Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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这些方法是在海德堡国家肿瘤疾病中心的盖伊·ungerechts 博士教授领导的病毒治疗小组中建立的。我们感谢他和实验室小组的所有成员, 特别是托比亚斯·斯派克博士、鲁塔·维纳尔德博士、朱迪思·弗斯特、比尔吉特·霍耶勒和杰西卡·阿尔伯特。这项工作得到了其他 kröner-fre舍尼-弗雷斯尼乌斯基金会 (给予 c. e. engeland 的赠款 2015_A78) 和德国国家科学基金会 (dfg, 给予 c. e. eneland en 11192-1) 的支持。j. p. w. heidbuechel 获得了赫尔姆霍兹国际癌症研究研究生院的津贴。

请注意:[o]、[p] 和 [m] 分别表示适用于: 一般的 ovs、(大多数) 副粘病毒或 mv 的子部分。[b] 表示 bte 转基因的特定部分。
1将免疫导管编码的转基因感染克隆到麻疹病毒载体中
<ol><li>
[o] 设计插入序列。
	<ol>
<li>[o] 根据文献研究或基因屏幕等探索性数据, 决定一个感兴趣的免疫调节剂41 , 并从相关数据库 (如 genbank、欧洲核苷酸档案或国?...

结肠免疫治疗 (即 ovt 与免疫调节相结合) 为癌症治疗带来了巨大的希望, 需要进一步开发和优化编码免疫调节蛋白的结肠病毒。该协议描述了生成和验证此类载体的方法, 以便在相关的临床前模型中进行后续测试, 并将其潜在的未来临床翻译为新的抗癌疗法。
许多不同的结肠病毒平台具有明显的优势是可用的63。除了癌症特异性、病媒安全性、制造要求...

