Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

وأنشئت هذه الأساليب في المجموعة فيروثيرابي يرأسه الأستاذ الدكتور الدكتور غي أونجيريتشتس في المركز الوطني "الأمراض السرطانية" في هايدلبرغ. ونحن مدينون له ولجميع أعضاء فريق المختبر، لا سيما الدكتور توبياس ذرة والدكتور Rūta فينالدي، جوديث فورستر، وغراسي البرقي وألبرت جيسيكا. وأيد هذا العمل قبل آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ (منحة 2015_A78 أن إنجلاند م) و "المؤسسة الوطنية للعلوم الألمانية" (DFG، منح إنجلاند م EN 1119/2-1). هيدبويتشيل J.P.W. يتلقى راتبا من مدرسة الدراسات العليا الدولية هلمهولتز "بحوث السرطان".

ملاحظة: [س], [ف]، و [م] تشير إلى الأقسام الفرعية المنطبقة على: أوفس العامة، باراميكسوفيروسيس (معظم)، أو أم فقط، على التوالي. [ب] يشير إلى أقسام محددة المتسلسلات وسيمان.
1 استنساخ المتسلسلات Immunomodulator-ترميز إلى نواقل فيروس الحصبة
<ol><li>
[س] تصميم إدراج تسلسل.
	<ol>
<li>[...

أونكوليتيك المناعي (أي.، عفت في تركيبة مع المرباة) يحمل وعدا كبيرا لعلاج السرطان، مطالبين بمواصلة التنمية والتحسين من الفيروسات أونكوليتيك ترميز البروتينات إيمونومودولاتوري. ويصف هذا البروتوكول أساليب إنشاء والتحقق من صحة هذه الناقلات للتجارب اللاحقة في النماذج ذات الصلة الإكليني...

