Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Diese Methoden wurden in der Virotherapie Gruppe unter der Leitung von Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts im nationalen Zentrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg gegründet. Wir sind verpflichtet, ihm und allen Mitgliedern des Labor-Teams, vor allem Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler und Jessica Albert. Diese Arbeit wurde von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung unterstützt (Grant 2015_A78, C.E. Engeland) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, C.E. Engeland EN 1119/2-1 gewähren). J.P.W. Heidbuechel erhält ein Stipendium in Höhe von Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Hinweis: [O], [P] und [M] Unterabschnitte für anzugeben: OVs im Allgemeinen, (die meisten) Paramyxoviruses oder MV nur, beziehungsweise. [B] zeigt Abschnitte speziell für BTE transgene.
1 Klonen von transgenen Immunmodulator Codierung in Masern-Virus-Vektoren
<ol><li>
[O] Design einfügen Sequenz.
	<ol>
<li>[O] entscheiden Sie sich für ein Immunmodulator Interesse basierend auf Literaturrecherchen oder explorative Daten wie genetische Bildschirme<sup clas...

Onkolytische Immuntherapie (dh., OVT in Kombination mit Immunmodulation) hält große Verheißung für die Krebsbehandlung, anspruchsvolle weitere Entwicklung und Optimierung von onkolytische Viren immunmodulatorische Proteine codieren. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum generieren und validieren diese Vektoren für die spätere Prüfung in relevanten präklinischen Modellen und potenzielle zukünftige klinische Übersetzung in neuer Anti-Krebs-Therapeutika.
Zahlreiche verschied...

Onkolytische Viren (OVs) entstehen als Anti-Krebs-Therapeutika, die speziell in replizieren und Tumorzellen zu töten, wobei gesundes Gewebe intakt bleibt. Es ist mittlerweile gemeinsamen Verständnis, dass onkolytische Virotherapie (OVT), in den meisten Fällen, verlässt sich nicht allein auf komplette Tumor-lyse durch effiziente Replikation und die Verbreitung des Virus, aber erfordert zusätzlichen Wirkmechanismen Behandlungserfolg, einschließlich vaskuläre und Stromazellen targeting und allem Immunstimulation1,2,3,4. Während viele OV Frühstudium unveränderte Viren verwendet, hat aktueller Forschung profitiert eine verbesserte biologische Verständnis, Virus Biobanken, die potenziell Roman OVs und die Möglichkeiten der Gentechnik um erweiterte OV schaffen enthalten Plattformen5,6,7.
Angesichts der jüngsten Erfolge der Immuntherapie, sind immunmodulatorische transgene von besonderem Interesse bezüglich der Gentechnik OVs. Gezielte Ausdruck solcher gen-Produkte von OV-infizierte Tumorzellen reduziert die Toxizität im Vergleich zu systemischen Verabreichung. Targeting wird mithilfe von Viren mit inhärenten Oncoselectivity oder durch Ändern der viralen Tropismus8erreicht. Lokalen Immunmodulation verbessert die facettenreichen anti-Tumor-Mechanismen der OVT. Darüber hinaus ist diese Strategie maßgeblich daran beteiligt das Zusammenspiel zwischen Viren, Tumorzellen und dem Immunsystem des Wirts zu verhören. Dieses Protokoll sieht zu diesem Zweck einen anwendbar und einstellbaren Workflow zu gestalten, Klonen, zu retten, zu propagieren und validieren onkolytische Paramyxovirus (speziell Masernvirus) Vektoren Codierung solche transgene.
Modulation der Immunantwort kann durch eine Vielzahl von Transgen-Produkten, die auf verschiedenen Stufen der Krebs-Immunität Zyklus9, einschließlich der Verbesserung der Tumor Antigen Anerkennung [z. B. Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) oder Induktoren der erreicht werden großen Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle] über Unterstützung von dendritischen Zellen Reifung für effizienten Antigenpräsentation (Zytokine); Rekrutierung und Aktivierung gewünschte Immunzellen wie zytotoxische und T-Helfer-Zellen [Chemokine, bispezifische T Zelle Engagers (HdOs)]; Ausrichtung auf unterdrückerische Zellen wie regulatorische T-Zellen, myeloische abgeleitet Suppressor-Zellen und Tumor-assoziierten Makrophagen Krebs-assoziierten Fibroblasten (Antikörper, BTEs, Zytokine); und Vermeidung von Effektor Zellen Hemmung und Erschöpfung (Checkpoint-Hemmer). So gibt es eine Fülle von biologischen Arbeitsstoffen. Bewertung von solchen Virus-codierte Immunmodulatoren zur therapeutischen Wirksamkeit und mögliche Synergien sowie Verständnis der jeweiligen Mechanismen ist notwendig, Verbesserung der Krebstherapie.
Negativen Sinne einzelsträngigen RNA-Viren der Familie Paramyxoviridae zeichnen sich durch mehrere Merkmale förderlich für ihre Verwendung als onkolytische Vektoren. Dazu gehören ein natürliches Oncotropism, große genomische Kapazität für transgene (mehr als 5 kb)10,11, effiziente Verbreitung einschließlich Syncytia Bildung und hohe Immunogenität12. Daher OV-Plattformen basierend auf Hundestaupe Virus13, Mumps-Virus14, Newcastle Disease Virus15, Sendai-Virus16,17, simian Virus 518und Modellorganismus Paramyxovirus19 entstanden sind. Vor allem live abgeschwächten Masern-Virus-Impfstoff, die Stämme (MV) in präklinischen und klinischen Entwicklung20,21vorangekommen sind. Diese Virusstämme wurden jahrzehntelang für Routineimpfungen mit einen ausgezeichneten Sicherheit Aufzeichnung22verwendet. Darüber hinaus gibt es kein Risiko für insertional Mutagenese durch die streng cytosolischen Replikation von Paramyxoviruses. Ein vielseitiges reverse Genetik-System basierend auf Anti-genomische cDNA ermöglicht eine Einfügung von transgenen in zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs) ist verfügbar11,23,24. MV-Vektoren Codierung Natrium-Iodid-Symporter (MV-NIS) für Bildgebung und Strahlentherapie oder lösliche carcinoembryonales Antigen (MV-CEA) als ein Surrogat-Marker für virale Genexpression werden derzeit in klinischen Studien (NCT02962167, NCT02068794, geprüft NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 und NCT00408590). Sichere Verwaltung bestätigt wurde und der Anti-Tumor-Wirkung wurden Fälle in früheren Studien25,26,27,28,29, 30 (rezensiert von Msaouel et al.31), ebnet den Weg für zusätzliche onkolytische Masern-Viren, die entwickelt wurden und preclinically getestet. MV Codierung immunmodulatorische, die Moleküle gezielt verschiedene Schritte des Krebs-Immunität Zyklus gezeigt worden, um Tumorwachstum verzögern und/oder verlängert Überleben bei Mäusen, mit Nachweis für immun-vermittelte Wirksamkeit und schützende immun Langzeitgedächtnis im Phänomen Maus-Modellen. Vektor-codierte transgene gehören Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF)32,33, H. Pylori Neutrophilen-aktivierende Protein34, immun Checkpoint-Hemmer35 Interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37und BTEs38, die ein Tumor Oberflächenantigen mit CD3 zu vernetzen und so induzieren anti-Tumor-Aktivität von polyklonalen T-Zellen, unabhängig von der T-Zell-Rezeptor Spezifität und Co-Stimulation ( ( Abbildung 1). Die vielversprechende präklinische Ergebnisse für diese Konstrukte weitere translational Anstrengungen bedarf.
Talimogene Laherparepvec (T-VEC), eine Art ich Codierung GM-CSF, Herpes-Simplex-Virus ist die einzige onkolytische therapeutische genehmigt durch die United States Food und Drug Administration (FDA) und European Medicines Agency (EMA). Die Phase-III-Studie führt zu Genehmigungen Ende 2015 hat nicht nur Wirksamkeit auf dem Gelände des Intra-Tumor Injektion, aber auch Abscopal Effekte (z.B. Remissionen nicht injiziert Läsionen) in fortgeschrittenem Melanom39gezeigt. T-VEC getreten da zusätzliche Prüfungen für die Anwendung in anderen Tumorentitäten (z.B., nicht-Melanom-Hautkrebs, NCT03458117, Bauchspeicheldrüsenkrebs, NCT03086642) sowie eine Bewertung der Kombinationstherapien, vor allem mit immun-checkpoint Inhibitoren (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 und Ribas et al.40).
Dies zeigt nicht nur das Potential der onkolytische Immuntherapie, sondern auch die weiteren Forschungsbedarf, hervorragende Kombinationen von OVT und Immunmodulation zu identifizieren. Rationales Design von zusätzlichen Vektoren und ihre Entwicklung zur präklinischen Prüfung ist der Schlüssel zu diesem Unternehmen. Dies wird auch Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen voraus und hat Auswirkungen auf die Entwicklung hin zu stärker personalisierten Krebstherapie. Zu diesem Zweck präsentiert dieser Publikation die Methodik für die Modifikation und Entwicklung von Paramyxoviruses für gezielte Krebsimmuntherapie und genauer gesagt, der onkolytische Masern-Viren Codierung T-Zell-Gewinnung Antikörper (Abbildung 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Erfolgreich den Krebs-Immuntherapie hat das Potenzial, langfristige Tumorkontrolle zu erreichen. Trotz der jüngsten klinischen Erfolge bleibt ein dringender Bedarf an sicheren und wirksamen Therapien auf individuellen Tumor immun Profile zugeschnitten. Onkolytische Viren ermöglichen die Induktion von Anti-Tumor-Immunantwort sowie Tumor beschränkt Genexpression. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Ex Vivo-Analyse der immunmodulatorische onkolytische Vektoren. Fokussierung auf Masern-Impfstoff Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel, kann die allgemeine Methodik zu anderen Virus-Arten und transgene angepasst werden. Die dargestellte Workflow umfasst Design, Klonen, Rettung und Verbreitung von rekombinanten Viren. Assays zur Replikation Kinetik und lytische Aktivität des Vektors sowie Funktionalität des isolierten Immunmodulator ex Vivo Analyse enthalten sind, und erleichtert so die Generation der neuen Agenten für die weitere Entwicklung in präklinischen Modellen und letztlich klinische Übersetzung.

Abbildung 1 zeigt den Wirkmechanismus von onkolytische Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers. Ein Flussdiagramm Darstellung des Workflows dieses Protokolls wird in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines modifizierten onkolytische Masern-Virus Genoms. Dies bietet eine visuelle Darstellung der spezifischen Änderungen auf die Masern Virus Anti-Gen...

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Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Diese Methode kann dazu beitragen, die wichtigsten Herausforderungen im Bereich der Krebsimmuntherapie zu bewältigen, indem sie die Entwicklung von onkolyktischen Vektoren für eine gezielte Immunmodulation erleichtert. Der Hauptvorteil des angewandten Reverse-Gensystems ist seine Vielseitigkeit; daher können Vektoren angepasst werden, um verschiedene Forschungsfragen zu adressieren und Tumoren mit unterschiedlichen Immunsignaturen anzusprechen. Die Virusausbreitungsschritte, insbesondere die Bestimmung des optimalen Zeitpunkts für die Ernte des Virus, sind von einem Textprotokoll schwer zu lernen, da die Synzytätsbildung im Laufe der Zeit visuell beurteilt werden muss.Um mit dem Entwurf und klonen von rekombinanten immunmodulatorischen Vektoren zu beginnen, wie im Manuskript beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt spezifische Schritte zur Entwicklung eines onkolytischen Masern-Impfstoffvektors, der einen bispezifischen T-Zell-Engager kodiert. Um das Masernvirus aus der cDNA zu retten, 24 Stunden vor der Transfektionsplatte produzieren Masernvirus-Produzentenzellen gleichmäßig auf einer 6-Wand-Platte.Samen 200. 000 Zellen in 2 Milliliter DMEM, die 10 Prozent FBS pro Brunnen enthalten, um 65 bis 75 Prozent Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Mischen Sie 5 Mikrogramm rekombinanter DNA, die das Masernvirus-Antigenom kodiert, das zur Transfektion der Zellen verwendet wird. Geeignete Plasmide und ein fluoreszierender Reporter in einem Gesamtvolumen von 200 Mikroliter DMEM.Fügen Sie 18,6 Mikroliter liposomaler Transfektionsreagenz in die Mischung ein und streichen Sie sofort das Rohr zum Mischen. Inkubieren Sie diese Transfektionsmischung für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Um die MV-Produzentenzellen zu transfekten, entfernen Sie das Medium aus der 6 Well-Platte, die auf 65 bis 75 Prozent Konfluenz gewachsen ist, und fügen Sie 1,8 Milliliter DMEM mit 2 Prozent FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin pro Brunnen hinzu.Dann fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise zu jedem Brunnen hinzu und wirbeln Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 2 Milliliter frisches DMEM mit 2 Prozent FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und wiederholen Sie dies, wenn Medium sauer wird, das von der gelben Farbe erkannt wird.Verwenden Sie ein Mikroskop, um Zellen täglich für die Reporter-Genexpression und Synzytia-Bildung zu beobachten. Wenn große Synzytia, bestehend aus 20 oder mehr Zellen, sichtbar sind oder wenn Zellen zu dicht werden, ernten sie das Virus. 24 Stunden vor dem erwarteten Erntesaatgut etwa 1,5 Millionen MV-Erzeugerzellen in 12 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS auf 10-Zentimeter-Schalen, um 65 bis 75 Prozent Konfluenz zum Zeitpunkt der Virusimpfung zu erreichen.Um das Virus zu sammeln, verwenden Sie einen Zellschaber, um anhaftende Erzeugerzellen vorsichtig von der 6-Wandplatte mit transfizierten Zellen zu kratzen. Übertragen Sie das Medium, das die abgekratzten Zellen enthält, in ein Zentrifugenrohr. Zentrifuge für mindestens 2500 mal G und 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um Zellablagerungen zu entfernen.Nach der Zentrifugation den zellfreien Überstand mit serumfreiem Medium auf ein Endvolumen von 4 Millilitern mischen, um Inokulum zuzubereiten. Entfernen Sie das Medium aus der 10-Zentimeter-Schale mit MV-Produzentenzellen und fügen Sie das Inokulum zu den Zellen hinzu. Mindestens 2 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid inkubieren.Nach der Inkubation 6 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS hinzufügen und Zellen über Nacht inkubieren. Dann ersetzen Sie das Medium durch 12 Milliliter frischedmEM mit 10 Prozent FBS und brüten bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid bis zur Ernte. Beobachten Sie die Zellen mindestens zweimal täglich.Bevor Die Synzytia platzen, wenn Membranstörungen sichtbar werden, ernten sie das Virus. Um den ersten Durchgang zu ernten, entfernen Sie den Überstand von der Platte und fügen Sie 600 Mikroliter Serumfreies Medium hinzu. Verwenden Sie dann einen Zellheber, um die Zellen zu kratzen und in ein sauberes Rohr zu übertragen.Unmittelbar danach die Virussuspension in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei 80 Grad Celsius mindestens 24 Stunden aufbewahren, um ein gründliches Einfrieren zu gewährleisten. Bestimmung von Titstern von Virusbeständen in Octuplicaten pro Aliquot mit 96 Wandplatten. Ziehen Sie zunächst die Erzeugerzellen aus T75-Zellkulturkolben in 50 Milliliter konische Röhre.Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf 150 000 Zellen pro Milliliter in DMEM mit 10 Prozent FBS an. Fügen Sie 90 Mikroliter DMEM mit 10 Prozent FBS pro Brunnen einer 96 Wandplatte hinzu. Dann fügen Sie 10 Mikroliter aus einem Aliquot des Virusbestands zu allen 8 Brunnen in der ersten Spalte der Platte hinzu.Mischen Sie gründlich durch Pipettierung nach oben und unten mindestens 10 Mal. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter jedes Brunnens von der ersten bis zur zweiten Säule zu übertragen und gründlich zu mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie dies für jede Spalte, um serielle zehnfache Verdünnungen des Virus mit frischen Pipettenspitzen für jeden Verdünnungsschritt zu erhalten.Entsorgen Sie 10 Mikroliter aus jedem Brunnen der letzten Säule. Fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension mit 150.000 Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu, um sicherzustellen, dass es keine Zellklumpen gibt. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5 Prozent Kohlendioxid für 48 Stunden.Prüfen Sie die Synchronisierung mit einem Lichtmikroskop. Zählen Sie die Syncytia in jedem Brunnen der Spalte mit dem höchsten Verdünnungsfaktor, der sichtbare Synzytia enthält. Bei Viren, die einen fluoreszierenden Reporter kodieren, kann Die Synzytia mittels Fluoreszenzmikroskopie gezählt werden.Zur Analyse der Masernvirusreplikation kinetik einen Tag vor der Infektion Samen 100, 000 Vero-Zellen in 1 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS pro Brunnen auf 12 Wandplatten mit mindestens 2 Brunnen für jeden Zeitpunkt von Interesse. Um die Zellen zu infizieren, ersetzen Sie das Medium durch 300 Mikroliter Serumfreies Medium, das die jeweilige Menge des Virus enthält. Bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid für mindestens 2 Stunden inkubieren.Entfernen Sie Inoculum und fügen Sie 1 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS hinzu und setzen Sie die Inkubation fort. An relevanten Zeitpunkten nach der Infektion ernten virale Wahrscheinlichkeit durch direktes Abkratzen von Zellen in das Medium. Übertragen Sie den Inhalt von jedem Brunnen auf eine einzelne Röhre.Fangen Sie in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie bei 80 Grad Celsius bis zur Titration und gehen Sie dann wie im Manuskript beschrieben vor. Um mit der Bewertung der bTE-induzierten zellvermittelten Zytotoxizität durch LDH-Freisetzung zu beginnen, isolieren Sie zunächst sezernierte Transgenprodukte, die von virusinfizierten Zielzellen exprimiert werden, und isolieren Immuneffektorzellen, wie im Manuskript beschrieben. Dann Samen Zielzellen in einer U-boden 96 Wandplatte und enthalten Proben, wie im Manuskript beschrieben.Fügen Sie den jeweiligen Proben zuvor isolierte Immunmodulatoren in gewünschten Konzentrationen hinzu. Fügen Sie Immundefektzellen in den gewünschten Verhältnissen hinzu und fügen Sie mittlere zu einem Gesamtvolumen von 100 Mikroliterpro-Brunnen hinzu. Inkubieren Sie für die gewünschten zuvor festgelegten Zeitrahmen bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid.45 Minuten vor der Probenentnahme 10 Mikroliter 10-fache Lysislösung zu Brunnen hinzufügen, die T max Proben und die entsprechenden Medium-Kontrollen enthalten, und die Inkubation fortsetzen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal G für 4 Minuten. Übertragen Sie 50 Mikroliter Überstand von jedem Brunnen auf die Brunnen einer flachen unteren 96 Wandplatte, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht übertragen werden.Nach der Herstellung der Substratlösung nach dem Hersteller fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen. Inkubieren Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten oder bis T max Proben tiefrot werden. Nach der Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen.Zentrifuge für 1 Minute bei 4000 mal G und dann mit einer ausgehöhlten Nadel Luftblasen zu entfernen. Messen Sie die optische Absorption mit 490 Nanometern und berechnen Sie, wie im Manuskript beschrieben. Nach der Impfung mit unveränderter und BTE-kodierender onkolytischer Masernviren erscheinen die Wachstumskurven der verglichenen Vektoren auf Vero-Zellen ähnlich.Zelllebensfähigkeitskurven auf mc38 murinen kochromalen Karzinomzellen, die das humane karzinoembryonale Antigen stabil exezieren, und die MV-Rezeptoren CD46 nach der Impfung zeigen, dass die lytische Aktivität des transgenen kodierenden Virus in der murinen Tumorzelllinie zurückbleibt. Die Durchflusszytometrie von Zielantigen-exemittierenden Zellen, die mit BTE es bei fünf verschiedenen Verdünnungen inkubiert wurden, zeigte bTE-Bindung durch Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise. In Immunoblot nach magnetischem Pulldown von BTE-assoziierten Zellen zeigte sich, dass bei Nicht-Targeting-BTE keine nachweisbaren Mengen von Zellen vorhanden waren;während bei der Ausrichtung von BTE-Proben gebundene Zellen in der Elutionsfraktion vorhanden waren.BTE vermittelte Zielantigen spezifische und konzentrationsabhängige Zytotoxizität von murinen T-Zellen wird durch repräsentativen LDH-Freisetzungstest angezeigt und zeigt, dass im vorliegenden Beispiel 15 Prozent spezifische Zelltötung bei einer relativ hohen BTE-Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zu Referenzzellen erreicht wurde. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, regelmäßig Zellen zu überwachen, um das Fortschreiten der Infektion zu überprüfen. Vergessen Sie nicht, dass rekombinante Masern-Impfstoffstämme, obwohl abgeschwächt, besonders für immununterdrückte Personen gefährlich sein können.Vermeiden Sie die Exposition, indem Sie die entsprechenden Biosicherheitsverfahren befolgen. Personen, die mit Viren umgehen, sollten vor der Durchführung dieser Methoden geimpft werden. Nach diesem Verfahren kann eine virale Expression weiterer Transgene erreicht werden, um Virus-Wirte-Wechselwirkungen und therapeutische Effekte zu analysieren.Die Entwicklung dieser Techniken hat den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biotherapie geebnet, um die Auswirkungen lokal exprimierter Immunmodulatoren in zahlreichen Tumorentitäten zu erforschen;In Vitro, In Vivo, und auch in klinischen Studien.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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