Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Disse metoder blev etableret i gruppen Virotherapy, ledet af Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts på det nationale Center for Tumor sygdomme i Heidelberg. Vi står i gæld til ham og alle medlemmer af teamet laboratorium især Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler og Jessica Albert. Dette arbejde blev støttet af andet Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 til C.E. Engeland) og tysk National Science Foundation (DFG, give C.E. Engeland da 1119/2-1). J.P.W. Heidbuechel modtager et stipendium af Helmholtz International Graduate School for kræftforskning.

Bemærk: [O], [P], og [M] angive underafsnit gælder: OVs i general, (de fleste) paramyxovirus eller MV kun, henholdsvis. [B] angiver sektioner specifikke for BTE transgener.
1 kloning af Immunmodulator-kodning transgener til mæslinger Virus vektorer
<ol><li>
[O] design indsætte sekvens.
	<ol>
<li>[O] træffe beslutning om en Immunmodulator af interesse baseret på litteratur forskning eller sonderende data såsom genetiske skærme41</sup...

Oncolytic immunterapi (dvs.., OVT i kombination med immunomodulation) holder meget lovende til behandling af cancer, kræver yderligere udvikling og optimering af oncolytic virus kodning immunmodulerende proteiner. Denne protokol beskriver metoder til at generere og validere sådanne vektorer til efterfølgende test i relevante prækliniske modeller og potentielle fremtidige kliniske oversættelse til nye anti-cancer terapi.
Mange forskellige oncolytic virus platforme med forskellige ...

Oncolytic virus (OVs) er ved at blive udviklet som anti-cancer terapi, der specifikt replikere inden for og dræbe tumorceller mens forlader raske væv intakt. Det er nu blevet fælles forståelse at oncolytic virotherapy (OVT), i de fleste tilfælde, ikke stole udelukkende på komplet tumor lysering af effektiv replikering og spredning af virus, men kræver yderligere virkningsmekanismer for behandling succes, herunder vaskulære og stromale målretning og vigtigere, immunstimulering1,2,3,4. Mens mange snarlig OV undersøgelser anvendes uændret vira, Aktuel forskning har nydt godt af en bedre biologisk forståelse, virus biobanker, der potentielt indeholder roman OVs, og genteknologi muligheder for at skabe avancerede OV platforme5,6,7.
I betragtning af den seneste succes for immunterapi, er immunmodulerende transgener af særlig interesse med hensyn til genteknologi af OVs. Målrettet udtryk for sådanne genprodukter af OV-inficerede tumorceller reducerer toksicitet i forhold til systemisk administration. Målretning opnås enten ved hjælp af vira med iboende oncoselectivity eller ved at ændre virale tropisme8. Lokale immunomodulation forbedrer de mangesidede anti-tumor mekanismer af OVT. Denne strategi er desuden medvirkende til spørgekriterierne samspillet mellem vira, tumorceller og vært immunsystemet. Med henblik herpå giver denne protokol en gældende og justerbar workflow til at designe, klone, redde, udbrede og validere oncolytic paramyxovirus (specielt mæslingevirus) vektorer kodning sådan transgener.
Graduering af immunresponset kan opnås ved en bred vifte af transgene produkter rettet mod forskellige trin af kræft-immunitet cyklus9, herunder styrkelse af tumor antigen anerkendelse [fx tumor-associerede antigener (TAAs) eller induktorer af store histocompatibility complex (MHC) klasse i molekyler] over støtte dendritiske celle modning for effektiv antigen præsentation (cytokiner); rekruttering og aktivering ønskede immunceller som cytotoksiske og hjælper T-celler [kemokiner, bispecific T-celle ager (BTEs)]; målretning smittespredningshæmmende celler som regulerende T-celler, myeloid-afledte suppressor celler, tumor-associerede makrofager og kræft-associerede fibroblaster (antistoffer, BTEs, cytokiner); og forebyggelse af effektor celler hæmning og udmattelse (checkpoint hæmmere). Således, en overflod af biologiske agenser er tilgængelige. Evaluering af sådanne virus-kodet hæmmende vedrørende terapeutiske virkning og mulige synergier samt forståelse af respektive mekanismer er nødvendigt at forbedre kræftbehandling.