ويجري وضع فيروسات أونكوليتيك (أوفس) كالعلاجات المضادة للسرطان على وجه التحديد إجراء نسخ متماثل داخل وتقتل الخلايا السرطانية بينما تترك الأنسجة صحية سليمة. أصبحت الآن شائعة فهم أن فيروثيرابي أونكوليتيك (عفت)، وفي معظم الحالات، لا تعتمد فقط على تحلل الورم كاملة قبل النسخ المتماثل كفاءة وانتشار الفيروس، ولكن يتطلب آليات إضافية للعمل من أجل نجاح العلاج، بما في ذلك استهداف الأوعية الدموية واللحمية، والأهم من ذلك التحفيز المناعي1،2،،من34. بينما يستخدم العديد من أوائل الدراسات OV فيروسات غير معدلة، البحوث الجارية لقد استفادت من بيولوجية تحسين التفاهم والمصارف البيولوجية الفيروسات التي يحتمل أن تحتوي على رواية أوفس، والإمكانات التي يوفرها الهندسة الوراثية من أجل إنشاء OV متقدمة منصات5،،من67.
ونظرا لنجاح الأخيرة من العلاج المناعي، المتسلسلات immunomodulatory تتسم بأهمية خاصة فيما يتعلق بالهندسة الوراثية من أوفس. التعبير المستهدفة من هذه المنتجات الجينات بالخلايا السرطانية المصابة OV يقلل من سمية مقارنة للإدارة العامة. استهداف تحقيق باستخدام الفيروسات مع أونكوسيليكتيفيتي الأصيل أو عن طريق تعديل انتحاء الفيروسية8. المحلية المرباة يعزز الآليات المضادة للورم متعدد الأوجه لعفت. وعلاوة على ذلك، هذه الاستراتيجية دور أساسي في استجواب التفاعل بين الفيروسات والخلايا السرطانية، والمضيف الجهاز المناعي. وتحقيقا لهذه الغاية، يوفر هذا البروتوكول سير قابل للتعديل والمعمول بها لتصميم واستنساخ، وإنقاذ، ونشر، والتحقق من صحة نواقل فيروس الباراميكسو (تحديداً فيروس الحصبة) أونكوليتيك ترميز هذه المتسلسلات.
تعديل الاستجابة المناعية يمكن أن يتحقق بتشكيلة واسعة من منتجات التحوير استهداف خطوات مختلفة للسرطان-الحصانة دورة9، بما في ذلك تعزيز الاعتراف مستضد ورم [مثل المستضدات المرتبطة بورم (TAAs) أو مستحثات من الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات] عبر دعم نضوج الخلايا الجذعية لكفاءة مستضد العرض التقديمي (السيتوكينات)؛ تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المرغوبة مثل السامة للخلايا والخلايا مساعد تي [المستقطبات، بيسبيسيفيك خلية T engagers (بتس)]؛ استهداف الخلايا القمعية مثل التنظيمية تي الخلايا والخلايا المستمدة من النقوي القامع والضامة المرتبطة بورم والمرتبطة بسرطان الخلايا الليفية (الأجسام المضادة، بتيس، السيتوكينات)؛ ومنع تثبيط الخلية المستجيب واستنفاد (مثبطات حاجز). وبالتالي، يتوفر عدد كبير عوامل البيولوجية. تقييم مثل هذه إيمونومودولاتورس المرمزة بالفيروس فيما يتعلق بالفعالية العلاجية وأوجه التآزر المحتملة، فضلا عن فهم آليات كل منها ضروري لتحسين علاج السرطان.
المعني السلبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل فيروسات الحمض النووي الريبي الأسرة Paramyxoviridae تتسم بميزات عديدة تفضي إلى استخدامها كمتجهات أونكوليتيك. وتشمل هذه أونكوتروبيسم الطبيعية، سعة كبيرة الجينوم المتسلسلات (أكثر من 5 كيلو بايت)10،11، كفاءة الانتشار بما في ذلك تشكيل سينسيتيا، والاستمناع ارتفاع12. ولذلك، OV منصات استناداً إلى سل الكلاب الفيروس13والنكاف فيروس14و فيروس مرض نيوكاسل15،16،الفيروس سينداي17، الفيروس القردي 518وطوبيا فيروس الباراميكسو19 وقد وضعت. أبرزها، يعيش لقاح الحصبة الموهنة سلالات (MV) قد حققت تقدما في التنمية السريرية والسريرية20،21. وقد استخدمت سلالات الفيروسات هذه لعقود من أجل التحصين الروتينية مع سجل سلامة ممتاز22. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي خطر للطفرات insertional بسبب النسخ المتماثل سيتوسوليك تماما من باراميكسوفيروسيس. نظام الوراثة عكس تنوعاً يستند كدنا المضادة الجينوم الذي يسمح بإدراج المتسلسلات في وحدات النسخ الإضافية (عطاس) هو متاح11،،من2324. يجري حاليا تقييم ناقلات MV ترميز يوديد الصوديوم سيمبورتير (MV-شيكل) للتصوير والعلاج بالأشعة أو القابلة للذوبان carcinoembryonic antigen (MV-سيا) كعلامة بديلة للتعبير الجيني الفيروسي في التجارب السريرية (NCT02962167، NCT02068794، NCT02192775، NCT01846091، NCT02364713، NCT00450814، NCT02700230، NCT03456908، NCT00408590، و NCT00408590). وأكدت الإدارة الآمنة وقد أبلغ عن حالات من الفعالية المضادة للورم في السابق دراسات25،،من2627،،من2829، 30 (استعرضها مساويل et al.31)، مما يمهد الطريق لفيروسات الحصبة أونكوليتيك الإضافية التي تم تطويرها واختبارها بريكلينيكالي. MV ترميز immunomodulatory الجزيئات التي تستهدف مختلف خطوات دورة الحصانة السرطان قد ثبت أن تأخير نمو الورم و/أو إطالة البقاء على قيد الحياة في الفئران، مع وجود أدلة على فعالية جهاز المناعة بوساطة والذاكرة المناعية الواقية على المدى الطويل في سينجينيك نماذج الماوس. ترميز ناقلات المتسلسلات تشمل مستعمرة بلعم المحببات حفز عامل (GM-CSF)32،33، H. pylori العَدلات-تفعيل البروتين34، نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات35، انترلوكين-12 (إيل-12)36، TAAs37، وبتس38، الذي تشابك ورم السطحي antigen مع CD3 وهكذا حمل المضادة للورم النشاط بخلايا T [بولكلونل]، بغض النظر عن خلايا تي مستقبلات خصوصية وتحفيز المشاركين ( الشكل 1). الحصول على النتائج السريرية واعدة لهذه الثوابت كذلك جهود متعدية الطلب.
تاليموجيني لاهيرباريبفيك (تي-مركزنا)، نوع أنا فيروس الحلأ البسيط ترميز GM-CSF، هو فقط أونكوليتيك العلاجية وافقت عليها "الولايات المتحدة للأغذية" والدواء (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية (EMA). لم تظهر الدراسة ثالثا المرحلة الرائدة للموافقات في أواخر عام 2015 فقط نجاعة في موقع الحقن داخل الأورام، ولكن أيضا آثار بعاديا (أي، إسقاطها من غير حقن الآفات) في سرطان الجلد المتقدم39. T-مركزنا دخلت منذ محاكمات إضافية للتطبيق في الكيانات الورم الأخرى (مثل سرطان الجلد غير الميلانوما، ، NCT03458117؛ وسرطان البنكرياس، NCT03086642) وتقييم مجموعة من طرق العلاج، لا سيما مع نقطة تفتيش محصنة مثبطات (NCT02978625، NCT03256344، NCT02509507، NCT02263508، NCT02965716، NCT02626000، NCT03069378، NCT01740297، وريباس هt al.40).
وهذا يدل على إمكانية العلاج المناعي أونكوليتيك ليس فقط، بل أيضا الحاجة إلى إجراء مزيد من البحوث لتحديد تركيبات متفوقة عفت والمرباة. التصميم العقلاني ناقلات إضافية وتنميتها للاختبار السريري هو المفتاح لهذا التعهد. وهذا سوف تقدم أيضا فهم الآليات الكامنة وقد آثار بالنسبة للتقدم نحو أكثر تخصيصاً لعلاج السرطان. وتحقيقا لهذه الغاية، يعرض هذا المنشور منهجية لتعديل وتطوير باراميكسوفيروسيس للعلاج المناعي السرطان المستهدفة، وعلى وجه التحديد، فيروسات الحصبة أونكوليتيك ترميز الخلية تي--إشراك أجسام مضادة (الشكل 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

العلاج المناعي السرطان الناجح لديه القدرة على تحقيق السيطرة الورم طويلة الأجل. وبالرغم من النجاحات السريرية الأخيرة، لا تزال هناك حاجة ملحة لعلاجات آمنة وفعالة مصممة خصيصا للورم الفردية محصنة ضد التشكيلات الجانبية. فيروسات أونكوليتيك تمكين التعريفي للاستجابات المناعية المضادة للورم وكذلك التعبير الجيني مقيدة بالورم. ويصف هذا البروتوكول تحليل متجهات أونكوليتيك إيمونومودولاتوري جيل والسابقين فيفو. التركيز على الفيروسات لقاح الحصبة ترميز engagers خلية تي بيسبيسيفيك على سبيل مثال، يمكن تكييفها المنهجية العامة لسائر أنواع الفيروسات والمتسلسلات. يتضمن سير العمل عرض تصميم والاستنساخ، والإنقاذ، ونشر الفيروسات المؤتلف. فحوصات لتحليل حركية النسخ المتماثل والنشاط الحال ناقل وكذلك الأداء الوظيفي ل immunomodulator معزولة السابقين فيفو مدرجة، وبالتالي تيسير توليد عوامل جديدة لمزيد من التطوير في نماذج الإكلينيكية وفي نهاية المطاف الترجمة السريرية.