肿瘤病毒 (ova) 正在开发为抗癌疗法, 专门在肿瘤细胞内复制并杀死肿瘤细胞, 同时保持健康组织的完整。现在, 人们普遍认为, 在大多数情况下, 结肠病毒治疗 (ovt) 并不完全依靠病毒的有效复制和传播来完全的肿瘤裂解, 而是需要额外的作用机制来成功治疗, 包括血管和间质靶向, 重要的是, 免疫刺激1,2,3,4。虽然许多早期的 ov 研究使用了未经修改的病毒, 但目前的研究受益于生物理解的提高、可能含有新的 ov 的病毒生物库以及基因工程为创造先进的 ov 而提供的可能性平台5,6,7。
鉴于免疫治疗最近的成功, 免疫调节转基因在孤儿和易受要求的基因工程中特别感兴趣.与全身给药相比, 接受 OV-infected 的肿瘤细胞有针对性地表达此类基因产物可降低毒性。定位是通过使用固有的同源性病毒或通过修改病毒取向8来实现的。局部免疫调节增强了 ovt 的多方面抗肿瘤机制。此外, 这一策略有助于质疑病毒、肿瘤细胞和宿主免疫系统之间的相互作用。为此, 该协议提供了一个适用和可调整的工作流程, 用于设计、克隆、抢救、传播和验证编码此类转基因的阴道副粘病毒 (特别是麻疹病毒) 载体。
免疫反应的调节可以通过针对癌症免疫周期9不同步骤的各种转基因产品来实现, 包括增强肿瘤抗原识别 [例如, 肿瘤相关抗原 (taas) 或诱导剂。主要组织相容性复合体 (mhc) i 类分子] 超过支持树突状细胞成熟, 有效的抗原表达 (细胞因子);招募和激活所需的免疫细胞, 如细胞毒性和辅助 t 细胞 [趋化因子, 双特异性 t 细胞引擎 (bte)];针对调节 t 细胞、骨髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞 (抗体、bte、细胞因子) 等抑制细胞;防止效应细胞抑制和衰竭 (检查点抑制剂)。因此, 有大量的生物制剂可供选择。有必要评估这种病毒编码的免疫调节剂, 使其了解治疗效果和可能的协同作用, 并了解各自的机制, 以改善癌症治疗。
否定意义单链 rna 病毒的特点是几个特点, 有利于他们作为结肠病媒使用。其中包括自然转子组织、大基因组能力的转基因 (超过 5kb)10,11, 有效的传播, 包括合胞形成, 和高免疫原性12。因此, ov 平台基于犬疫病毒13、腮腺炎病毒14、新城疫病毒15、仙台病毒16、17、simian病毒 518 和Tupaia 副粘病毒19已开发。最突出的是, 麻疹减毒活株 (mv) 在临床前和临床发展方面取得了 2021个进展。这些病毒株几十年来一直被用于常规免疫接种, 安全记录非常好.此外, 由于对粘病毒的严格的细胞质复制, 没有插入诱变的风险。一个基于抗基因组 cdna 的多功能反向遗传学系统, 允许将转基因插入到额外的转录单位 (atu) 是11,23,24。目前正在临床试验中评估编码钠-碘化物对称性 (mv-nis) 以用于成像和放射治疗或可溶性癌胚抗原 (mv-cea) 作为病毒基因表达替代标记的 mv 载体 (nct02962167, nct0207994,nct02192775、nct01846091、nct023234713、nct00440814、nct002700230、nct03456908、nct000408590 和 NCT00408590)。安全给药已经确认, 以前的研究报告了抗肿瘤疗效的病例 25,26,27,28, 29,30 (由 msaouele. 各项) 审查, 为已经开发并在临床上进行测试的更多结肠麻疹病毒铺平了道路. mv 编码免疫调节分子针对不同步骤的癌症免疫周期已被证明延迟肿瘤生长和/或延长生存期的小鼠, 有证据表明免疫介导的疗效和长期保护免疫记忆在合成鼠标模型。vtor 编码的转基因包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (gm-csf)32,33,幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白34, 免疫检查点抑制剂 35,白细胞介素-12 (il-12)36、taas37和 bte38, 将肿瘤表面抗原与 cd3 交叉连接, 从而通过多克隆 t 细胞诱导抗肿瘤活性, 而不考虑 t 细胞受体特异性和共同刺激 (图 1)。为这些结构获得的有希望的临床前结果需要进一步的转化努力。
talimogene laherparepvec (t-vec) 是美国食品药品监督管理局 (fda) 和欧洲药品管理局 (ema) 批准的唯一一种经美国食品和药物管理局批准的 i 型单纯疱疹病毒。导致2015年底批准的第三阶段研究不仅显示了肿瘤内注射部位的疗效, 而且还显示了晚期黑色素瘤39的同期效应 (即非注射病变的缓解).此后, t-vec 进入了其他肿瘤实体的额外试验 (例如,非黑色素瘤皮肤癌、nct03458117; 胰腺癌、nct03086642), 并评估综合疗法, 特别是免疫检查抑制剂 (nct0292978625, nct0325636444, nct02509507, nct026263508, nct0292667016, nct026266000, nct0296378, nct01740297, rias e. 40).
这不仅表明了结肠免疫治疗的潜力, 而且还需要进一步研究, 以确定卓越的 ovt 和免疫调节的优越组合。合理设计额外的载体并为临床前试验开发这些载体是这项工作的关键。这也将促进对潜在机制的了解, 并对更个性化的癌症治疗进展产生影响。为此, 本出版物介绍了用于靶向癌症免疫治疗的副粘病毒的修饰和开发方法, 更具体地说, 介绍了编码 t 细胞参与抗体的结肠化麻疹病毒的方法 (图 2)。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

成功的癌症免疫治疗有可能实现长期的肿瘤控制。尽管最近在临床上取得了成功, 但仍然迫切需要针对个别肿瘤免疫特征量身定制的安全有效的治疗方法。结肠病毒能够诱导抗肿瘤免疫反应以及肿瘤受限的基因表达。该方案描述了免疫调节结肠病媒的产生和体外分析。以麻疹疫苗病毒编码双特异性 t 细胞发动机为例, 一般的方法可以适应其他病毒种类和转基因。所介绍的工作流包括重组病毒的设计、克隆、抢救和传播。包括分析载体的复制动力学和裂解活性以及离体免疫调节剂的功能的方法, 从而促进新的药物的产生, 以便在临床前模型中进一步发展, 并最终实现临床翻译。

图 1显示了结肠麻疹病毒编码双特异性 t 细胞器的作用机制。图 2显示了描述此协议工作流的流程图。图 3 显示了一个改良的细胞性麻疹病毒基因组的示例。这提供了应用于麻疹病毒反基因组的具体变化的视觉表示和插入的转基因的特殊特征。典型的麻疹病毒引起的合胞症如图 ...