Negativ forstand enkeltstrenget RNA-vira af familien Paramyxoviridae er kendetegnet ved flere funktioner bidrager til deres anvendelse som oncolytic vektorer. Disse omfatter en naturlig oncotropism, stor genomisk kapacitet for transgener (mere end 5 kb)10,11, effektiv spredning, herunder syncytia dannelse og høj immunogenicitet12. Derfor, OV platforme baseret på canine distemper virus13, fåresyge virus14, Newcastle disease virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518og Tupaia paramyxovirus19 er blevet udviklet. De mest fremtrædende, live svækkede mæslinger virus vaccine stammer (MV) er kommet i prækliniske og kliniske udvikling20,21. Disse virusstammer har været anvendt i årtier for rutinemæssig immunisering med en fremragende sikkerhed post22. Derudover er der ingen risiko for pattedyrsceller mutagenese på grund af den strengt cytosole replikering af paramyxovirus. En alsidig omvendt genetik system baseret på anti-genomisk cDNA, der giver mulighed for indsættelse af transgener i yderligere transskription enheder (ATUs) er tilgængelige11,23,24. MV vektorer kodning natrium-Iodid symporter (MV-NIS) til billedbehandling og strålebehandling eller opløselige carcioembryonisk antigen (MV-CEA) som en surrogat markør for viral genekspression evalueres i øjeblikket i kliniske forsøg (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 og NCT00408590). Sikker administration er blevet bekræftet og har indberettet tilfælde af anti-tumor effekt i tidligere undersøgelser25,26,27,28,29, 30 (gennemgået af Msaouel et al.31), baner vejen for yderligere oncolytic mæslinger vira, der er blevet udviklet og testet preclinically. MV kodning immunmodulerende molekyler rettet mod forskellige trin af kræft-immunitet cyklus har vist sig at forsinke tumorvækst og/eller forlænge overlevelsen i mus, med dokumentation for immun-medieret effekt og langsigtede beskyttende immun hukommelse i syngeneic musemodeller. Vektor-kodet transgener omfatter granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF)32,33, H. pylori aktivering af neutrofile protein34, immun checkpoint hæmmere35, interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37og BTEs38, som krydse-link en tumor overflade antigen med CD3 og dermed fremkalde anti-tumor aktivitet af polyklonale T celler, uanset T-celle receptoren specificitet og co stimulation ( Figur 1). De lovende prækliniske resultater opnået for disse konstruktioner efterspørgslen yderligere translationel indsats.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), en type jeg herpes simplex virus kodning GM-CSF, er den eneste oncolytic terapeutiske godkendt af de Forenede Stater mad og Drug Administration (FDA) og det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA). Fase III undersøgelse fører til godkendelser i slutningen 2015 har ikke kun vist effekt i stedet for samhandel tumorsygdomme injektion, men også abscopal effekter (dvs. remissioner af ikke-indsprøjtning læsioner) i avanceret melanom39. T-VEC har siden indgået yderligere forsøg for anvendelse i andre tumor enheder (f.eks., ikke-melanom hudkræft, NCT03458117, kræft i bugspytkirtlen, NCT03086642) og for evaluering af Kombinationsbehandlinger, især med immun checkpoint hæmmere (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 og Ribas et al.40).