ويبين الشكل 1 إليه عمل لفيروسات الحصبة أونكوليتيك ترميز engagers خلية T بيسبيسيفيك. ويرد في الشكل 2مخطط انسيابي تصور سير العمل لهذا البروتوكول. ويبين الشكل 3 مثالاً جينوم فيروس الحصبة أونكوليتيك المعدلة. وهذا يوفر تمث...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

ويصف هذا البروتوكول سير عمل مفصلة لتوليد والسابقين فيفو توصيف الفيروسات أونكوليتيك للتعبير عن إيمونومودولاتورس، باستخدام فيروسات الحصبة ترميز engagers خلية T بيسبيسيفيك كمثال. التطبيق والتكيف مع سائر المنابر ناقلات والمتسلسلات سيتم التعجيل بتنمية إيمونوفيروثيرابيوتيكس الرواية للترجمة السريرية.

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في مواجهة التحديات الرئيسية في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسهيل تطوير ناقلات على الكوتوليك من أجل التعديل المناعي المستهدف. الميزة الرئيسية للنظام الوراثي العكسي المطبق هي تعدده؛ وبالتالي، يمكن تكييف النواقل لمعالجة مختلف الأسئلة البحثية واستهداف الأورام ذات التوقيعات المناعية المتنوعة. خطوات انتشار الفيروس تحديد خصوصا نقطة الوقت الأمثل لحصاد الفيروس من الصعب تعلم من بروتوكول النص لأن تشكيل syncytia يجب أن يتم تقييم بصريا مع مرور الوقت.البدء في تصميم ونسخ ناقلات مناعية المؤتلف كما هو موضح في المخطوطة. يصف هذا البروتوكول خطوات محددة لتطوير ناقل لقاح الحصبة على الكولليك، وترميز خلية تي بيسيفيك. لإنقاذ فيروس الحصبة من cDNA، قبل 24 ساعة من خلايا منتج فيروس الحصبة في صفيحة الحصبة بألواح الحمل بالتساوي على لوحة جدارية 6.بذور 200، 000 الخلايا في 2 ملليلتر DMEM تحتوي على 10 في المئة FBS في البئر لتحقيق 65 إلى 75 في المئة التقاء في وقت transfection. مزيج 5 ميكروغرام من الحمض النووي المؤتلف ترميز antigenome فيروس الحصبة التي سيتم استخدامها لtransfect الخلايا. plasmids المناسبة ومراسل الفلورسنت في حجم إجمالي قدره 200 ميكرولترات من DMEM.إضافة 18.6 ميكرولترات من كاشف نقل الدهون إلى الخليط ونفض الغبار على الفور الأنبوب لخلط. احتضان هذا المزيج transfection لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لنقل الخلايا المنتجة MV إزالة المتوسطة من لوحة 6 جيدا نمت إلى 65 إلى 75 في المئة التقاء وإضافة 1.8 ملليلتر من DMEM مع 2 في المئة FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin في البئر.ثم إضافة المزيج القطرة transfection إلى كل بئر ودوامة بعناية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي استبدال المتوسطة مع 2 ملليلتر من DMEM الطازجة مع 2 في المئة FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر Kanamycin وكرر هذا عندما يصبح المتوسطة الحمضية المعترف بها من قبل اللون الأصفر.استخدام المجهر لمراقبة الخلايا يوميا للتعبير الجيني مراسل وتشكيل syncytia. عندما تكون syncytia كبيرة تتكون من 20 أو أكثر من الخلايا مرئية أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جدا حصاد الفيروس. قبل 24 ساعة من بذور الحصاد المتوقعة ما يقرب من 1.5 مليون خلية منتجة MV في 12 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS على أطباق 10 سنتيمتر لتحقيق 65 إلى 75 في المئة التقاء في وقت تلقيح الفيروس.لجمع progyny الفيروس استخدام مكشطة الخلية لتكشط بعناية الخلايا المنتجة الملتزمة من لوحة جدار 6 مع الخلايا المصابة. نقل الوسيطة التي تحتوي على الخلايا المكشطة إلى أنبوب طرد مركزي. أجهزة الطرد المركزي على الأقل 2500 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة حطام الخلية.بعد الطرد المركزي مزيج من الخلايا الخالية من كبرى مع مصل حر المتوسطة إلى حجم النهائي من 4 ملليلتر لإعداد inoculum. إزالة المتوسطة من طبق 10 سم مع خلايا المنتج MV وإضافة inoculum إلى الخلايا. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.بعد الحضانة إضافة 6 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS وخلايا حاضنة بين عشية وضحاها. ثم استبدال المتوسطة مع 12 ملليلتر من DMEM الطازجة مع 10 في المئة FBS واحتضان في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون حتى الحصاد. لاحظ الخلايا مرتين على الأقل يوميا.قبل انفجار syncytia عندما اضطراب الغشاء تصبح الحصاد مرئية الفيروس. لحصاد الممر الأول إزالة عظمى من لوحة وإضافة 600 ميكرولترات من مصل المتوسطة الحرة. ثم استخدم رافع الخلية لكشط الخلايا ونقلها إلى أنبوب نظيف.مباشرة بعد أن تجميد تعليق الفيروس في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل لضمان التجميد الشامل. لتحديد الثرات من مخزونات الفيروس في octuplicates لكل aliquot باستخدام 96 لوحات الجدار. أولا سحب الخلايا المنتجة من T75 خلية قارورة ثقافة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.عد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى 150000 خلية لكل ملليلتر في DMEM مع 10 في المائة FBS. إضافة 90 ميكروليتر من DMEM مع 10 في المئة FBS في بئر من لوحة جدار 96. ثم إضافة 10 ميكروليتر من aliquot واحد من مخزون الفيروس إلى جميع الآبار 8 في العمود الأول من لوحة.تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات على الأقل. استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 10 ميكرولترات من كل بئر، من الأول إلى العمود الثاني، وخلطها جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. كرر هذا لكل عمود للحصول على تخفيفات المسلسل عشرة أضعاف من الفيروس باستخدام نصائح ماصة جديدة لكل خطوة التخفيف.