Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Questi metodi sono stati stabiliti nel gruppo Oncolitica guidato dal Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts presso il centro nazionale per patologie tumorali a Heidelberg. Siamo grati a lui e tutti i membri del team di laboratorio, soprattutto Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Questo lavoro è stato supportato dall'altro Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 al C.E. Engeland) e la Fondazione di scienza nazionale tedesca (DFG, concedere EN 1119/2-1 al C.E. Engeland). J.P.W Heidbuechel riceve uno stipendio da Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.

Nota: [O], [P] e [M] indicare applicabili alle sottosezioni: OVs in generale, paramyxoviruses (la maggior parte) o MV solo, rispettivamente. [B] indica le sezioni specifiche per BTE transgeni.
1 clonazione dei transgeni immunomodulatore-codifica in vettori del Virus di morbillo
<ol><li>
[O] design inserire sequenza.
	<ol>
<li>[O] decidere un immunomodulatore di interesse basato su ricerca di letteratura o esplorativa dei dati quali schermi genetici<sup class...

L'immunoterapia oncolytic (vale a dire., OVT in combinazione con immunomodulazione) rappresenta una grande promessa per il trattamento del cancro, chiedendo ulteriori sviluppo e ottimizzazione di virus oncolitici codifica proteine immunomodulatori. Questo protocollo descrive i metodi per generare e convalidare tali vettori per la prova successiva in modelli preclinici rilevanti e potenziale futuro traduzione clinica in nuove terapie anti-cancro.
Numerose piattaforme di virus oncolytic...

Virus oncolitici (OVs) stanno sviluppandi come terapie anti-cancro che specificamente replicano all'interno e uccidere le cellule tumorali mantenendo intatti i tessuti sani. Esso è ormai diventato comune comprensione che Oncolitica oncolytic (OVT), nella maggior parte dei casi, non affidarsi esclusivamente alla lisi completa del tumore replica efficiente e la diffusione del virus, ma richiede ulteriori meccanismi di azione per il successo del trattamento, tra cui vascolare e stromal di targeting e, soprattutto, stimolazione immune1,2,3,4. Mentre molti primi OV studi utilizzati virus non modificato, la ricerca attuale ha beneficiato di un biologico una migliore comprensione, biobanche di virus potenzialmente contenenti romanzo OVs e le possibilità offerte dall'ingegneria genetica al fine di creare avanzati OV piattaforme5,6,7.
Dato il recente successo di immunoterapia, immunomodulatori transgeni sono di particolare interesse per quanto riguarda l'ingegneria genetica di OVs. Espressione di tali prodotti genici dalle cellule del tumore OV-infetti riduce la tossicità rispetto alla somministrazione sistemica. Targeting è ottenuto utilizzando virus con oncoselectivity inerente o modificando tropismo virale8. Immunomodulazione locale migliora i meccanismi anti-tumorali multi-sfaccettati di OVT. Inoltre, questa strategia è fondamentale per interrogare l'interazione tra virus, le cellule del tumore e il sistema immunitario dell'ospite. A tal fine, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro applicabile e regolabile per progettare, clonare, salvataggio, propagare e convalidare oncolytic vettori di paramixovirus (specificamente il virus del morbillo) codifica tali transgeni.
Modulazione della risposta immunitaria può essere raggiunto da un'ampia varietà di prodotti di transgene targeting diverse fasi del cancro-immunità ciclo9, tra cui migliorare il riconoscimento dell'antigene tumorale [ad es., antigeni tumore-associati (TAA) o induttori del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole] sopra la maturazione delle cellule dendritiche di supporto per la presentazione dell'antigene efficiente (citochine); reclutamento e l'attivazione di cellule immunitarie desiderate come citotossici e cellule helper T [chemochine, anticorpo cellula T Ager (retroauricolari)]; targeting soppressive cellule come cellule T regolatorie, cellule mieloidi-derivato del soppressore, macrofagi associati al tumore e cancro-collegati di fibroblasti (anticorpi, retroauricolari, citochine); e prevenire l'inibizione delle cellule effettrici ed esaurimento (inibitori di checkpoint). Così, una pletora di agenti biologici è disponibile. Valutazione di tali immunomodulatori virus-messo per quanto riguarda l'efficacia terapeutica e possibili sinergie, nonché la comprensione dei rispettivi meccanismi è necessaria per migliorare la terapia del cancro.
Virus del RNA singolo filamento senso negativo della famiglia Paramyxoviridae sono caratterizzati da diverse caratteristiche favorevoli al loro uso come vettori oncolytic. Questi includono un oncotropism naturale, di grande capacità genomico per transgeni (più di 5 kb)10,11, efficiente diffusione compreso formazione di sincizi e alta immunogenicità12. Di conseguenza, le piattaforme OV basate sul cimurro virus13, parotite virus14, Newcastle malattia virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518e Tupaia paramyxovirus19 sono stati sviluppati. Più visibile, attenuato vaccino vivo del morbillo virus ceppi (MV) hanno progredito in sviluppo preclinico e clinico20,21. Questi ceppi sono stati utilizzati per decenni per immunizzazione di routine con un record di sicurezza eccellente22. Inoltre, non c'è nessun rischio di mutagenesi inserzionale dovuto la replica rigorosamente citosolica di paramyxoviruses. Un sistema versatile di genetica inversa basato su cDNA anti-genomico che consente per l'inserimento dei transgeni in unità trascrizionali aggiuntive (ATUs) è disponibili11,23,24. Vettori di MV codifica symporter ioduro di sodio (MV-NIS) per imaging e radioterapia o antigene carcinoembrionario solubile (MV-CEA) come un indicatore sostitutivo per l'espressione genica virale sono attualmente in fase di valutazione in studi clinici (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 e NCT00408590). Amministrazione provvisoria è stata confermata e sono stati segnalati casi di efficacia anti-tumorale in precedenti studi25,26,27,28,29, 30 (Recensito da Msaouel et altri.31), spianando la strada alla ricerca di virus di morbillo oncolytic aggiuntivi che sono stati sviluppati e testati preclinically. MV codifica immunomodulatori molecole targeting diverse fasi del ciclo del cancro-immunità hanno dimostrati di rallentare la crescita del tumore e/o prolungare la sopravvivenza in topi, con prova per efficacia di immune-mediata e memoria immunitaria protettiva a lungo termine in syngeneic modelli murini. Vettore-codificato transgeni includono fattore (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofilo-attivazione proteina34, checkpoint immuni inibitori35, di stimolazione della Colonia del granulocyte-macrofago interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37e retroauricolari38, che legame incrociato un antigene di superficie del tumore con CD3 e indurre così attività anti-tumorale di cellule T policlonali, indipendentemente dalla T cell receptor specificità e co-stimolazione ( Figura 1). I risultati preclinici promettenti ottenuti per questi costrutti ulteriori sforzi traslazionale domanda.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), un tipo ho herpes simplex virus codifica GM-CSF, è l'unico oncolytic terapeutico approvato dalla United States Food e Drug Administration (FDA) e Agenzia europea dei medicinali (EMA). Studio di fase III che conduce a omologazioni in fine del 2015 non ha solo dimostrato efficacia al luogo dell'iniezione intra-tumorali, ma anche effetti abscopal (cioè, le remissioni delle lesioni non-iniettato) nel melanoma avanzato39. T-VEC da allora è entrato prove supplementari per applicazione in altre entità del tumore (ad esempio tumori cutanei non-melanoma di, , NCT03458117; cancro del pancreas, NCT03086642) e per la valutazione delle terapie di combinazione, specialmente con checkpoint immuni inibitori (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 e Ribas et altri.40).