Det viser ikke kun potentialet i oncolytic immunterapi, men også behovet for yderligere forskning for at identificere superior kombinationer af OVT og immunomodulation. Rationelt design af yderligere vektorer og deres udvikling til præklinisk afprøvning er nøglen til denne virksomhed. Dette vil også fremme forståelse af de underliggende mekanismer og har betydning for progression mod mere personlig kræftbehandling. Med henblik herpå præsenterer denne publikation metoden til ændring og udvikling af paramyxovirus for målrettede cancer immunterapi og mere specifikt af oncolytic mæslinger virus kodning T-celle-engagerende antistoffer (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Vellykket cancer immunterapi har potentiale til at opnå langsigtet tumor kontrol. Trods nylige kliniske succeser stadig der et presserende behov for sikre og effektive behandlinger skræddersyet til individuelle tumor immun profiler. Oncolytic virus aktiverer induktion af anti-tumor immunrespons samt tumor-begrænset genekspression. Denne protokol beskriver generation og ex vivo analysen af immunmodulerende oncolytic vektorer. Med fokus på mæslinger vaccine virus kodning bispecific T-celle ager som eksempel, kan den generelle metode tilpasses til andre virus arter og transgener. Arbejdsprocessen præsenteres omfatter design, kloning, redning og formering af rekombinant vira. Assays til at analysere replikation kinetik og lytisk aktivitet af vektoren samt funktionalitet af den isolerede Immunmodulator ex vivo er inkluderet, således at lette generation af roman agenter for yderligere udvikling i prækliniske modeller og i sidste ende kliniske oversættelse.

Figur 1 illustrerer virkningsmekanisme af oncolytic mæslinger virus kodning bispecific T-celle ager. Et flowchart viser arbejdsprocesser af denne protokol er præsenteret i figur 2. Figur 3 viser et eksempel på en modificeret oncolytic mæslinger virus genomet. Dette giver en visuel repræsentation af de specifikke ændringer anvendes på mæslinger virus anti-genom og særlige fu...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Denne protokol beskriver en detaljeret arbejdsgang for generation og ex vivo karakterisering af oncolytic virus for udtryk for hæmmende, ved hjælp af mæslinger virus kodning bispecific T-celle ager som eksempel. Ansøgning og tilpasning til andre vektor platforme og transgener vil fremskynde udviklingen af nye immunovirotherapeutics for klinisk oversættelse.

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Denne metode kan hjælpe med at løse de vigtigste udfordringer inden for kræftimmunterapi ved at lette udviklingen af oncoctic vektorer til målrettet immunmodulation. Den største fordel ved det anvendte omvendte genetiske system er dets alsidighed;derfor kan vektorer tilpasses til at løse forskellige forskningsspørgsmål og målrette tumorer med forskellige immunsignaturer. Virussformeringstrinnene, der især bestemmer det optimale tidspunkt at høste virus, er vanskelige at lære af en tekstprotokol, fordi synytiadannelse skal vurderes visuelt over tid.For at begynde at designe og klone rekombinant immunmodulerende vektorer som beskrevet i manuskriptet. Denne protokol beskriver specifikke trin for udvikling af en onkolytisk mæslingevaccine vektor, kodning en bispecifik T celle engager. For at redde mæslingevirus fra cDNA, 24 timer før transfection plade mæslinger virus producent celler jævnt på en 6 væg plade.Seed 200, 000 celler i 2 milliliter DMEM indeholder 10 procent FBS per brønd for at opnå 65 til 75 procent sammenløb på tidspunktet for transfektion. Bland 5 mikrogram rekombinant DNA, der kodning af mæslingevirusantigenom, som vil blive brugt til at transfect cellerne. Passende plasmider og en fluorescerende reporter i et samlet volumen på 200 mikroliter af DMEM.Tilsæt 18,6 mikroliter liposomal transfektion reagens til blandingen og straks svirp røret til at blande. Inkuber denne transfektionsblanding i 25 minutter ved stuetemperatur. At transfect MV producentceller fjerne mediet fra 6 godt plade dyrket til 65 til 75 procent sammenløb og tilføje 1,8 milliliter DMEM med 2 procent FBS og 50 mikrogram pr milliliter Kanamycin per brønd.Derefter tilsættes transfektion mix dropwise til hver brønd og hvirvle omhyggeligt. Inkuber cellerne natten over ved 37 grader Celsius og 5 procent kuldioxid. Den følgende dag erstatte medium med 2 milliliter frisk DMEM med 2 procent FBS og 50 mikrogram pr milliliter Kanamycin og gentag dette, når medium bliver sure anerkendt af den gule farve.Brug et mikroskop til at observere celler dagligt for reporter genekspression og syncytia dannelse. Når stor synyti bestående af 20 eller flere celler er synlige, eller når celler bliver for tæt høst virus. 