hvetekli levende lager feed blanding til en firkant av svart klut, og rulle den inn i en ball. Bruk et gummibånd for å holde kluten på plass, og klem forsiktig til væskemediet siver gjennom. Plasser ballen i en 60 milliliter kopp, og legg den i flyburet i fem timer.

Etter dette, skyll eggene av ballen, og pass på at eggene fjernes fra under klutens bretter. Rist eggene for å forstyrre klynger, og overfør dem til et uteksaminert 20 milliliter sentrifugerør. La eggene bosette seg, og legg merke til volumet av avgjorte egg i røret.

Tilsett deretter tilstrekkelig vann for å bringe volumet til 20 ganger volumet av de avgjorte eggene. Deretter bruker du en magnetisk rørestang for å blande vann- og eggfjæringen. Til slutt bruker du en modifisert pipettespiss til å dispensere 0,5 milliliter av suspensjonen på et stykke forhåndsfuktet svart klut i en rekke linjer.

I denne protokollen ble kvinnelige mygg mikroinnsprøytet for å evaluere genuttrykk. Injeksjon av kvinner med dobbel tråd RNA viste signifikant reduksjon i relativ uttrykk på tvers av flere oviposisjonssykluser. Gjennomsnittlige clutchstørrelser i mygg i den første gonotrofiske syklusen ble betydelig redusert for både dsRPS6 og dsRPL26 behandlede grupper.

En åpenbar doseeffekt ble observert i clutchstørrelser ved injeksjon av dsRPS6 fra ett mikrogram til 50 nanogram i kvinnelige mygg. Husfluer ble også injisert med fem mikrogram dobbel tråd RNA konstruksjoner. I likhet med myggobservasjoner ble signifikant reduksjon i både bestemt transkripsjonsuttrykk og clutchstørrelse notert.

Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å kaste insekter som ikke ble injisert. Ved hjelp av denne prosedyren kan enhver dobbel streng RNA-konstruksjon eller annen biorational leveres til mygg eller fluer. Ikke glem at arbeid med glassnåler kan være farlig, og de bør alltid kastes i egnede avfallsbeholdere for skarpe gjenstander.