Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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これらのメソッドは、ハイデルベルクの腫瘍疾患国立センター教授博士博士男 Ungerechts が率いる Virotherapy グループで設立されました。彼と特に博士トビアス斑点、博士 Rūta Veinalde、ジュディス ・ フェルスター、ビルギット Hoyler、ジェシカ アルバート研究室チームのすべてのメンバーにお世話になっております。この作業によって、他 Kröner ・ フレゼニウス財団を支えられた (西暦 Engeland に助成金 2015_A78) とドイツ国立科学財団 (DFG、西暦 Engeland に EN 1119/2-1 を付与)。J.P.W. Heidbuechel は、がん研究のため大学院国際ヘルムホルツによって給付金を受け取ります。

注:[O]、[P] と [M] に該当するサブセクションを示す: 一般的に、(ほとんどの) のパラミクソ ウイルスや MV のみ、OVs それぞれ。[B] BTE transgenes に固有のセクションを示します。
麻疹ウイルスのベクトルに 1 に比べてエンコード遺伝子クローニング
<ol><li>
[O] 設計は、シーケンスを挿入します。
	<ol>
<li>[O] 文学研究または遺伝スクリーン<sup class="xref"...

腫瘍溶解性免疫療法 (すなわち.、免疫との組み合わせで超過) 開発と腫瘍溶解性ウイルス免疫調節蛋白質をコードの最適化をさらに求めて、癌治療のための偉大な約束を保持します。このプロトコルでは、生成および関連する前臨床モデルと抗がん治療に潜在的な将来の臨床翻訳して後続のテストのようなベクトルを検証する方法について説明します。
明確な利点...

