Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Ces méthodes ont été établies dans le groupe virothérapie dirigé par Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts au Centre National pour les maladies tumorales à Heidelberg. Nous sommes reconnaissants envers lui et tous les membres de l’équipe du laboratoire, en particulier le Dr Tobias Speck, le Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, les Birgit Hoyler et que les Jessica Albert. Ce travail a été soutenu par l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 à C.E. Engeland) et l’allemand National Science Foundation (DFG, accorder EN 1119/2-1 à Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel reçoit une allocation de la Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Remarque : [O], [P] et [M] indiquent les paragraphes applicables à : OVs en général, (la plupart) paramyxovirus ou MV, respectivement. [B] indique les sections spécifiques pour BTE transgènes.
1 clonage de transgènes codant immunomodulateur en vecteurs de Virus de la rougeole
<ol><li>
[O] conception insérez la séquence.
	<ol>
<li>[O] choisir un immunomodulateur d’intérêt basé sur la recherche dans la littérature ou sur exploratoire des donné...

Oncolytique immunothérapie (i.e., OVT en combinaison avec l’immunomodulation) est très prometteur pour le traitement du cancer, exigeant davantage développement et optimisation de virus oncolytiques codant des protéines immunomodulatrices. Ce protocole décrit les méthodes pour générer et valider ces vecteurs pour contrôle ultérieur dans des modèles précliniques appropriés et potentielle future traduction clinique en nouveaux traitements contre le cancer.
Nombreuses plat...

Virus oncolytiques (OVs) sont développés comme des thérapies de lutte contre le cancer qui spécifiquement répliquer au sein et tuer les cellules de la tumeur tout en conservant les tissus sains intacts. Il est devenu commun de comprendre cette virothérapie oncolytiques (OVT), dans la plupart des cas, ne repose pas uniquement sur la lyse tumorale complète en réplication efficace et la diffusion du virus, mais exige des mécanismes supplémentaires d’action pour la réussite du traitement, y compris vasculaire et stromales ciblage et, surtout, la stimulation immunitaire1,2,3,4. Tandis que plusieurs des premières études OV utilisé virus non modifiées, les recherches actuelles a profité d’une biologique améliorée compréhension, virus biobanques qui contiennent potentiellement roman OVs et les possibilités offertes par génie génétique afin de créer des avancées OV plates-formes5,6,7.
Vu le succès récent de l’immunothérapie, immunomodulateurs transgènes sont particulièrement intéressantes concernant le génie génétique OVs. Expression ciblée de ces produits de gène par les cellules tumorales infectées par OV réduit la toxicité par rapport à l’administration systémique. Ciblage est obtenue en utilisant des virus avec oncoselectivity inhérent ou en modifiant le tropisme viral8. Immunomodulation locale améliore les mécanismes anti-tumorale multi-facettes de OVT. En outre, cette stratégie est instrumentale dans l’interrogation de l’interaction entre les virus, les cellules tumorales et le système immunitaire. À cette fin, ce protocole prévoit un flux de travail applicable et réglable afin de concevoir, clone, sauvetage, propager et valider des vecteurs de paramyxovirus (plus précisément les virus de la rougeole) oncolytiques codant ces transgènes.
Modulation de la réponse immunitaire peut être réalisée par une grande variété de produits de transgene ciblant les différentes étapes du cancer-immunité cycle9, y compris renforcer la reconnaissance de l’antigène tumoral [par exemple, les antigènes associés aux tumeurs (AVA) ou des inducteurs de complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules] plus soutenir la maturation des cellules dendritiques pour la présentation des antigènes efficace (cytokines) ; recrutement et activation des cellules immunitaires désirés comme cytotoxiques et des cellules de helper T [chimiokines, bispécifiques recruteurs de lymphocytes T (TSEI)] ; cibler les cellules suppressives comme les lymphocytes T régulateurs, cellules myéloïdes dérivés suppressives, macrophages associées à la tumeur et cancer associés aux fibroblastes (TSEI, des anticorps, cytokines) ; et prévenir l’inhibition des cellules effectrices et épuisement (inhibiteurs de point de contrôle). Ainsi, il existe une pléthore d’agents biologiques. Évaluation de ces immunomodulateurs virus-encodé en ce qui concerne l’efficacité thérapeutique et les synergies possibles ainsi que la compréhension des mécanismes respectifs est nécessaire d’améliorer le traitement du cancer.
