Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Disse metodene ble etablert i gruppen Virotherapy ledet av professor Dr. Dr. Guy Ungerechts ved National Center for svulst sykdommer i Heidelberg. Vi står i gjeld til ham og alle medlemmer av laboratoriet team, spesielt Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler og Jessica Albert. Dette arbeidet ble støttet av den andre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 til CE Engeland) og tysk National Science Foundation (DFG, gi EN 1119/2-1 til CE Engeland). J.P.W. Heidbuechel mottar et stipend av Helmholtz International Graduate School for kreftforskning.

Merk: [O], [P], og [M] angir ledd gjelder: OVs i generelt, (de fleste) paramyxoviruses eller MV, henholdsvis. [B] angir inndelinger bestemt BTE effekter av transgener.
1 kloning av Immunomodulator-koding effekter av transgener i meslinger viruset vektorer
<ol><li>
[O] design sett inn sekvens.
	<ol>
<li>[O] bestemme en immunomodulator rundt basert på forskning i literatur eller utforskende data som genetiske skjermer41 og utlede relev...

Kan immunterapi (i.e., overtid i kombinasjon med immunomodulation) har store løftet for kreftbehandling, krevende videre utvikling og optimalisering av kan virus koding immunmodulerende proteiner. Denne protokollen beskriver metoder for å generere og godkjenne slike vektorer for påfølgende testing i relevante prekliniske modeller og potensielle fremtidige klinisk oversettelse til romanen kreft therapeutics.
Mange ulike kan virus plattformer med forskjellige fordeler er tilgjengeli...

Kan virus (OVs) utvikles som anti-kreft legemiddelselskap som spesielt replikere innen og drepe kreftceller mens røres sunt vev. Det har nå blitt vanlig forstå at det kan virotherapy (overtid), i de fleste tilfeller, ikke stole utelukkende på komplett svulst lysis av effektiv replikering og spredning av viruset, men krever flere virkningsmekanismer for suksess, inkludert vaskulær og stromal målretting og, viktigst, immune stimulering1,2,3,4. Mens mange OV studier brukt uforandret virus, har nåværende forskning profittert fra en forbedret biologiske forståelse, virus biobanker som inneholde romanen OVs og mulighetene som tilbys av genteknologi for å lage avanserte OV plattformer5,6,7.
Gitt den nylige suksessen immunterapi, er immunmodulerende effekter av transgener av spesiell interesse om genteknologi av OVs. Målrettet uttrykk for slike genet produkter av OV-infiserte kreftceller reduserer toksisitet sammenlignet med systemisk administrasjon. Målretting oppnås ved å bruke virus med iboende oncoselectivity eller ved å endre viral tropism8. Lokale immunomodulation forbedrer mangesidig anti-tumor mekanismer for overtid. Videre, denne strategien er instrumental i avhør samspillet mellom virus, tumorceller og immun vertssystemet. Dette gir denne protokollen en anvendelig og justerbar arbeidsflyt for å utforme, klone, redde, overføre og validere kan paramyxovirus (spesielt meslinger viruset) vektorer koding slike effekter av transgener.
Modulering av immun respons oppnås ved en rekke forskjellige trinn av kreft-immunitet syklus9, inkludert styrke svulst antigen anerkjennelse [f.eks svulst-assosiert antigener (TAAs) eller indusere av transgene spesialprodukter store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I molekyler] over støtter dendrittiske celle modning for effektiv antigen presentasjon (cytokiner); rekruttering og aktivere ønsket immunceller som cytotoksiske og hjelper T celler [chemokines, bispecific T celle engagers (BTEs)]; målretting undertrykkende celler som regulatoriske T-celler, myelogen-avledet suppressor cellene, tumor-assosiert makrofager og kreft-assosiert fibroblaster (antistoffer, BTEs, cytokiner); og hindre effektor celle hemming og utmattelse (checkpoint hemmere). Således, en overflod av biologiske midler er tilgjengelige. Evaluering av slike virus-kodede immunomodulators terapeutiske effekten og synergimuligheter samt forståelse av respektive mekanismer er nødvendig å forbedre kreft terapi.
Negativ forstand single-strandet RNA virus av Paramyxoviridae familie er preget av flere funksjoner til deres bruk som kan vektorer. Disse inkluderer en naturlig oncotropism, stor genomisk kapasitet for effekter av transgener (mer enn 5 kb)10,11, effektiv spre inkludert syncytia formasjon og høy immunogenisitet12. Derfor OV plattformer basert på Hjørnetann distemper virus13, kusma virus14, Newcastle sykdom virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518og Tupaia paramyxovirus19 har blitt utviklet. Mest fremtredende, live dempes meslinger viruset vaksine stammer (MV) har kommet i preklinisk og klinisk utvikling20,21. Disse viruset stammer har blitt brukt i flere tiår for rutinen immunisering med en utmerket sikkerhet posten22. Dessuten, det er ingen risiko for insertional mutagenese på grunn av strengt cytosolic replikering av paramyxoviruses. Et allsidig omvendt genetikk system basert på anti-genomic cDNA som tillater innsetting av effekter av transgener i flere transkripsjon enheter (ATUs) er tilgjengelig11,23,24. MV vektorer koding natrium-iodide symporter (MV-NIS) for bildebehandling og strålebehandling eller løselig carcinoembryonic antigen (MV-CEA) som et surrogat markør for viral genuttrykk er som blir evaluert i kliniske forsøk (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 og NCT00408590). Sikker administrasjon har blitt bekreftet og tilfeller av anti-tumor effekten har blitt rapportert i forrige studier25,26,27,28,29, 30 (anmeldt av Msaouel et al.31), banet veien for ytterligere kan meslinger virus som er utviklet og testet preklinisk. MV koding immunmodulerende molekyler målretting ulike trinn av kreft-immunitet syklusen har vist seg å forsinke tumor vekst eller forlenge overlevelse i mus, med bevis for immun-mediert effekt og langsiktig beskyttende immun minne i syngeneic musen modeller. Vektor-kodet effekter av transgener inkluderer granulocytt-macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF)32,33, H. pylori nøytrofile-aktivere protein34, immun checkpoint hemmere35, interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37og BTEs38, som en svulst-link overflateantigen med CD3 og dermed indusere anti-svulst aktivitet av polyklonale T-celler, uavhengig av T celle reseptor spesifisitet og co-stimulering ( Figur 1). Lovende prekliniske resultatene for disse konstruksjoner etterspørsel ytterligere translasjonsforskning innsats.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), en type jeg herpes simplex virus koding GM-CSF, er den eneste kan terapeutiske godkjent av USA Food, Drug Administration (FDA) og europeiske Legemidler Agency (EMA). Fase III studien fører til godkjenninger i slutten 2015 har ikke bare vist effekt på stedet av intra-tumoral injeksjon, men også abscopal effekter (dvs. forbedringer av ikke-injisert lesjoner) i avansert melanom39. T-VEC har siden kommet ytterligere forsøk for programmet i andre svulst enheter (f.eks, ikke-melanom hudkreft, NCT03458117, bukspyttkjertelkreft, NCT03086642) og evaluering av kombinasjon terapier, spesielt med immun checkpoint hemmere (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 og Ribas et al.40).
Dette viser ikke bare potensialet i kan immunterapi, men også behov for videre forskning åidentifisere overlegen kombinasjoner av overtid og immunomodulation. Rasjonell utformingen av flere vektorer og deres utvikling for prekliniske tester er nøkkelen til dette prosjektet. Dette vil også fremme forståelse av underliggende mekanismene har implikasjoner for utviklingen mot mer personlig kreftbehandling. Dette presenterer denne publikasjonen metodikken for endring og utvikling av paramyxoviruses for målrettet kreft immunterapi og, mer spesifikt, kan meslinger virus koding T celle engasjerende antistoffer (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Vellykket kreft immunterapi har potensial til å oppnå langsiktig svulst kontroll. Til tross for siste klinisk suksess, er det fortsatt et presserende behov for sikker og effektiv terapi skreddersydd til individuelle svulst immun profiler. Kan virus aktiverer induksjon av anti-tumor immunreaksjoner samt svulst-begrenset genuttrykk. Denne protokollen beskriver generasjon og ex vivo analyse av immunmodulerende kan vektorer. Fokusere på meslinger vaksine virus koding bispecific T celle engagers som et eksempel, kan generelle metodikken tilpasses til andre virus arter og effekter av transgener. Presentert arbeidsflyten inkluderer design, kloning, redning og overføring av rekombinant virus. Analyser analysere replikasjon kinetikk og lytisk aktivitet av vektoren og funksjonaliteten til den isolerte immunomodulator ex vivo er inkludert, dermed tilrettelegge generering av romanen agenter for videre utvikling i preklinisk modeller og til slutt klinisk oversettelse.

