8.5K Views
•
08:41 min
•
November 8th, 2018
DOI :
November 8th, 2018
•0:04
Title
0:53
Insect Preparation
1:21
Insect Injection
3:57
Aedes aegypti Mortality and Oviposition Bioassay
5:22
Musca domestica Mortality and Oviposition Bioassay
7:08
Results: Microinjection with dsRNA Leads to Reduced Specific Transcript Expression and Clutch Size in Aedes aegypti and Musca domestica
8:10
Conclusion
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom biopesticid fältet, såsom hur dubbel sträng RNA: s inverkan genuttryck, och fruktbarhet hos vuxna dipterans. Den största fördelen med denna teknik är att kvantifierbara doser av dubbelsträng RNA levereras till mygga eller flyga, och resulterande påverkar flera generationer dödlighet kan sedan bedömas. Även om denna metod presenteras för myggan, aedes aegypti och huset flyger, musca domestica, kan det också appliceras på andra arter av myggor och flugor.
Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom behärska injektionsproceduren i sig är en tid investering. Att injicera varje insekt med den optimala nålspetsstorleken är avgörande för att säkerställa leverans samtidigt som skadan och dödligheten minimeras. Till att börja med använd forceps för att noggrant iscensätta myggor så att de så småningom exponeras på ett mikroskop glida ungefär en halv centimeter ifrån varandra.
Om du vill hjälpa bildhantering lämnar du en till ett och en halv centimeters utrymme i den vänstra eller högra änden av bilden. Placera sedan bilden av iscensatta insekter vid fyra grader Celsius i en stor petriskål. Sätt upp ett dissekerande mikroskop och mikroskopi över ett chillbord.
När du dragit glas kapillärer till en fin spets, placera kapillär nålen i mikroinjektor och bryta nålspetsen med tåttor. Skölj sedan nålen genom att utarbeta och utvisa nukleasfritt vatten tre gånger. Observera att glasnålsöppningsstorlekar varierar mellan myggor och husflugor.
Därefter bereder du en injektionslösning med en lämplig koncentration för myggor. Tillsätt tre mikrogram per milliliter av Rhodamine B till lösningen till stöd i visualisering. Använd en pipetter för att överföra tre till fyra mikroliter av lösning till en ren yta, och dra in den i glasnålen utan att ta in någon luft.
Tryck in injektionsknappen upprepade gånger tills vätskan börjar dispensera från nålen. Använd en ultrafin punktmarkör för att dra hashmärken ungefär en millimeter från varandra, med början från den flytande menisken till nålskaftet. Ställ in glidningen av myggor under nålen och se till att synfältet är tillräckligt brett för att se lösningen menisken i nålen.
Rikta nålen med mitten en tredjedel av mesocarape bröstbenet. Stag myggan mot nålen med tåtaggor placerade på myggans motsatta sida, och försiktigt punktera nagelbanden med nålspetsen. Skjut försiktigt in nålen i myggan tills spetsen har passerat genom mittlinjen.
Tryck in injektionsknappen tills önskad mängd vätska har injicerats. Om menisken inte rör sig, skjut långsamt myggan eller flyga av nålen medan du tittar på för meniskrörelse. Om en del av den injicerade lösningen är pärlor ur nagelbandet vid nålborttagning, eller om menisken inte rör sig, kassera insekten eftersom injektionen inte lyckades.
På huset flyga, rikta nålen med mesopleuron. Stag flugan mot nålen med tåtnålar placerade på gylfens motsatta sida, och försiktigt punktera nagelbanden med nålspetsen. Överför de injicerade insekterna för att rensa 3,5 ounce innehav koppar i grupper om tio till 15.
Täck sedan koppen med nät, och låt dem återhämta sig i rumstemperatur. Efter att insekterna har återhämtat sig, invertera holdingkupan över en bomullstuss indränkt i 10%sackaroslösning. Först fyller du ett 12 tums artificiellt membran med färskt blod, och värm den till 60 grader Celsius i ett varmvattenbad.