腫瘍溶解性ウイルス (OVs) は、特に内のレプリケートし、健康な組織をそのまま残しながら腫瘍細胞を殺す抗がん剤治療として開発されています。効率的なレプリケーションおよびウイルスの広がりによって完全な腫瘍の換散にのみ依存しない理解する腫瘍溶解性 virotherapy (超過)、ほとんどの場合は共通になっている、治療成功のアクションの追加機構を必要とするを含む血管性および間質ターゲット、重要な免疫刺激1,2,3,4。現在の研究理解、潜在的小説 OVs、および高度な OV を作成するために遺伝子工学によって提供される可能性を含むウイルス バイオバンク改善生物から利益を得ている OV の多くの初期の研究は、そのままウイルスを使用プラットフォーム5,6,7。
免疫療法の最近の成功を考えると、免疫調節遺伝子、OVs.の遺伝子工学に関する分野OV 感染腫瘍細胞でこれらの遺伝子産物の発現は、全身投与と比較して毒性を低減します。ターゲティングを固有の oncoselectivity ウイルスを用いたまたはウイルスのトロピズム8を変更することにより達成します。ローカル免疫は、超過作業時間の多面的の抗腫瘍メカニズムを強化します。さらに、この戦略は、ウイルス、腫瘍細胞と宿主免疫系との相互作用を尋問に尽力されます。この目的のためには、このプロトコルは、設計、クローン、救助、伝達、および腫瘍溶解性パラミクソ ウイルス (特に麻疹ウイルス) ベクトルのような遺伝子をエンコーディングを検証の適用および調整可能なワークフローを提供します。
さまざまな癌免疫サイクル9、腫瘍抗原の認識 [例えば、腫瘍関連抗原 (TAAs) または誘導剤の強化などの異なるステップをターゲット遺伝子製品により免疫反応の変調が可能します。主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子] 効率的な抗原提示 (サイトカイン); の樹状細胞の成熟を支援を募集し、よう必要な免疫細胞を活性化細胞とヘルパー T 細胞 [ケモカイン、二重特異性 T 細胞化クリニカルパス (BTEs)];制御性 T 細胞、骨髄由来抑制細胞、腫瘍関連マクロファージ癌関連付けられている線維芽細胞 (抗体、BTEs、サイトカイン); など抑制細胞をターゲットエフェクター細胞抑制作用と疲労 (チェックポイント阻害剤) を防止します。したがって、生物学的製剤の茄多は利用できます。このようなウイルスでエンコードされた免疫に関する治療効果とシナジー効果を狙うだけでなく、それぞれのメカニズムの理解の評価は癌治療を改善するために必要です。
ある家族の負の意味一本鎖 RNA ウイルスは、増殖型ベクトルとしていくつかの機能の使用を助長によって特徴付けられます。自然 oncotropism、transgenes (5 kb 以上)10,11, 分離形成や高い免疫原性12など展開して効率的な大容量ゲノムが含まれます。したがって、OV プラットフォームに基づいて犬ジステンパー ウイルス13、流行性耳下腺炎ウイルス14ニューカッスル病ウイルス15、センダイ ウイルス16,17、シミアン ウイルス 518、および Tupaia パラミクソ ウイルス19開発されています。最も目立つライブ弱毒生麻しんウイルス ワクチン前臨床や臨床開発20,21系統 (MV) が進んでいます。これらのウイルスは、優れた安全記録22定期的な予防接種を何十年も使用されています。また、パラミクソ ウイルスの厳密にゾル性細胞質のレプリケーションによる挿入突然変異誘発のリスクはありません。追加転写単位 (ATUs) への遺伝子の挿入を可能にする反ゲノムの cDNA に基づく汎用性の高いリバース ・ ジェネティクス システムは利用可能な11,23,24です。ウイルス遺伝子発現のサロゲート マーカーとして、イメージング、放射線治療や可溶性癌胎児性抗原 (CEA-MV) ヨウ化ナトリウム シンポート (MV NIS) をエンコード MV ベクトル (NCT02962167、NCT02068794、臨床試験で現在評価中NCT02192775、NCT01846091、NCT02364713、NCT00450814、NCT02700230、NCT03456908、NCT00408590、および NCT00408590)。安全管理を確認しており、抗腫瘍効果の場合は、前研究25,26,27,28,29,で報告されている30 (Msaouel et ら31によって再検討されました)、開発とテスト preclinically 追加腫瘍溶解性麻疹ウイルスのための道を舗装します。癌免疫サイクルの多様な手順を標的分子は腫瘍の成長を遅らせるし、同系の長期保護免疫記憶と免疫介在性のエビデンスをマウスの生存を延長する示されている免疫調節をエンコーディング MVマウスのモデル。ベクトルでエンコードされた遺伝子は、顆粒球・ マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)32,33, h. ピロリ菌好中球活性化蛋白質34, 免疫チェックポイント阻害剤35、します。インターロイキン 12 (IL-12)36、TAAs37と BTEs38CD3 と腫瘍表面抗原を架橋し、このように誘発する T 細胞受容体の特異性と共刺激 (に関係なく、取込んだポリクローナルな T 細胞による抗腫瘍活性図 1)。有望な臨床結果は、これらの構造に対する需要さらに並進努力を取得しました。
Talimogene laherparepvec (T VEC)、型私エンコーディング GM-CSF、単純ヘルペス ウイルスはアメリカ合衆国食品薬品局 (FDA) と欧州医薬品庁 (EMA) によって承認された唯一的治療。承認に至る後半 2015 の第 III 相試験のみ高度な黒色39で腫瘍内注入も abscopal 効果 (すなわち、非注入病変の寛解) のサイトで効力を示したないです。T VEC 追加試験他の腫瘍のエンティティ (例えば NCT03458117、、非黒色腫皮膚がん; 膵がん、NCT03086642) でアプリケーション、特に免疫チェックポイントとの併用療法の評価に入っているので阻害剤 (NCT02978625、NCT03256344、NCT02509507、NCT02263508、NCT02965716、NCT02626000、NCT03069378、NCT01740297、およびリーバスet ら40)。
これは、腫瘍溶解性免疫療法の潜在的なだけでなく、超過作業時間と抗炎症の優れた組み合わせを識別するためにさらなる研究の必要性を示しています。追加ベクトルおよび前臨床試験の開発の合理的な設計は、この事業への鍵です。これは根本的なメカニズムの理解を進めるよりパーソナライズされた癌の治療への進行に影響しています。このため、この文書の変更およびパラミクソ ウイルスを対象となる癌免疫療法と、T 細胞に魅力的な抗体 (図 2) をエンコードする腫瘍溶解性麻疹ウイルスのより具体的には、開発方法論を提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

成功したがん免疫療法には、長期的な腫瘍制御を実現する可能性があります。最近の臨床成功にもかかわらず個々 の腫瘍免疫プロファイルに合わせた安全で効果的な治療のための緊急の必要性が残っています。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍によって制限されている遺伝子発現と同様、抗腫瘍免疫応答の誘導を有効にします。このプロトコルでは、免疫調節的ベクトルの生成と ex vivo 解析について説明します。例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコーディング麻疹ワクチン ウイルスを中心に、一般的な方法は他種ウイルスと遺伝子に合わせることができます。提示されたワークフローでは、デザイン、クローニング、救助、および組換えウイルスの伝搬を含まれています。複製の動態と前のヴィヴォ分離に比べて機能だけでなく、ベクトルの溶菌活性を分析するための試金が含まれ、新薬の前臨床モデルの更なる発展のための世代を進め、最終的に臨床の翻訳。

図 1は、二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコーディング腫瘍溶解性麻疹ウイルスの作用のメカニズムを示しています。このプロトコルのワークフローを示すフローチャートを図 2に示します。変更された腫瘍溶解性麻疹ウイルスのゲノムの例を図 3に示します。これは挿入された?...

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Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics の開発を加速します。

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

この方法は、標的免疫調節のための腫瘍分解ベクターの開発を促進することにより、がん免疫療法の分野における主要な課題に対処するのに役立ちます。応用リバース遺伝系の主な利点は、その汎用性;したがって、ベクターは、多様な免疫シグネチャを有する様々な研究の質問や標的腫瘍に対処するために適応させることができる。ウイルス伝播のステップは、特にウイルスを収穫するための最適なタイムポイントを決定することは、時間の経過とともに同期形成を視覚的に評価しなければならないため、テキストプロトコルから学ぶのは困難である。原稿に記載されているように組換え免疫調節ベクターの設計およびクローンを開始する。このプロトコルは、二重特異性T細胞エンゲージをコードする、発疹ワクチンベクターの開発のための具体的なステップを記述する。cDNAから麻疹ウイルスを救出するために、トランスフェクションプレートの24時間前に、トランスフェクションプレートは麻疹ウイルス産生細胞を6つの壁板に均等にする。種子200,000細胞は、トランスフェクション時に65〜75%の合流を達成するために、1ウェルあたり10%FBSを含有する2ミリリットルDMEMで。細胞をトランスフェクトするために使用される麻疹ウイルス抗ゲノムをコードする組み換えDNAの5マイクログラムを混合する。DMEMの200マイクロリットルの総容積の適切なプラスミドおよび蛍光レポーター。18.6マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を混合物に加え、すぐにチューブをフリックして混合します。このトランスフェクションミックスを室温で25分間インキュベートします。MVプロデューサー細胞をトランスフェクトするには、65〜75%の合流度に成長した6ウェルプレートから培地を取り除き、1ウェルあたり2%FBSと50マイクログラムあたり50マイクログラムのDMEMを1.8ミリリットル加える。その後、トランスフェクションミックスを各ウェルに滴下し、慎重に旋回します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートする。翌日、培地を2%FBS、1ミリリットルカナマイシン当たり50マイクログラムの新鮮なDMEMで培地を交換し、黄色の色で酸性になった場合にこれを繰り返します。顕微鏡を使用して、レポーター遺伝子発現およびシンクリシア形成のために細胞を毎日観察する。20以上の細胞からなる大きな同期が目に見える場合、または細胞があまりにも密になったときにウイルスを収穫。予想される収穫シードの24時間前に、ウイルス接種時に65〜75%の合流を達成するために、10センチメートルの皿に10%FBSを有するDMEMの12ミリリットルの約150万のMV生産者細胞。ウイルスを収集するには、細胞スクレーパーを使用して、トランスフェクトされた細胞と6つの壁プレートから接着プロデューサー細胞を慎重にスクレイピングします。掻き取った細胞を含む培地を遠心管に移します。遠心分離機は、少なくとも2500倍Gと5分間摂氏4度の細胞の破片を除去するために。遠心分離後、無細胞上清と無血清培地を4ミリリットルの最終体積に混合し、接種を調製する。MVプロデューサー細胞を持つ10センチメートル皿から培地を取り除き、細胞に接種を加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で少なくとも2時間インキュベートする。インキュベーション後、10%FBSで6ミリリットルのDMEMを加え、細胞を一晩インキュベートします。その後、培地を12ミリリットルの新鮮なDMEMを10%FBSに置き換え、収穫まで摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。細胞を少なくとも1日2回観察してください。膜の破壊が目に見えるウイルスの収穫になると、同期バーストの前に.第1の通路を収穫するためにプレートから上澄み物を取り除き、600マイクロリットルの無血清培地を添加する。その後、セルリフターを使用して細胞を削り、きれいなチューブに移します。その直後にウイルス懸濁液を液体窒素で凍結し、完全凍結を確実にするために少なくとも24時間摂氏80度で保存します。96の壁板を使用してアリコート当たりの八重奏でウイルスストックの価数を決定する。まず、T75細胞培養フラスコから50ミリリットル円錐形チューブにプロデューサー細胞を引き出します。セルを数え、10%FBSでDMEMで1ミリリットル当たり150,000細胞に細胞懸濁液を調整します。96の壁板の井戸ごとに10パーセントFBSのDMEMの90マイクロリットルを加える。次に、ウイルスストックの1つのアリコートからプレートの最初の列のすべての8つの井戸に10マイクロリットルを加えます。