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Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

该协议描述了一个详细的工作流程, 用于产生和体外表征的结肠病毒的免疫调节剂的表达, 使用麻疹病毒编码双特异性 t 细胞引擎为例。应用和适应其他载体平台和转基因将加速新的免疫病毒疗法的发展, 用于临床翻译。

肿瘤靶向免疫调节副病毒的设计与评价

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

这种方法有助于解决癌症免疫治疗领域的主要挑战，促进靶向免疫调节的肿瘤载体的发展。应用反向遗传系统的主要优点是它的多功能性;因此，载体可以适应各种研究问题和目标肿瘤与不同的免疫特征。病毒传播步骤，特别是确定收获病毒的最佳时间点很难从文本协议中学习，因为同步形成必须随着时间的推移进行视觉评估。开始设计和克隆重组免疫调节载体，如手稿中所述。该协议描述了开发一种心胶状麻疹疫苗载体的具体步骤，编码为双特异性T细胞接合器。为了从cDNA中抢救麻疹病毒，24小时前转染板麻疹病毒产生细胞均匀地在6壁板上。种子20万细胞在2毫升DMEM包含10%FBS每井，以达到65%至75%的汇合时转染。混合5微克的重组DNA编码麻疹病毒抗原组，将用于转染细胞。适当的质粒和荧光记者在总体积200微升DMEM。将18.6微升脂质转染试剂加入混合物中，并立即轻拂管子进行混合。在室温下孵育这种转染混合物25分钟。为了转染MV生产细胞，从生长到65%至75%的汇合的6井板中去除介质，并添加1.8毫升DMEM，每井有2%的FBS和50微克。然后将转染混合物滴到每个井中，并小心地旋转。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞过夜。第二天，用2毫升的新鲜DMEM代替介质，每毫升卡纳霉素为2%FBS和50微克，当介质变成黄色识别的酸性时，重复。使用显微镜每天观察细胞，以进行记者基因表达和同步形成。当由20个或更多细胞组成的大同步体可见或当细胞变得过于密集收获病毒。在预期收获前24小时，在12毫升DMEM中，约150万个MV产生细胞，在10厘米的盘上，FBS为10%，在病毒接种时达到65%至75%的汇合率。为了收集病毒，使用细胞刮刀小心地用转染细胞从6壁板中刮取附着的产生细胞。将含有刮过的电池的介质转移到离心管中。离心至少2500倍G和4摄氏度5分钟，以清除细胞碎片。离心后将无细胞上经剂与无血清介质混合，最终体积为4毫升，以准备进一时。用MV培养细胞从10厘米培养皿中去除培养基，并将中分细胞添加到细胞中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育至少2小时。孵育后加入6毫升DMEM，其中10%为FBS，并孵育细胞过夜。然后用12毫升的新鲜DMEM代替10%的FBS，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育，直到收获。每天至少观察两次细胞。在同步爆发之前， 当膜中断变得可见收获病毒。要收获第一通道，请从盘子中去除上一道，并加入600微升的血清自由介质。然后使用细胞提升器刮取细胞并转移到干净的管子上。紧接着将病毒冷冻在液氮中，并在80摄氏度下储存至少24小时，以确保彻底冷冻。使用 96 个墙板，确定每等物中病毒库存的滴度。首先将生产细胞从T75细胞培养瓶中拉入50毫升锥形管中。计算细胞数，并在DMEM中用10%的FBS将细胞悬浮液调整为每毫升15万个细胞。加入 90 微升 DMEM，每 96 壁板的 FBS 为 10%。然后从病毒库存的一个等分中加入 10 微升到板的第一列的所有 8 个孔中。通过上下移液至少10次彻底混合。