Torka membranet med en pappershandduk och lägg den över nätlocket på holdingkupan. Efter myggorna foder, byt ut bomullstussen och låt myggorna vila i 24 timmar. Därefter konstruera oviposition koppar genom att fylla klart 3,5 uns bio acetat koppar med cirka 30 millimeter av avjoniserat vatten.
Placera sedan en bit av utsäde grobarhet papper i botten av koppen. Täck koppen med nät, och skär en liten slits i nätlocket. 24 timmar efter utfodring, skär en liten slits i locket på holdingkupan och överför honorna som framgångsrikt matas till oviposition koppar.
Sedan försegla den lilla slitsen i oviposition locket med en 10%sackaros mättad bomullstuss. Övervaka myggorna och spåra den dagliga dödligheten. Efter att ha tillåtit myggorna att oviposit i fem till sju dagar, räkna äggen under en dissekera mikroskop.
Visar förfarandet kommer att dr.Christopher Geden, en USDA ARS Research Entomolog. Tre dagar efter injektionen bedövar flugorna med koldioxid. Överför sedan flugorna till en ren bur med vatten och förberedd flugdiet.
Registrera dödlighetsdata, och ta bort döda flugor dagligen. Blanda därefter 75%vetekli med 25%pelleted levande lager foder i vikt för att förbereda larv uppfödning medium. Tillsätt vatten till blandningen tills 62%fukt uppnås.
Tillsätt den fuktade vetekli levande lager foder blandningen till en kvadrat med svart trasa, och rulla den till en boll. Använd ett gummiband för att hålla duken på plats, och krama försiktigt tills det flytande mediet sipprar igenom. Placera bollen i en 60 milliliter kopp, och placera den i flugburen i fem timmar.
Efter detta, skölj äggen bort av bollen, se till att äggen avlägsnas från under veck av duken. Skaka äggen för att störa alla kluster, och överföra dem till en graderad 20 milliliter centrifugrör. Låt äggen att bosätta sig, och notera volymen av avsatta ägg i röret.
Tillsätt sedan tillräckligt med vatten för att få volymen till 20 gånger volymen av de avsatta äggen. Använd därefter en magnetisk stirbar för att blanda vatten och ägg suspension. Använd slutligen en modifierad pipettspets för att dosera 0,5 milliliter av suspensionen på en bit förfuktad svart duk i en serie linjer.
I detta protokoll var kvinnliga myggor mikroinjicerade för att utvärdera genuttryck. Injicera honor med dubbla strand RNA visade betydande minskning av relativa uttryck över flera oviposition cykler. Genomsnittliga kopplingsstorlekar i myggor i den första gonotrophic cykeln minskades avsevärt för både dsRPS6 och dsRPL26 behandlade grupper.
En uppenbar doseffekt observerades i kopplingsstorlekar när du injicerade dsRPS6 från ett mikrogram till 50 nanogram hos kvinnliga myggor. Husflugor injicerades också med fem mikrogram av dubbla sträng RNA konstruktioner. I likhet med de mygga observationer noterades betydande minskning av både specifika avskrift uttryck och koppling storlek.
Medan du försöker detta förfarande, det är viktigt att komma ihåg att kasta insekter som inte injicerades framgångsrikt. Med hjälp av detta förfarande kan alla dubbla strängar RNA-konstruktion eller andra biorationella levereras till myggor eller flugor. Glöm inte att arbeta med glasnålar kan vara farligt, och de bör alltid kasseras i lämpliga vassa avfallsbehållare.
Det här protokollet beskriver en Mikroskop metod som vi har standardiserat och använt i flera år för att leverera vissa mängder nukleinsyror direkt till hemolymph myggor och hus flugor. Detta protokoll resulterar i minimal injektion dödlighet och tillåter dos korrelerade mätningar av fruktsamhet.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved