Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

שיטות אלה הוקמו בקבוצה Virotherapy בראשות פרופסור ד ר ד ר גיא Ungerechts במרכז הלאומי למחלות הגידול בהיידלברג. . אנחנו חבים לו ואת כל חברי צוות מעבדה, במיוחד ד ר טוביאס שפק, ד ר Rūta Veinalde, ג'ודית פורסטר, בירגיט Hoyler ו ג'סיקה אלברט. עבודה זו נתמכה על ידי עוד Kröner-Fresenius-Stiftung (גרנט 2015_A78 כדי Engeland לספירה) של קרן המדע הלאומית הגרמנית (DFG, להעניק EN 1119/2-1 לספירה Engeland). J.P.W. Heidbuechel מקבל מלגה על ידי הלמהולץ הבינלאומי המדרשה לחקר הסרטן.

הערה: [O], [P], ו [ז] להצביע על סעיפים קטנים החלים: OVs הכללי, paramyxoviruses (רוב) או MV בלבד, בהתאמה. [B] מציין סעיפים ספציפיים עבור BTE transgenes.
1 שכפול של קידוד Immunomodulator Transgenes לתוך וקטורים וירוס חצבת
<ol><li>
[O] עיצוב הכנס רצף.
	<ol>
<li>[O] להחליט על immunomodulator עניין מבוסס על ספרות מחקר ?...

Oncolytic חיסוני (כלומר., שעות נוספות בשילוב עם immunomodulation) טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפול בסרטן, בדרישה נוספת פיתוח ואופטימיזציה של וירוסים oncolytic קידוד חלבונים immunomodulatory. פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי ליצור ולאמת כזה וקטורים עבור בדיקות עוקבות הרלוונטיים במודלים פרה, תרגום קליניים עתידיים פוטנ...

Oncolytic וירוסים (OVs) מפותחים כמו הרפוי אנטי סרטניים, במיוחד לשכפל בתוך ולהרוג תאים סרטניים תוך השארת רקמות בריאה ללא פגע. זה הפך נפוץ להבין את virotherapy oncolytic (ש'), ברוב המקרים, לא להסתמך רק על פירוק הגידול מלאה על-ידי שכפול יעיל והפצת של הוירוס, אבל דורש מנגנון פעולה נוספים להצלחה בטיפול, כולל כלי הדם, סטרומה מיקוד ומעל הכל גירוי המערכת החיסונית1,2,3,4. בעוד מחקרים רבים OV מוקדם בשימוש וירוסים שלא שונתה, המחקר הנוכחי יש שהרוויח ביולוגית משופרת הבנה, וירוס biobanks המכילים פוטנציאל הרומן OVs, ואת האפשרויות המוצעות על ידי הנדסה גנטית על מנת ליצור OV מתקדם פלטפורמות5,6,7.
לאור ההצלחה האחרונה של חיסוני, immunomodulatory transgenes הם עניין מיוחד בנושא הנדסה גנטית של OVs. ביטוי יישוב של המוצרים בהם הגן על-ידי תאי הגידול הנגועים OV מפחית רעילות לעומת ניהול מערכתי. פילוח מושגת באמצעות וירוסים עם oncoselectivity הגלום או על-ידי שינוי נגיפי tropism8. Immunomodulation המקומיות משפר את מנגנוני אנטי הגידול ומגובש של עבודה בשעות נוספות. יתר על כן, אסטרטגיה זו הוא אינסטרומנטלי חוקר את יחסי הגומלין בין וירוסים, תאים סרטניים את מערכת החיסון של הפונדקאי. לשם כך, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה ישימים, הניתנים לשינוי עיצוב, שיבוט, להציל, להפיץ של אמת oncolytic paramyxovirus (במיוחד וירוס חצבת) וקטורים קידוד כזה transgenes.
אפנון של התגובה החיסונית יכולה להיות מושגת על ידי מגוון רחב של מוצרים transgene מיקוד שלבים שונים של סרטן-חסינות מחזור9, כולל שיפור זיהוי אנטיגן הגידול [למשל, אנטיגנים סרטניים הקשורים (תעש) או inducers של מרכזי histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות] מעל תמיכה תא דנדריטי ההבשלה למצגת יעילה אנטיגן (ציטוקינים); גיוס והפעלת תאים חיסוניים הרצוי כגון ציטוטוקסיות helper T תאי [נוגדנים, bispecific תא T engagers (BTEs)]; פילוח מדכא תאים כגון בתאי T רגולטוריים, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול, מקרופאגים סרטניים הקשורים לסרטן-הקשורים fibroblasts (נוגדנים, BTEs, ציטוקינים); ומניעת עיכוב תא אפקטור ותשישות (מעכבי המחסום). לפיכך, שפע של גורמים ביולוגיים זמין. הערכה של כזה immunomodulators מקודד וירוס לגבי היעילות הטיפולית ואת הסינרגיה אפשרי, כמו גם ההבנה של מנגנונים בהתאמה יש צורך לשפר טיפול בסרטן.
וירוסי RNA חד-גדילי תחושה שלילית של משפחת Paramyxoviridae מאופיינים על ידי תורמת את השימוש בהם מספר תכונות כמו oncolytic וקטורים. אלה כוללים oncotropism טבעי, קיבולת גנומית transgenes (יותר מ 5 kb)10,11, היעילה מתפשט כולל היווצרות syncytia ו- immunogenicity גבוהה12. לכן, פלטפורמות OV בהתבסס על וירוס כלבלבת13, וירוס חזרת14, וירוס מחלת ניוקאסל15,16,סנדאי וירוס17, וירוס קופיים 518, Tupaia paramyxovirus19 פותחו. בולטת, חיים חיסון וירוס חצבת הקלוש זנים (MV) התקדמו קליניות פיתוח20,21. זני וירוס אלה שימשו במשך עשרות שנים עבור חיסונים שגרתיים עם שיא בטיחות מעולה22. יתר על כן, אין שום סיכון עבור insertional מוטגנזה מכוונת בשל השכפול בקפדנות cytosolic של paramyxoviruses. מערכת רב תכליתי גנטיקה הפוכה המבוססת על אנטי-גנומית cDNA המאפשר החדרת transgenes ליחידות שעתוק נוספים (ATUs) הוא זמין11,23,24. וקטורים MV קידוד symporter סודיום יודיד (MV-ש"ח) לדימות, הקרנות או אנטיגן carcinoembryonic מסיסים (MV-CEA) כסמן הפונדקאית על ביטוי גנים ויראליים הם שמחושב כעת בניסויים קליניים (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ו- NCT00408590). ניהול בטוח אושרה, דווח על מקרים של יעילות אנטי הגידול הקודם מחקרים25,26,27,28,29, 30 (נבדקה על ידי Msaouel et al.31), לסלול את הדרך עבור וירוסים חצבת oncolytic נוספים יש פותחה, נבדק preclinically. MV קידוד immunomodulatory מולקולות מיקוד שלבים מגוונים של מחזור סרטן-חסינות הוכחו לעכב צמיחת הגידול ו/או להאריך את הישרדות בעכברים, עם הוכחה יעילות החיסון בתיווך, זיכרון לטווח ארוך של מערכת החיסון מגן ב- syngeneic מודלים העכבר. מקודד וקטור transgenes כוללים המושבה גרנולוציט-מקרופאג מגרה פקטור (GM-CSF)32,33, חלבון מפעיל נויטרופילים של ה פילורי 34, מעכבי המערכת החיסונית מחסום35, אינטרלוקין-12 (IL-12)36תעש37, BTEs38, אשר קשר צולב אנטיגן פני שטח הגידול עם CD3, ובכך לעודד פעילות אנטי הגידול על-ידי תאי T polyclonal, ללא קשר (ירידה לפרטים וגירוי שיתוף של קולטן תא T איור 1). תוצאות פרה מבטיח שהושג בונה דרישה נוספת translational למאמצים אלו.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), סוג אני וירוס הרפס סימפלקס קידוד GM-CSF, הוא oncolytic היחידה הטיפולית אושרה על ידי ארצות הברית מזון, והתרופות האמריקני (FDA) סוכנות התרופות האירופית (EMA). שלב המחקר השלישי המוביל אישורי בשנת 2015 מאוחר לא רק הראו יעילות באתר של הזרקת אינטרה-tumoral, אלא גם השפעות abscopal (קרי, הפוגות של נגעים ללא הזרקת) במלנומה מתקדמת39. T-VEC מאז נכנסה ניסויים נוספים עבור יישומים אחרים הישויות הגידול (למשל סרטן עור שאינו מלנומה, , NCT03458117; סרטן הלבלב, NCT03086642), הערכה של טיפולים משולבים, במיוחד עם מחסום המערכת החיסונית מעכבי (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ו Ribas et al.40).
זה מדגים לא רק את הפוטנציאל של חיסוני oncolytic, אלא גם את הצורך בהמשך מחקר לזיהוי סופריור שילובים של תעריף שעות נוספות, immunomodulation. עיצוב רציונלית של וקטורים נוספים ופיתוח שלהם לבדיקה פרה הוא המפתח במשימה. זה גם לקדם את ההבנה של מנגנונים הבסיסית, יש השלכות על ההתקדמות לקראת טיפול בסרטן אישית יותר. לשם כך, פרסום זה מציג את המתודולוגיה שינוי ופיתוח של paramyxoviruses על חיסוני סרטן ממוקד, ליתר דיוק, של וירוסי חצבת oncolytic קידוד נוגדנים מפעיל את תא T (איור 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

חיסוני סרטן מוצלח יש פוטנציאל להשגת שליטה הגידול לטווח ארוך. למרות ההצלחות האחרונות קליני, נותר צורך דחוף טיפולים יעילה ובטוחה המותאמים פרופילים המערכת החיסונית גידול בודדים. וירוסים Oncolytic לאפשר את תנאי הגיוס של תגובות חיסוניות אנטי הגידול, כמו גם ביטוי גנים בעל הגבלת הגידול. פרוטוקול זה מתאר את דור לשעבר vivo וניתוח של וקטורים oncolytic immunomodulatory. התמקדות וירוסים החיסון נגד חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה, המתודולוגיה הכללית ניתן להתאים וירוס מינים אחרים, transgenes. זרימת העבודה הציג כוללת של עיצוב, שיבוט, הצלה, הפצת וירוסים רקומביננטי. מבחני לנתח שכפול קינטיקה, פעילות lytic של וקטור הפונקציונליות של immunomodulator מבודדים ex-vivo כלולים, ובכך להקל על הדור של סוכנים הרומן להמשך פיתוח במודלים פרה, ובסופו של דבר תרגום רפואי.

איור 1 מדגימה את מנגנון הפעולה של וירוסי חצבת oncolytic קידוד bispecific תא T engagers. תרשים זרימה המתאר את זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור2. איור 3 מראה דוגמה של גנום הוירוס חצבת oncolytic שונה. זה מספק ייצוג חזותי של השינוי?...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

שיטה זו יכולה לעזור להתמודד עם אתגרים מרכזיים בתחום האימונותרפיה של סרטן על ידי הקלת הפיתוח של וקטורים אונקולקטיים עבור אימונומודולציה ממוקדת. היתרון העיקרי של המערכת הגנטית ההפוך המיושמת הוא הרבגוניות שלה;לכן, וקטורים יכולים להיות מותאמים כדי לענות על שאלות מחקר שונות ולמקד גידולים עם חתימות חיסוניות מגוונות. צעדי התפשטות וירוס במיוחד קביעת נקודת הזמן האופטימלית וירוס קציר קשה ללמוד מפרוטוקול טקסט כי היווצרות syncytia יש להעריך חזותית לאורך זמן.להתחיל לעצב ולשכפל וקטורים אימונומודולטוריים רקומביננטיים כמתואר בכתב היד. פרוטוקול זה מתאר צעדים ספציפיים לפיתוח וקטור חיסון נגד חצבת אונקוליטי, קידוד מעורב תא T ביספקיפי. כדי להציל את נגיף החצבת מ- cDNA, 24 שעות לפני צלחת transfection נגיף חצבת יצרנית תאים באופן שווה על צלחת קיר 6.זרעים 200, 000 תאים ב 2 מיליליטר DMEM המכיל 10 אחוז FBS לגם כדי להשיג 65 עד 75 אחוזים confluency בזמן transfection. מערבבים 5 מיקרוגרם של DNA רקומביננטי קידוד אנטיגנום וירוס חצבת שישמש כדי לשנות את התאים. פלסמידים מתאימים וכתב פלואורסצנטי בנפח כולל של 200 מיקרוליטרים של DMEM.מוסיפים לתערובת 18.6 מיקרוליטרים של רגנט טרנספיצימאלי ליפוזומלי ומיד מצליפים בצינור כדי לערבב. דגירה זו תערובת transfection במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשנות את התאים המפיק MV להסיר את המדיום מ 6 צלחת גם גדל 65 כדי 75 אחוז confluency ולהוסיף 1.8 מיליליטר של DMEM עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר Kanamycin ל באר.לאחר מכן מוסיפים את תערובת ההטרמפים כלפי ים לכל באר ומסתחררים בזהירות. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני. למחרת להחליף את המדיום עם 2 מיליליטר של DMEM טרי עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם למיליליטר Kanamycin ולחזור על זה כאשר המדיום הופך חומצי מוכר על ידי הצבע הצהוב.השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בתאים מדי יום עבור ביטוי גנים כתב היווצרות סינקטיה. כאשר סינפיציה גדולה המורכבת מ -20 תאים או יותר גלויים או כאשר תאים הופכים צפופים מדי לקצור את הנגיף. 24 שעות לפני זרעי הקציר הצפויים כ 1.5 מיליון תאי מפיק MV ב 12 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS על מנות 10 ס"מ כדי להשיג 65 עד 75 אחוז קליטה בזמן חיסון וירוס.כדי לאסוף את פרוגיוני וירוס להשתמש מגרד תאים כדי לגרד בזהירות תאים המפיק חסיד מ 6 לוח הקיר עם תאים מדבקים. מעבירים את המדיום המכיל את התאים השריטים לתוך צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה לפחות 2500 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת התא.לאחר צנטריפוגה מערבבים את העל-טבעי נטול התאים עם מדיום נטול סרום לנפח סופי של 4 מיליליטר להכנת אינקולום. מוציאים את המדיום מהצלחת של 10 ס"מ עם תאי מפיק MV ומוסיפים את ה- inoculum לתאים. דגירה לפחות 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה להוסיף 6 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ותאי דגירה לילה. לאחר מכן החלף את המדיום עם 12 מיליליטר של DMEM טרי עם 10 אחוז FBS ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני עד הקציר. שימו לב לתאים לפחות פעמיים ביום.לפני סינקטיה פרץ כאשר הפרעה קרום להיות גלוי לקצור את הנגיף. כדי לקצור את המעבר הראשון להסיר על טבעי מהצלחת ולהוסיף 600 microliters של מדיום ללא סרום. לאחר מכן השתמש במעלית תאים כדי לגרד את התאים ולהעביר לצינור נקי.מיד לאחר מכן להקפיא את ההשעיה וירוס חנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה יסודית. כדי לקבוע titers של מניות וירוס octuplicates לכל aliquot באמצעות 96 לוחות קיר. ראשית למשוך את התאים המפיק מבקבוקי תרבות תא T75 לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.ספור את התאים והתאם את מתלי התא ל- 150, 000 תאים למיליליטר ב- DMEM עם 10 אחוז FBS. הוסף 90 מיקרוליטרים של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר של צלחת קיר 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters מ aliquot אחד של מלאי הנגיף לכל 8 בארות בעמודה הראשונה של הצלחת.מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 10 microliters של כל באר, מן העמודה הראשונה אל העמודה השנייה, ומערבבים ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה. חזור על זה עבור כל עמודה כדי לקבל דילול פי עשרה טוריים של הנגיף באמצעות טיפים פיפטה טריים עבור כל שלב דילול.השלך 10 מיקרוליטרים מכל באר של העמודה האחרונה. הוסף 100 microliters של השעיית תא עם 150, 000 תאים למיליליטר לכל באר לוודא שאין גושי תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5 אחוז פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.בדוק אם יש סינקטיה באמצעות מיקרוסקופ אור. ספירת סינקטיה בכל באר של העמודה עם גורם הדילול הגבוה ביותר המכיל סינקטיה גלויה. עבור וירוסים הממקמים כתב פלואורסצנטי, ניתן לספור סינקטיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.לניתוח של קינטיקה שכפול וירוס חצבת יום אחד לפני זיהום זרע 100, 000 תאי ורו ב 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר על 12 צלחות קיר עם לפחות 2 בארות עבור כל נקודת עניין זמן. כדי להדביק את התאים להחליף את המדיום עם 300 microliters של מדיום ללא סרום המכיל את הכמות המתאימה של הנגיף. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני לפחות 2 שעות.הסר inoculum ולהוסיף 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ולהמשיך דגירה. בנקודות זמן רלוונטיות לאחר זיהום לקצור פרוגיוני ויראלי על ידי גירוד ישיר של תאים לתוך המדיום. מעבירים תוכן מכל באר לצינור בודד.יש להקפיא את החנקן הנוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד להקפאה ולאחר מכן להמשיך כמתואר בכתב היד. כדי להתחיל בהערכה של ציטוקסיות מתווכה על ידי תא BTE על ידי שחרור LDH, תחילה לבודד מוצרי מהומש מופרשים לידי ביטוי על ידי תאי יעד נגועים בנגיף ולבודד תאים משפיעים חיסוניים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן זרע תאי יעד בצלחת קיר U-bottom 96 וכוללים דגימות כמתואר בכתב היד.הוסף immunomodulators מבודדים בעבר בריכוזים הרצויים לדגימות המתאימות. מוסיפים תאי עריק חיסוני ביחסים הרצויים ומוסיפים נפח בינוני לנפח כולל של 100 מיקרוליטרים ל באר. דגירה עבור מסגרות הזמן שנקבעו בעבר הרצוי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.45 דקות לפני איסוף הדגימה להוסיף 10 microliters של פתרון Lysis 10X ל בארות המכילות דגימות T max ואת הפקדים הבינוניים המתאימים ולהמשיך דגירה. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך 4 דקות. להעביר 50 microliters של supernatant מכל באר ל בארות של צלחת שטוחה למטה 96 קיר הקפדה לא להעביר את התאים.לאחר הכנת פתרון מצע על פי היצרן להוסיף 50 microliters לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות או עד דגימות T מקסימום להפוך אדום עמוק. לאחר הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר.צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 4000 פעמים G ולאחר מכן להשתמש במחט חלולה כדי להסיר בועות אוויר. למדוד ספיגה אופטית ב 490 ננומטר ולחשב כמתואר בכתב היד. לאחר חיסון עם קידוד ללא שינוי ו- BTE קידוד על עקומות צמיחה וירוסי חצבת אונקוליטית של הווקטורים בהשוואה על תאי vero נראים דומים.עקומות הכדאיות של התאים בתאי קרצינומה של המעי ה-mc38 מורין מבטאות באופן יציב אנטיגן קרצ'ינומבריוניק אנושי ואת קולטני ה-MV CD46 לאחר החיסון מראים שפעילות ליטית של נגיף הקידוד הטרנסג'יני מפגרת מאחור בקו התאים של גידול המורין. ציטומטריית זרימה של אנטיגן היעד מבטא תאים דגירה עם BTE של בחמש דילולים שונים הראו BTE מחייב על ידי תאים באופן תלוי ריכוז. ב immunoblot לאחר משיכה מגנטית למטה של תאים הקשורים BTE הראו כי כאשר לא מיקוד BTE של שימשו לא היו כמויות לזיהוי של תאים;ואילו כאשר מיקוד דגימות BTE שימשו תאים מאוגדים היו נוכחים בשבר אלוטיון.BTE מתווך אנטיגן היעד ספציפי וריכוז תלוי cytotoxicity של תאי מורין T מסומן על ידי בדיקה שחרור LDH נציג ומראה כי בדוגמה הנוכחית 15 אחוז הרג תאים ספציפי הושג בריכוז BTE גבוה יחסית של 1 מיקרוגרם למיליליטר לעומת תאי התייחסות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפקח באופן קבוע על תאים כדי לבדוק את התקדמות הזיהום. אל תשכח כי זני חיסון חצבת רקומביננטי למרות שהומתק עלול להיות מסוכן במיוחד לאנשים מדוכאי חיסון.הימנע מחשיפה על ידי ביצוע נהלי הבטיחות הביולוגיים המתאימים. יש לחסן אנשים המטפלים בווירוסים לפני ביצוע שיטות אלה. בעקבות הליך זה ביטוי ויראלי של transgenes נוספים ניתן להשיג על מנת לנתח וירוס מארח אינטראקציות והשפעות טיפוליות.הפיתוח של טכניקות אלה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביותרפיה לחקור את ההשפעות של immunomodulators לידי ביטוי מקומי בישויות גידול רבות;In Vitro, In Vivo, וגם בניסויים קליניים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

הערכת הפעילות האנטי-סרטנית In vivo של ננו-חלקיקים פוליאנהידריד IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

שמירה על המגוון התאי של גליובלסטומה אנושית Ex vivo באמצעות תרבית אורגנואידית תלת-ממדית

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...