少なくとも10回は上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。マルチチャンネルピペットを使用して、1番目から2番目の列まで各井戸の10マイクロリットルを転送し、上下にピペットを入れ込んで十分に混ぜます。各カラムでこれを繰り返し、希釈工程ごとに新鮮なピペットチップを使用してウイルスの連続10倍希釈を得る。最後の列の各ウェルから10マイクロリットルを捨てます。150,000個の細胞を1ミリリットルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、細胞塊がないことを確認します。摂氏37度、炭酸ガス5%を48時間インキュベートします。光顕微鏡を使用して同期性を確認します。可視の同期を含む最も高い希釈係数を持つ列の各ウェルの同期をカウントします。蛍光レポーターをコードするウイルスの場合、蛍光顕微鏡を用いて同期を数えることができる。感染の1日前に、100,000個のベロ細胞をDMEMの1ミリリットルで、12個の壁面プレートに12個のウェルを有する12個の壁面プレートで、100,000個のベロ細胞を感染させる前日に、麻疹ウイルス複製動態を分析した。細胞に感染するために、ウイルスのそれぞれの量を含む血清遊離培地の300マイクロリットルで培地を交換する。摂氏37度、二酸化炭素5%を少なくとも2時間インキュベートする。接種を取り除き、10%FBSでDMEMを1ミリリットル加え、インキュベーションを続けます。感染後の関連ポイントでは、直接培地に細胞を掻き取ることによってウイルス原生を収穫する。各ウェルから個々のチューブに内容を移します。液体窒素で凍結し、滴定するまで摂氏80度で保存し、原稿に記載されているように進みます。LDH放出によるBTE誘導細胞媒介細胞傷害性の評価を開始するために、まず、ウイルス感染標的細胞によって発現される分泌されたトランスジーン産物を単離し、原稿に記載される免疫エフェクター細胞を単離する。次に、U-底96壁板に標的細胞をシードし、原稿に記載されているサンプルを含む。必要な濃度で、事前に単離された免疫調節剤をそれぞれのサンプルに加えます。所望の比率で免疫脱北細胞を加え、ウェルあたり100マイクロリットルの総体積に培地を加える。摂氏37度と5%の二酸化炭素で、以前に決定された必要な時間枠をインキュベートします。サンプル採取の45分前に、T maxサンプルと対応する培地コントロールを含むウェルに10マイクロリットルの10マイクロリットルの10X Lysis溶液を加え、インキュベーションを継続します。細胞をGの250倍で4分間遠心分離する。細胞を移さないように平らな底96の壁の版の井戸に各井戸から上澄みの50マイクロリットルを移す。メーカーに従って基板溶液を調製した後、各ウェルに50マイクロリットルを追加します。暗闇の中で室温で30分間、またはT maxサンプルが深い赤になるまでインキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加えます。遠心分離機はGの4000倍で1分間、そしてくぼんだ針を使って気泡を取り除く。490ナノメートルで光学吸光度を測定し、原稿に記載されているように計算します。未修飾およびBTEコードの加血性麻疹を用いた接種後、ベロ細胞上の比較されたベクターの成長曲線は類似しているように見える。mc38マウス大腸癌細胞上の細胞生存曲線は、ヒト発がん性胎児性抗原およびMV受容体CD46を接種後安定に発現し、トランスジーンをコードするウイルスのリンパ管細胞株におけるリンパ管のリンパ動のリンパ活性が遅れていることを示している。BTEと共にインキュベートした標的抗原発現細胞のフローサイトメトリーは、濃度依存的に細胞によってBTE結合を示した。BTE関連細胞の磁気プルダウン後のイムノブロットでは、非標的BTEが使用された場合には検出可能な量の細胞が存在しなかったのに対し、BTEサンプルを標的とした場合は結合細胞が溶出画画に存在していたことが示された。BTE媒介標的抗原特異的および濃度依存性マウスT細胞の細胞毒性は、代表的なLDH放出アッセイによって示され、本実施例では、参照細胞と比較して1ミリリットル当たり1マイクログラムの比較的高いBTE濃度で特異的細胞殺死が達成されたことを示している。この手順を試みる間、 定期的に感染の進行を確認する細胞を監視することを忘れないでください。組み換え麻疹ワクチン株は、減衰したが、特に免疫抑制された個人に有害であるかもしれないことを忘れないでください。適切なバイオ安全手順に従って、暴露を避けてください。ウイルスを扱う個人は、これらの方法を実行する前に予防接種を受ける必要があります。この手順に従って、さらにトランス遺伝子のウイルス発現は、ウイルス宿主の相互作用および治療効果を分析するために達成され得る。これらの技術の開発は、バイオセラピーの分野の研究者が、多数の腫瘍性エンティティにおける局所的に発現した免疫調節物質の効果を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

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