使用多通道移液器将每井的 10 微升从第一柱转移到第二柱，然后通过上下移液进行彻底混合。对每列重复此步骤，使用每个稀释步骤的新鲜移液器提示获取病毒的连续十倍稀释。从最后一列的每个井中丢弃 10 微升。在每毫升井中加入100个微升细胞悬浮液，每毫升有15万个细胞，确保没有细胞团块。在37摄氏度下孵育，48小时二氧化碳含量为5%。使用光学显微镜检查同步。在列的每个井中计数同步，其最高稀释因子包含可见的同步。对于编码荧光记者的病毒，可以使用荧光显微镜计算同步。用于分析麻疹病毒复制动力学在感染前一天种子10万维罗细胞在1毫升DMEM与10%FBS每孔12壁板与至少2孔每个时间点的兴趣点。感染细胞用含有相应量的病毒的300微升无血清介质取代该介质。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育至少2小时。去除 inoculum，并添加 1 毫升 DMEM 与 10% FBS 并继续孵育。在相关时间点感染后收获病毒亲血性直接刮入介质。将每个井内的物品转移到单个管中。在液氮中捕捉冻结，储存在80摄氏度，直到滴定，然后按照手稿中所述进行。为了开始通过LDH释放对BTE诱导细胞诱发细胞毒性进行评估，首先分离病毒感染目标细胞表达的分泌转基因产品，并分离出手稿中描述的免疫效应细胞。然后在 U 底部 96 壁板中播种目标细胞，并包括手稿中描述的样本。以所需浓度将以前分离的免疫调节剂添加到相应的样品中。以所需比例添加免疫缺陷细胞，并添加介质，每井总体积为 100 微升。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育先前确定的时间框架。样品采集前45分钟，将10微升10X Lysis溶液加入含有T max样品和相应介质控制并持续孵育的井中。将细胞在250倍G下离心4分钟。将 50 微升清水从每口井转移到平底 96 壁板的井中，确保不转移细胞。根据制造商准备基板溶液后，每井加入50微升。在黑暗中室温下孵育30分钟，或直到T最大样品变成深红色。孵育后，每井增加50微升止损溶液。在 4000 倍 G 下离心 1 分钟，然后使用空心针去除气泡。测量 490 纳米的光学吸收度，并按手稿中所述进行计算。接种后，未经过修改和BTE编码的病毒病毒生长曲线的对量在维罗细胞上出现类似的情况。mc38 murine结直肠癌细胞的细胞活性曲线稳定地表达人类癌细胞抗原和接种后MV受体CD46，表明转基因编码病毒的解合活性在小鼠肿瘤细胞系中落后。在五种不同的稀释下，用BTE孵育的目标抗原表达细胞的流动细胞学显示，BTE以浓度依赖的方式由细胞结合。在BTE相关细胞磁拉下后免疫blot显示，当使用非靶向BTE时，没有可检测的细胞量;而当靶向BTE样本使用时，结合细胞存在于洗脱分数中。BTE中培养靶抗原特异性和浓度依赖性，用代表性的LDH释放测定表示，在目前例中，与参考细胞相比，在相对较高的BTE浓度为每毫升1微克时，实现了15%特异性细胞杀杀。在尝试此程序时，重要的是要记住定期监测细胞，以检查感染的进展。不要忘记，重组麻疹疫苗菌株虽然衰减可能是危险的，特别是对免疫抑制的个人。遵循适当的生物安全程序，避免接触。处理病毒的个人应在执行这些方法之前接种疫苗。按照这个程序，可以实现病毒表达的进一步转基因，以分析病毒宿主的相互作用和治疗效果。这些技术的发展为生物治疗领域的研究人员探索许多肿瘤实体中局部表达免疫调节剂的作用铺平了道路;在体外、体内和临床试验中。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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科研

癌症研究

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