Ciò dimostra non solo il potenziale di immunoterapia oncolytic, ma anche la necessità di ulteriori ricerche identificare le combinazioni superiori di OVT e immunomodulazione. Progettazione razionale di ulteriori vettori e loro sviluppo per test preclinici è chiave per questa impresa. Questo avanzerà anche la comprensione dei meccanismi di fondo e ha implicazioni per la progressione verso il trattamento del cancro più personalizzata. A tal fine, questa pubblicazione presenta la metodologia per la modifica e lo sviluppo del paramyxoviruses per immunoterapia del cancro mirate e, più in particolare, del virus di morbillo oncolitici codifica anticorpi impegnandosi a cellula T (Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Immunoterapia del cancro di successo ha il potenziale per raggiungere il controllo a lungo termine del tumore. Nonostante recenti successi clinici, ci rimane un urgente bisogno di terapie sicure ed efficaci su misura per profili immune tumore specifico. Virus oncolitici abilitare l'induzione delle risposte immunitarie antitumorali come pure l'espressione genica del tumore limitato. Questo protocollo descrive la generazione ed ex vivo analisi di immunomodulatori oncolytic vettori. Concentrandosi sui virus vaccino morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio, la metodologia generale può essere adattata ad altre specie del virus e transgeni. Il flusso di lavoro presentato comprende la progettazione, clonazione, salvataggio e propagazione di virus ricombinanti. Saggi per analizzare la cinetica di replica e l'attività litica del vettore così come funzionalità dell'immunomodulatore isolato ex vivo sono inclusi, facilitando così la generazione di nuovi agenti per un ulteriore sviluppo in modelli preclinici e, infine, traduzione clinica.

La figura 1 illustra il meccanismo di azione del virus di morbillo oncolitici codifica anticorpo cellula T ager. Un diagramma di flusso che descrive il flusso di lavoro del presente protocollo è presentato nella Figura 2. Figura 3 Mostra un esempio di un genoma di virus di morbillo oncolytic modificate. Questo fornisce una rappresentazione visiva dei cambiamenti specifici applicati...

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Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare le sfide chiave nel campo dell'immunoterapia oncologica facilitando lo sviluppo di vettori oncolittici per l'immunomodulazione mirata. Il principale vantaggio del sistema genetico inverso applicato è la sua versatilità;quindi, i vettori possono essere adattati per affrontare varie domande di ricerca e indirizzare tumori con diverse firme immunitarie. I passaggi di propagazione del virus, in particolare determinando il punto di tempo ottimale per raccogliere il virus, sono difficili da imparare da un protocollo di testo perché la formazione di sinctia deve essere valutata visivamente nel tempo.Per iniziare a progettare e clonare vettori immunomodulatori ricombinanti come descritto nel manoscritto. Questo protocollo descrive passaggi specifici per lo sviluppo di un vettore oncolitico del vaccino contro il morbillo, codificando un engager a cellule T bispecifiche. Per salvare il virus del morbillo dal cDNA, 24 ore prima della piastra di trasfezione le cellule produttrici del virus del morbillo in modo uniforme su una piastra a parete 6.Seme 200.000 cellule in 2 millilitri DMEM contenenti il 10% di FBS per pozzo per raggiungere la confluenza dal 65 al 75% al momento della trasfezione. Mescolare 5 microgrammi di DNA ricombinante che codificano l'antigenoma del virus del morbillo che verrà utilizzato per trasfetto le cellule. Plasmidi appropriati e un reporter fluorescente in un volume totale di 200 microlitri di DMEM.Aggiungere 18,6 microlitri di reagente di trasfezione liposomiale alla miscela e far scorrere immediatamente il tubo per mescolare. Incubare questo mix di trasfezione per 25 minuti a temperatura ambiente. Per trasfetto le cellule produttrici di MV rimuovere il mezzo dalla piastra del pozzo 6 coltivata al 65-75% di confluenza e aggiungere 1,8 millilitri di DMEM con FBS 2% e 50 microgrammi per millilitro Kanamycin per pozzo.Quindi aggiungere il mix di trasfezione dropwise ad ogni pozzo e ruotare con attenzione. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente sostituire il mezzo con 2 millilitri di DMEM fresco con FBS al 2% e 50 microgrammi per millilitro Kanamycin e ripeterlo quando il mezzo diventa acido riconosciuto dal colore giallo.Usa un microscopio per osservare quotidianamente le cellule per l'espressione genica del reporter e la formazione di sincitia. Quando la grande sincrezia composta da 20 o più cellule sono visibili o quando le cellule diventano troppo dense raccolgono il virus. 24 ore prima del seme di raccolto previsto circa 1,5 milioni di cellule produttrici di MV in 12 millilitri di DMEM con FBS al 10% su piatti da 10 centimetri per ottenere una confluenza dal 65 al 75% al momento dell'inoculazione del virus.Per raccogliere la proginia virale utilizzare un raschietto cellulare per raschiare con cura le cellule di produzione aderenti dalla piastra a 6 pareti con cellule trasfette. Trasferire il mezzo contenente le celle raschiate in un tubo di centrifuga. Centrifugare per almeno 2500 volte G e 4 gradi Celsius per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.Dopo la centrifugazione mescolare il supernatante privo di cellule con mezzo privo di siero fino a un volume finale di 4 millilitri per preparare l'inoculo. Rimuovere il mezzo dal piatto di 10 centimetri con le cellule di produzione di MV e aggiungere l'inoculo alle cellule. Incubare per almeno 2 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione aggiungere 6 millilitri di DMEM con FBS al 10% e incubare le cellule durante la notte. Quindi sostituire il mezzo con 12 millilitri di DMEM fresco con FBS al 10% e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino alla raccolta. Osservare le cellule almeno due volte al giorno.Prima dello scoppio della sinctia quando l'interruzione della membrana diventa visibile raccogliere il virus. Per raccogliere il primo passaggio rimuovere il supernatante dal piatto e aggiungere 600 microlitri di mezzo privo di siero. Quindi utilizzare un sollevatore di celle per raschiare le celle e trasferirlo in un tubo pulito.Subito dopo congelare la sospensione del virus in azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius per almeno 24 ore per garantire un congelamento accurato. Per determinare i titoli delle scorte di virus in ottuplicati per aliquota utilizzando 96 piastre a parete. Per prima cosa estrarre le cellule produttrici dai contenitori di coltura cellulare T75 in un tubo conico da 50 millilitri.Contare le celle e regolare la sospensione cellulare a 150.000 celle per millilitro in DMEM con FBS al 10%. Aggiungere 90 microlitri di DMEM con FBS al 10% per pozzo di una piastra a parete 96. Quindi aggiungere 10 microlitri da un'aliquota del patrimonio virale a tutti e 8 i pozzi nella prima colonna della piastra.Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri di ogni pozzo, dalla prima alla seconda colonna, e mescolare accuratamente convogliando su e giù. Ripetere questa procedura per ogni colonna per ottenere diluizioni seriali di dieci volte del virus utilizzando punte di pipetta fresche per ogni fase di diluizione.Scartare 10 microlitri da ogni pozzo dell'ultima colonna. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare con 150.000 cellule per millilitro a ciascun pozzo assicurandosi che non ci siano grumi cellulari. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48 ore.Verificare la presenza di sincizia utilizzando un microscopio a luce. Contare la sincizia in ogni pozzo della colonna con il fattore di diluizione più alto contenente la sincizia visibile. Per i virus che codificano un reporter fluorescente, la sinctia può essere conteggiata utilizzando la microscopia a fluorescenza.Per l'analisi della cinetica di replicazione del virus del morbillo un giorno prima del seme di infezione 100.000 cellule vero in 1 millilitro di DMEM con FBS 10% per pozzo su 12 piastre a parete con almeno 2 pozzi per ogni punto di interesse. Per infettare le cellule sostituire il mezzo con 300 microlitri di mezzo privo di siero contenente la rispettiva quantità del virus. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno 2 ore.Rimuovere l'inoculo e aggiungere 1 millilitro di DMEM con FBS al 10% e continuare l'incubazione. Nei punti di tempo rilevanti dopo l'infezione raccogliere la proginia virale raschiando direttamente le cellule nel mezzo. Trasferire il contenuto da ogni pozzo a un singolo tubo.Agganciare il congelamento in azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius fino alla titolazione e quindi procedere come descritto nel manoscritto. Per iniziare la valutazione della citotossicità mediata dalle cellule indotte da BTE mediante rilascio di LDH, isolare prima i prodotti transgeni secreti espressi dalle cellule bersaglio infettate dal virus e isolare le cellule dell'effettore immunitario come descritto nel manoscritto. Quindi semina le cellule bersaglio in una piastra da parete 96 inferiore a U e includi campioni come descritto nel manoscritto.Aggiungere immunomodulatori precedentemente isolati alle concentrazioni desiderate ai rispettivi campioni. Aggiungere le cellule del disertore immunitario ai rapporti desiderati e aggiungere un volume medio-totale di 100 microlitri per pozzo. Incubare per i tempi precedentemente determinati desiderati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.45 minuti prima della raccolta del campione aggiungere 10 microlitri di soluzione di lisi 10X ai pozzi contenenti campioni T max e i corrispondenti controlli medi e continuare l'incubazione. Centrifugare le cellule a 250 volte G per 4 minuti. Trasferire 50 microlitri di supernatante da ogni pozzo a pozzi di una piastra a parete 96 inferiore piatta assicurandosi di non trasferire le celle.Dopo aver preparato la soluzione del substrato secondo il produttore aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti o fino a quando i campioni T max diventano rosso intenso. Dopo l'incubazione aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo.Centrifugare per 1 minuto a 4000 volte G e quindi utilizzare un ago scavato per rimuovere le bolle d'aria. Misurare l'assorbanza ottica a 490 nanometri e calcolare come descritto nel manoscritto. Dopo l'inoculazione con virus del morbillo oncolitici non modificati e BTE, le curve di crescita dei vettori confrontati sulle cellule vero appaiono simili.Le curve di vitalità cellulare sulle cellule del carcinoma colorettale murino mc38 che esprimono stabilmente l'antigene carcinoembrionale umano e i recettori MV CD46 dopo l'inoculazione mostrano che l'attività licale del virus della codifica transgena è in ritardo nella linea cellulare tumorale murina. La citometria a flusso dell'antigene bersaglio che esprime cellule incubate con BTE a cinque diverse diluizioni ha mostrato il legame BTE da parte delle cellule in modo dipendente dalla concentrazione. Nell'immunoblot dopo il pull down magnetico delle cellule associate al BTE è emerso che quando si utilizzavano BTE non mirati non c'erano quantità rilevabili di cellule;mentre quando si prendevano di mira i campioni di BTE erano presenti cellule legate nella frazione di eluizione.La citotossicità bersaglio mediata da BTE specifica e dipendente dalla concentrazione delle cellule T murine è indicata da un saggio rappresentativo di rilascio di LDH e mostra che nel presente esempio l'abbattimento specifico di cellule del 15% è stato raggiunto ad una concentrazione di BTE relativamente elevata di 1 microgrammo per millilitro rispetto alle cellule di riferimento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare regolarmente le cellule per controllare la progressione dell'infezione. Non dimenticare che i ceppi di vaccino contro il morbillo ricombinanti sebbene attenuati possono essere pericolosi soprattutto per gli individui immuno-soppressi.Evitare l'esposizione seguendo le procedure di biosicurezza appropriate. Gli individui che maneggiano virus devono essere vaccinati prima di eseguire questi metodi. Seguendo questa procedura è possibile ottenere l'espressione virale di ulteriori transgeni al fine di analizzare le interazioni degli ospiti del virus e gli effetti terapeutici.Lo sviluppo di queste tecniche ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della bioterapia per esplorare gli effetti degli immunomodulatori espressi localmente in numerose entità tumorali;In Vitro, In Vivo e anche negli studi clinici.

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