تجاهل 10 ميكروليتر من كل بئر من العمود الأخير. إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 150، 000 خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر التأكد من عدم وجود كتل الخلية. احتضان في 37 درجة مئوية، 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.تحقق من وجود syncytia باستخدام مجهر الضوء. عدد syncytia في كل بئر من العمود مع أعلى عامل تخفيف يحتوي على syncytia مرئية. بالنسبة للفيروسات التي تُعدّر مراسلًا فلوريًا، يمكن حساب syncytia باستخدام المجهر الفلوري.لتحليل حركية تكرار فيروس الحصبة قبل يوم واحد من العدوى البذور 100، 000 خلايا فيرو في 1 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS لكل بئر على 12 لوحات جدار مع ما لا يقل عن 2 آبار لكل نقطة وقت من الاهتمام. لتصيب الخلايا استبدال المتوسطة مع 300 ميكرولترات من مصل خال من المتوسطة التي تحتوي على كمية كل من الفيروس. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين على الأقل.إزالة inoculum وإضافة 1 ملليلتر من DMEM مع 10 في المئة FBS ومواصلة الحضانة. في نقاط زمنية ذات صلة بعد عدوى حصاد progyny الفيروسية عن طريق كشط الخلايا مباشرة في الوسط. نقل المحتويات من كل بئر إلى أنبوب فردي.ااكسر التجمد في النيتروجين السائل ويخزن عند 80 درجة مئوية حتى المعايرة ثم امضى كما هو موضح في المخطوطة. لبدء تقييم الخلايا المستحثة بوساطة BTE من خلال إطلاق LDH ، قم أولاً بعزل منتجات ترانسجين المفرزة التي تعبر عنها الخلايا المستهدفة المصابة بالفيروس وعزل الخلايا المناعية المؤثرة كما هو موضح في المخطوطة. ثم بذور الخلايا المستهدفة في لوحة جدار U-أسفل 96 وتشمل العينات كما هو موضح في المخطوطة.إضافة الموامَع المناعي المعزول سابقاً عند التركيزات المطلوبة للعينات المعنية. إضافة الخلايا المنشقة المناعية في النسب المطلوبة وإضافة متوسطة إلى حجم إجمالي 100 ميكرولترات لكل بئر. احتضان للأطر الزمنية المطلوبة التي تم تحديدها سابقاً عند 37 درجة مئوية و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.45 دقيقة قبل جمع عينة إضافة 10 ميكرولترات من 10X محلول تحلل إلى الآبار التي تحتوي على عينات T ماكس والضوابط المتوسطة المقابلة ومواصلة الحضانة. الطرد المركزي الخلايا في 250 مرة G لمدة 4 دقائق. نقل 50 ميكرولترات من اطالة من كل بئر إلى آبار من لوحة جدار 96 مسطحة أسفل التأكد من عدم نقل الخلايا.بعد إعداد حل الركيزة وفقا للشركة المصنعة إضافة 50 ميكرولترات لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة أو حتى T عينات ماكس تتحول إلى اللون الأحمر العميق. بعد الحضانة إضافة 50 ميكرولتررس من وقف حل لكل بئر.جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة في 4000 مرات G ومن ثم استخدام إبرة مجوفة لإزالة فقاعات الهواء. قياس الامتصاص البصري عند 490 نانومتر وحساب كما هو موضح في المخطوطة. بعد تلقيح مع غير معدلة وBTE ترميز على شكل تهتدّد الحصبة منحنيات نموّ النّواقل مقارنة على خلايا فيرو تظهر مماثلة.منحنيات قابلية البقاء الخلية على mc38 مورين سرطاني القولون والمستقيم الخلايا التي تعبر بشكل ثابت المستضد سرطانيمبريوني الإنسان ومستقبلات MV CD46 بعد التطعيم تظهر أن النشاط اللين من فيروس ترميز transgene يتخلف في خط الخلية الورم مورين. أظهر قياس تدفق الخلايا المستضدة الهدف المعبر عن الخلايا المحتضنة مع BTE في خمسة تمييعات مختلفة BTE ملزمة من قبل الخلايا بطريقة تعتمد على التركيز. في مناعة بعد سحب المغناطيسي إلى أسفل من الخلايا المرتبطة BTE أظهرت أنه عندما تم استخدام عدم استهداف BTE لم تكن هناك كميات يمكن الكشف عنها من الخلايا;في حين أنه عند استهداف عينات BTE كانت تستخدم الخلايا المقيدة كانت موجودة في جزء elution.ويشار إلى BTE المستضد المستهدف المحدد والتركيز السمية الخلوية تعتمد على خلايا مورين T من قبل ممثل LDH الافراج عن المقايسة ويبين أنه في المثال الحالي 15 في المئة قتل خلايا محددة تحققت في تركيز BTE عالية نسبيا من 1 ميكروغرام لكل ملليلتر مقارنة مع الخلايا المرجعية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تراقب الخلايا بانتظام للتحقق من تطور العدوى. لا تنس أن سلالات لقاح الحصبة المؤتلفة على الرغم من أنها مخففة قد تكون خطرة خاصة على الأفراد المثبطين للمناعة.تجنب التعرض باتباع إجراءات السلامة الحيوية المناسبة. وينبغي تطعيم الأفراد الذين يتعاملون مع الفيروسات قبل تنفيذ هذه الأساليب. بعد هذا الإجراء يمكن تحقيق التعبير الفيروسي من transgenes أخرى من أجل تحليل التفاعلات المضيفين الفيروس والآثار العلاجية.وقد مهد تطوير هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال العلاج الحيوي لاستكشاف آثار المواصفات المناعية المعبر عنها محليا في العديد من الكيانات السرطانية؛ في المختبر، في فيفو، وأيضا في التجارب السريرية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

نموذج شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة واستهداف سرطان الثدي نمو الورم النقيلي في الدماغ

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

تقييم النشاط المضاد للأورام في الجسم الحي للجسيمات النانوية Polyanhydride IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

الحفاظ على التنوع الخلوي للورم الأرومي الدبقي البشري خارج الجسم الحي باستخدام ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...