Virus à ARN simple brin sens négatif de la famille des Paramyxoviridae sont caractérisées par plusieurs caractéristiques propices à leur utilisation en tant que vecteurs oncolytiques. Il s’agit d’une oncotropism naturelle, grande capacité de génomique pour transgènes (plus de 5 Ko)10,11, efficace de diffusion dont la formation de syncytiums et forte immunogénicité12. Par conséquent, les plates-formes OV canine distemper virus13oreillons virus14, Newcastle disease virus15, virus Sendai16,17, Simien 518et de paramyxovirus Tupaia19 ont été développés. Plus en évidence, vivre de vaccin contre le virus rougeoleux atténué souches (MV) ont progressé dans le développement préclinique et clinique20,21. Ces souches de virus ont été utilisés pendant des décennies pour la vaccination systématique avec une excellente sécurité record22. En outre, il n’y a aucun risque pour la mutagénèse insertionnelle en raison de la réplication strictement cytosolique du paramyxovirus. Un système polyvalent de génétique inverse issu des ADNc anti-génomique qui permet l’insertion de transgènes dans unités de transcription supplémentaires (ATUs) est disponible de11,23,24. Vecteurs de MV symporteur de l’iodure de sodium (MV-NIS) d’encodage pour l’imagerie et de radiothérapie ou de l’antigène carcinoembryonnaire soluble (MV-ACE) comme marqueur de substitution pour l’expression des gènes viraux sont actuellement évalués dans des essais cliniques (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 et NCT00408590). Administration sécuritaire a été confirmée et efficacité antitumorale ont été signalés dans les précédentes études25,26,27,28,29, 30 (évaluée par Msaouel et Al.31), ouvrant la voie à des virus de la rougeole oncolytiques supplémentaires qui ont été développées et testées à l’intérêt. MV encodage immunomodulatrices molécules ciblant les diverses étapes du cycle du cancer-immunité auraient dû être divulgués de ralentir la croissance tumorale et/ou prolonger la survie chez les souris, avec la preuve de leur efficacité immunitaire et à long terme mémoire immunitaire protectrice en syngénique modèles de souris. Les transgènes vecteur codé comprennent stimulant factor (GM-CSF)32,33, H. pylori Activation des neutrophiles protéine34, point de contrôle immunitaire inhibiteurs35, des colonies de granulocytes et macrophages interleukine-12 (IL-12)36, Ava37et TSEI38, qui réticuler un antigène de surface de tumeur avec CD3 et ainsi induire une activité antitumorale par les cellules T polyclonales, quel que soit T cell receptor spécificité et co-stimulation ( La figure 1). Les résultats précliniques prometteurs obtient pour ces constructions de nouveaux efforts translationnelle demande.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), un type j’ai le virus herpès simplex encodage GM-CSF, est le seul oncolytiques thérapeutiques approuvés par l’United States Food Drug Administration (FDA) et de l’Agence européenne des médicaments (EMA). L’étude de phase III menant aux homologations en fin 2015 n'a pas seulement montré une efficacité au site d’injection intra-tumorale, mais aussi des effets abscopal (c.-à-d., les remises des lésions non injectés) dans le mélanome avancé,39. T-VEC est entré depuis lors des essais supplémentaires pour application dans d’autres entités de la tumeur (par exemple cancer de la peau non-mélanome, , NCT03458117, cancer du pancréas, NCT03086642) ainsi que l’évaluation des thérapies de combinaison, surtout avec le point de contrôle immunitaire inhibiteurs (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 et Ribas et Al.40).