24 timer før den forventede høst frø ca 1,5 millioner MV producentceller i 12 milliliter DMEM med 10 procent FBS på 10 centimeter retter for at opnå 65 til 75 procent sammenløbet på tidspunktet for virus vaccination.For at indsamle virus progyny bruge en celle skraber til omhyggeligt skrabe klæbende producent celler fra 6 vægplade med transficerede celler. Overfør det medium, der indeholder de skrabede celler, til et centrifugerør. Centrifuge i mindst 2500 gange G og 4 grader Celsius i 5 minutter for at fjerne cellerester.Efter centrifugering blandes det cellefrie supernatant med serumfrit medium til et endeligt volumen på 4 milliliter for at forberede inokulum. Fjern mediet fra 10 centimeter skålen med MV producentceller og tilsæt inokulum til cellerne. Inkuberes i mindst 2 timer ved 37 grader Celsius og 5 procent kuldioxid.Efter inkubation tilføje 6 milliliter DMEM med 10 procent FBS og inkubere celler natten over. Derefter erstatte mediet med 12 milliliter frisk DMEM med 10 procent FBS og inkubere ved 37 grader Celsius og 5 procent kuldioxid indtil høst. Overhold cellerne mindst to gange dagligt.Før syncytia brast, når membran forstyrrelser bliver synlige høst virus. For at høste den første passage fjerne supernatant fra pladen og tilsæt 600 mikroliter af serum gratis medium. Brug derefter en celleløfter til at skrabe cellerne og overføre til et rent rør.Umiddelbart efter at fryse virus suspension i flydende nitrogen og opbevares ved 80 grader Celsius i mindst 24 timer for at sikre grundig frysning. At bestemme titers af virus lagre i octuplicates per aliquot ved hjælp af 96 vægplader. Først trækkes producentcellerne fra T75-cellekulturkolber ind i 50 milliliterkonisk rør.Tæl cellerne, og juster cellesuspensionen til 150.000 celler pr. milliliter i DMEM med 10 procent FBS. Tilføj 90 mikroliter af DMEM med 10 procent FBS pr. brønd på en 96 vægplade. Derefter tilsættes 10 mikroliter fra en aliquot af virus bestanden til alle 8 brønde i den første kolonne af pladen.Bland grundigt ved pipettering op og ned mindst 10 gange. Brug en multikanalpipette til at overføre 10 mikroliter af hver brønd, fra den første til den anden kolonne, og bland grundigt ved pipettering op og ned. Gentag dette for hver kolonne for at opnå serielle tigange fortyndinger af virus ved hjælp af friske pipettespidser for hvert fortyndingstrin.Kassér 10 mikroliter fra hver brønd i den sidste kolonne. Tilføj 100 mikroliter af celle suspension med 150, 000 celler pr milliliter til hver brønd og sørg for, at der ikke er nogen celle klumper. Inkubere ved 37 grader Celsius, 5 procent kuldioxid i 48 timer.Kontroller, om der er synkronisering ved hjælp af et let mikroskop. Tæl synygh i hver brønd i kolonnen med den højeste fortyndingsfaktor, der indeholder synlig synkronitet. For virus, der kodning en fluorescerende reporter, kan syncytia tælles ved hjælp af fluorescensmikroskopi.Til analyse af mæslingevirus replikation kinetik en dag før infektion frø 100, 000 vero celler i 1 milliliter DMEM med 10 procent FBS per brønd på 12 vægplader med mindst 2 brønde for hver tids interessepunkt. At inficere cellerne erstatte medium med 300 mikroliter af serum fri medium, der indeholder den respektive mængde af virus. Inkubere ved 37 grader Celsius og 5 procent kuldioxid i mindst 2 timer.Fjern inoculum og tilsæt 1 milliliter DMEM med 10 procent FBS og fortsætte inkubation. På relevante tidspunkt punkter efter infektion høst viral progyny ved direkte skrabe celler i mediet. Overfør indholdet fra hver brønd til et individuelt