Cela montre non seulement le potentiel de l’immunothérapie oncolytiques, mais aussi la nécessité de poursuivre les recherches afin d’identifier les combinaisons supérieures de OVT et l’immunomodulation. Une conception rationnelle des vecteurs supplémentaires et leur développement pour les essais précliniques est essentielle pour cette entreprise. Cela fera avancer aussi la compréhension des mécanismes sous-jacents et a des implications pour la progression vers le traitement du cancer plus personnalisée. À cette fin, cette publication présente une méthodologie pour la modification et le développement du paramyxovirus pour immunothérapie ciblée contre le cancer et, plus particulièrement du virus de la rougeole oncolytiques encodage anticorps prise avec des lymphocytes T (Figure 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Immunothérapie des cancers réussie a le potentiel pour obtenir un contrôle tumoral à long terme. Malgré des succès cliniques récentes, il reste un besoin urgent de traitements sûrs et efficaces adaptés aux profils immunitaire de chaque tumeur. Virus oncolytiques permettent l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que l’expression des gènes de tumeur restreints. Ce protocole décrit l’analyse de génération et ex vivo des immunomodulateurs oncolytiques vecteurs. En se concentrant sur les virus de la rougeole vaccin encodage bispécifiques lymphocytes T recruteurs à titre d’exemple, la méthodologie générale peut être adaptée à d’autres espèces de virus et de transgènes. Le flux de travail présenté comprend la conception, clonage, sauvetage et la propagation des virus recombinants. Dosages pour analyser la cinétique de la réplication et l’activité lytique du vecteur, ainsi que des fonctionnalités de l’isolé immunomodulateur ex vivo sont inclus, ce qui facilite la génération de nouveaux agents de développement dans les modèles précliniques et finalement traduction clinique.

La figure 1 illustre le mécanisme d’action du virus de la rougeole oncolytiques encodage bispécifiques recruteurs de lymphocytes T. Un organigramme illustrant le flux de travail de ce protocole est présenté à la Figure 2. Figure 3 illustre un exemple d’un génome de virus de la rougeole oncolytiques modifiés. Cela fournit une représentation visuelle des changements spéci...

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Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Cette méthode peut aider à relever les principaux défis dans le domaine de l’immunothérapie du cancer en facilitant le développement de vecteurs oncolytiques pour une immunomodulation ciblée. Le principal avantage du système génétique inverse appliqué est sa polyvalence; par conséquent, les vecteurs peuvent être adaptés pour répondre à diverses questions de recherche et cibler les tumeurs avec diverses signatures immunitaires. Les étapes de propagation du virus, en particulier la détermination du point de temps optimal pour la récolte du virus sont difficiles à apprendre d’un protocole texte, car la formation de syncytie doit être évaluée visuellement au fil du temps.Pour commencer la conception et cloner des vecteurs immunomodulateurs recombinants tels que décrits dans le manuscrit. Ce protocole décrit des étapes spécifiques pour la mise au point d’un vecteur oncolytique du vaccin antirougeoleux, codant une cellule T bispécifique engagée. Pour sauver le virus de la rougeole de l’ADNC, 24 heures avant la plaque de transfection, les cellules productrices du virus de la rougeole se sont uniformément accumulées sur une plaque murale de 6.Graine 200 000 cellules en 2 millilitres DMEM contenant 10 pour cent de FBS par puits pour atteindre 65 à 75 pour cent de confluence au moment de la transfection. Mélanger 5 microgrammes d’ADN recombinant codant l’antigène du virus de la rougeole qui sera utilisé pour transfecter les cellules. Plasmides appropriés et un journaliste fluorescent dans un volume total de 200 microlitres de DMEM.Ajouter 18,6 microlitres de réhésif transfection liposomique au mélange et feuilleter immédiatement le tube pour mélanger. Incuber ce mélange de transfection pendant 25 minutes à température ambiante. Pour transfecter les cellules productrices de MV enlever le milieu de la plaque de puits 6 cultivés à 65 à 75 pour cent de confluence et ajouter 1,8 millilitres de DMEM avec 2 pour cent de FBS et 50 microgrammes par millilitre kanamycine par puits.Ajouter ensuite le mélange de transfection dropwise à chaque puits et tourbillonner soigneusement. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par 2 millilitres de DMEM frais par 2 % de FBS et 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et répétez-le lorsque le milieu devient acide reconnu par la couleur jaune.Utilisez un microscope pour observer les cellules quotidiennement pour l’expression des gènes des journalistes et la formation de syncytia. Lorsque de grandes syncytia composées de 20 cellules ou plus sont visibles ou lorsque les cellules deviennent trop denses, le virus. 24 heures avant la récolte prévue semences environ 1,5 millions de cellules productrices de MV dans 12 millilitres de DMEM avec 10 pour cent FBS sur des plats de 10 centimètres pour atteindre 65 à 75 pour cent de confluence au moment de l’inoculation du virus.Pour recueillir le virus progyny utiliser un grattoir cellulaire pour gratter soigneusement les cellules productrices adhérentes de la plaque murale 6 avec des cellules transfectées. Transférer le milieu contenant les cellules grattées dans un tube de centrifugeuse. Centrifugeuse pendant au moins 2500 fois G et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour enlever les débris cellulaires.Après centrifugation mélanger le supernatant sans cellules avec le milieu sans sérum à un volume final de 4 millilitres pour préparer l’inoculum. Retirer le milieu du plat de 10 centimètres avec les cellules productrices de MV et ajouter l’inoculum aux cellules. Incuber pendant au moins 2 heures à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone.Après incubation ajouter 6 millilitres de DMEM avec 10 pour cent FBS et incuber les cellules pendant la nuit. Remplacez ensuite le milieu par 12 millilitres de DMEM frais par 10 pour cent de FBS et couvez à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à la récolte. Observez les cellules au moins deux fois par jour.Avant l’éclatement de la syncytie lorsque la perturbation de la membrane devient visible, récoltez le virus. Pour récolter le premier passage enlever le supernatant de la plaque et ajouter 600 microlitres de sérum moyen libre. Ensuite, utilisez un élévateur cellulaire pour gratter les cellules et transférer dans un tube propre.Immédiatement après ce gel, la suspension du virus dans de l’azote liquide et conserver à 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures pour assurer un gel complet. Déterminer les titres des stocks de virus dans les octuplicates par aliquot à l’aide de 96 plaques murales. Tirez d’abord les cellules productrices des flacons de culture cellulaire T75 dans un tube conique de 50 millilitres.Comptez les cellules et ajustez la suspension cellulaire à 150 000 cellules par millilitre dans le DMEM avec 10% de FBS. Ajouter 90 microlitres de DMEM avec 10 pour cent de FBS par puits d’une plaque murale de 96. Ajouter ensuite 10 microlitres d’un aliquot du stock de virus aux 8 puits de la première colonne de la plaque.Bien mélanger en faisant monter et descendre au moins 10 fois. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 10 microlitres de chaque puits, de la première à la deuxième colonne, et bien mélanger en pipetting de haut en bas. Répétez cette demande pour chaque colonne afin d’obtenir des dilutions en série décuplées du virus à l’aide de pointes de pipette fraîches pour chaque étape de dilution.Jetez 10 microlitres de chaque puits de la dernière colonne. Ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire avec 150 000 cellules par millilitre à chaque puits en vous assurant qu’il n’y a pas de touffes cellulaires. Incuber à 37 degrés Celsius, 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant 48 heures.Vérifiez la syncytie à l’aide d’un microscope léger. Comptez la syncytie dans chaque puits de la colonne avec le facteur de dilution le plus élevé contenant la syncytie visible. Pour les virus codant un journaliste fluorescent, la syncytie peut être comptée à l’aide de microscopie par fluorescence.Pour l’analyse de la cinétique de réplication du virus de la rougeole un jour avant l’infection, 100 000 cellules vero dans 1 millilitre de DMEM avec 10% de FBS par puits sur 12 plaques murales avec au moins 2 puits pour chaque point d’intérêt. Pour infecter les cellules remplacer le milieu par 300 microlitres de milieu sans sérum contenant la quantité respective du virus. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins 2 heures.Retirer l’inoculum et ajouter 1 millilitre de DMEM avec 10 pour cent de FBS et poursuivre l’incubation. Aux moments pertinents après la récolte de l’infection progynie virale en raclant directement les cellules dans le milieu. Transférer le contenu de chaque puits vers un tube individuel.Casser le gel dans l’azote liquide et conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à titration, puis procéder comme décrit dans le manuscrit. Pour commencer l’évaluation de la cytotoxicité médiée par cellules induites par le BTE par libération de LDH, d’abord isoler les produits transgènes sécrétés exprimés par les cellules cibles infectées par le virus et isoler les cellules effectrices immunitaires comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, les cellules cibles des graines dans une plaque murale u-bottom 96 et comprennent des échantillons tels que décrits dans le manuscrit.Ajouter des immunomodulateurs précédemment isolés aux concentrations désirées aux échantillons respectifs. Ajouter les cellules transfuges immunitaires aux rapports désirés et ajouter du milieu à un volume total de 100 microlitres par puits. Incuber pour les délais précédemment déterminés à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone.45 minutes avant la collecte de l’échantillon ajouter 10 microlitres de 10X Lysis Solution aux puits contenant des échantillons de T max et les contrôles moyens correspondants et poursuivre l’incubation. Centrifuger les cellules à 250 fois G pendant 4 minutes. Transférer 50 microlitres de supernatant de chaque puits vers les puits d’une plaque murale à fond plat de 96 parois en s’assurant de ne pas transférer les cellules.Après avoir préparé la solution de substrat selon le fabricant ajouter 50 microlitres à chaque puits. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que les échantillons de T max deviennent rouges profonds. Après l’incubation ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits.Centrifugeuse pendant 1 minute à 4000 fois G, puis utiliser une aiguille creuse pour enlever les bulles d’air. Mesurer l’absorption optique à 490 nanomètres et calculer comme décrit dans le manuscrit. Après l’inoculation avec des virus oncolytiques non modifiés et BTE codant contre la rougeole, les courbes de croissance des vecteurs comparés sur les cellules vero semblent similaires.Les courbes de viabilité cellulaire sur les cellules mc38 murine de carcinome côlorectal exprimant habilement l’antigène carcinoembryonic humain et les récepteurs de MV CD46 après inoculation montrent que l’activité lytique du virus transgène d’encodage traîne derrière dans la ligne de cellule de tumeur murine. La cytométrie de flux de l’antigène cible exprimant des cellules incubées avec des BTE à cinq dilutions différentes a montré la liaison de BTE par des cellules d’une manière dépendante de concentration. Dans l’immunoblot après retrait magnétique des cellules associées de BTE a prouvé que quand bte non-ciblage ont été utilisés il n’y avait aucune quantité détectable des cellules ;alors que lors du ciblage des échantillons de BTE ont été utilisés cellules liées étaient présents dans la fraction d’élitution.BTE médiation antigène cible spécifique et la concentration dépendante cytotoxicité des cellules T murines est indiqué par l’essai représentatif de libération LDH et montre que dans le présent exemple 15 pour cent de tuer cellulaire spécifique a été atteint à une concentration relativement élevée de BTE de 1 microgramme par millilitre par rapport aux cellules de référence. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller régulièrement les cellules pour vérifier la progression de l’infection. N’oubliez pas que les souches recombinantes du vaccin contre la rougeole, bien qu’atténuées, peuvent être dangereuses, en particulier pour les personnes immunodéprimées.Évitez l’exposition en suivant les procédures de biosécurité appropriées. Les personnes qui manipulent des virus devraient être vaccinées avant d’effectuer ces méthodes. Suite à cette procédure, l’expression virale d’autres transgènes peut être réalisée afin d’analyser les interactions des hôtes de virus et les effets thérapeutiques.Le développement de ces techniques a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biothérapie pour explorer les effets des immunomodulateurs exprimés localement dans de nombreuses entités tumorales;In Vitro, In Vivo, et aussi dans les essais cliniques.

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