rør.Snap fryse i flydende nitrogen og opbevares ved 80 grader Celsius indtil titrering og derefter fortsætte som beskrevet i manuskriptet. For at påbegynde evalueringen af BTE-induceret cellemedieret cytotoksicitet ved LDH-frigivelse skal først isolere udskillede transgeneprodukter udtrykt ved virusinficerede målceller og isolere immuneffektorceller som beskrevet i manuskriptet. Derefter frø målceller i en U-bund 96 væg plade og omfatter prøver som beskrevet i manuskriptet.Der tilsættes tidligere isolerede immunmodulatorer ved de ønskede koncentrationer til de respektive prøver. Tilføj immunafhopperceller ved ønskede nøgletal og tilsæt medium til et samlet volumen på 100 mikroliter pr. brønd. Inkubere for de ønskede tidligere fastsatte tidsrammer ved 37 grader Celsius og 5 procent kuldioxid.45 minutter før prøvetagning tilsættes 10 mikroliter 10X lysisopløsning til brønde, der indeholder T max-prøver og de tilsvarende mediumkontroller, og inkubation fortsættes. Centrifuge cellerne ved 250 gange G i 4 minutter. Overfør 50 mikroliter supernatant fra hver brønd til brønde i en flad bund 96 vægplade og sørg for ikke at overføre cellerne.Efter tilberedning af substrat opløsning i henhold til producenten tilføje 50 mikroliter til hver brønd. Inkuberes ved stuetemperatur i mørke i 30 minutter, eller indtil T max prøver bliver dybrød. Efter inkubation tilsættes 50 mikroliter stopopløsning til hver brønd.Centrifuge i 1 minut ved 4000 gange G og derefter bruge en udhulet nål til at fjerne luftbobler. Mål optisk absorbans ved 490 nanometer og beregn som beskrevet i manuskriptet. Efter vaccination med uændret og BTE kodning oncolytic mæslingevirus vækstkurver af de sammenlignede vektorer på vero celler synes ens.Celle levedygtighed kurver på mc38 murine kolorektal karcinom celler stably udtrykker humane karcinoembryoniske antigen og MV receptorer CD46 efter inokulering viser, at lytisk aktivitet af transgenekodning virus halter bagefter i murine tumor cellelinje. Flowcytometri af målantigen, der udtrykker celler, der inkuberes med BTE'er ved fem forskellige fortyndinger, viste BTE-binding af celler på en koncentrationsafhængig måde. I immunoblot efter magnetisk nedtagning af BTE-tilknyttede celler viste, at når der blev anvendt ikke-målbaserede BTE'er, var der ingen påviselige mængder celler, mens der ved målretning af BTE-prøver var bundne celler til stede i elutionfraktionen.BTE medieret mål antigen specifikke og koncentration afhængige cytotoksicitet af murine T-celler er angivet ved repræsentativ LDH frigivelse assay og viser, at i dette eksempel 15 procent specifik celle drab blev opnået ved en relativt høj BTE koncentration på 1 mikrogram per milliliter sammenlignet med referenceceller. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at regelmæssigt overvåge celler for at kontrollere progression af infektion. Glem ikke, at rekombinant mæslingevaccine stammer selvom svækket kan være farligt, især for immun-undertrykte personer.Undgå eksponering ved at følge de relevante biosikkerhedsprocedurer. Personer, der håndterer virus, bør vaccineres, før disse metoder udføres. Efter denne procedure viral ekspression af yderligere transgener kan opnås for at analysere virus værter interaktioner og terapeutiske virkninger.Udviklingen af disse teknikker har banet vejen for forskere inden for bioterapi at udforske virkningerne af lokalt udtrykte immunmodulatorer i mange tumorøse enheder;In Vitro, In Vivo, og også i kliniske forsøg.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede basiseditorer

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice Model til at studere og målrette brystkræft hjernemetastatisk tumorvækst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering af in vivo antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definition af genfunktioner i tumorigenese ved Ex vivo Ablation af floxede alleler i maligne perifere nerveskede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Opretholdelse af menneskelig glioblastom cellulær mangfoldighed Ex vivo ved hjælp af tredimensionel organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...