Figur 1 illustrerer virkningsmekanismen kan meslinger virus koding bispecific T celle engagers. Et flytskjema som viser arbeidsflyten for denne protokollen vises i figur 2. Figur 3 viser et eksempel på en modifisert kan meslinger viruset genomet. Dette gir en visuell fremstilling av de bestemte endringene gjelder meslinger viruset anti-genom og bestemt funksjonene i innsatte effekt...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Denne protokollen beskriver en detaljert arbeidsflyt for generering og ex vivo karakterisering av kan virus for uttrykk for immunomodulators, ved hjelp av meslinger virus koding bispecific T celle engagers som et eksempel. Programmet og tilpasning til andre vektor plattformer og effekter av transgener vil akselerere utviklingen av romanen immunovirotherapeutics for klinisk oversettelse.

Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Denne metoden kan bidra til å løse viktige utfordringer innen kreftimmunterapi ved å legge til rette for utvikling av onkolyktiske vektorer for målrettet immunmodulering. Den største fordelen med det anvendte omvendte genetiske systemet er dens allsidighet;derfor kan vektorer tilpasses for å løse ulike forskningsspørsmål og målrette svulster med ulike immunsignaturer. Virusforplantningstrinnene som spesielt bestemmer det optimale tidspunktet for å høste virus, er vanskelig å lære av en tekstprotokoll fordi syncytia-formasjon må vurderes visuelt over tid.For å begynne design og klone rekombinant immunmodulerende vektorer som beskrevet i manuskriptet. Denne protokollen beskriver spesifikke trinn for utvikling av en onkolytisk meslingvaksinevektor, koding av en bispesifikk T-celle engasjerer. For å redde meslingvirus fra cDNA, 24 timer før transfection plate meslinger virus produsent celler jevnt på en 6 veggplate.Seed 200, 000 celler i 2 milliliter DMEM inneholder 10 prosent FBS per brønn for å oppnå 65 til 75 prosent samløpet på tidspunktet for transfection. Bland 5 mikrogram rekombinant DNA-koding av meslingvirusantigenomet som skal brukes til å transfisere cellene. Passende plasmider og en fluorescerende reporter i et totalt volum på 200 mikroliter DMEM.Tilsett 18,6 mikroliter med liposomal transfeksjonsreagens til blandingen og knips umiddelbart røret for å blande. Inkuber denne transfeksjonsblandingen i 25 minutter ved romtemperatur. For å transfisere MV produsent cellene fjerne mediet fra 6 godt plate vokst til 65 til 75 prosent samløpet og legge til 1,8 milliliter DMEM med 2 prosent FBS og 50 mikrogram per milliliter Kanamycin per brønn.Tilsett deretter transfection mix dropwise til hver brønn og virvle forsiktig. Inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid. På neste dag erstatte mediet med 2 milliliter frisk DMEM med 2 prosent FBS og 50 mikrogram per milliliter Kanamycin og gjenta dette når mediet blir surt anerkjent av den gule fargen.Bruk et mikroskop til å observere celler daglig for reportergenuttrykk og syncytia-dannelse. Når store syncytia bestående av 20 eller flere celler er synlige eller når cellene blir for tett høste viruset. 24 timer før den forventede høstfrø ca 1,5 millioner MV produsentceller i 12 milliliter DMEM med 10 prosent FBS på 10 centimeter retter for å oppnå 65 til 75 prosent samløpet på tidspunktet for virus inokulasjon.For å samle viruset progyny bruk en celle skrape for å forsiktig skrape tilhengerceller fra 6 veggplate med trans infiserte celler. Overfør mediet som inneholder de skrapte cellene til et sentrifugerør. Sentrifuge i minst 2500 ganger G og 4 grader Celsius i 5 minutter for å fjerne celleavfall.Etter sentrifugering bland den cellefrie supernatanten med serumfritt medium til et endelig volum på 4 milliliter for å forberede inokulum. Fjern mediet fra 10 centimeter parabolen med MV produsentceller og legg inoculum til cellene. Inkuber i minst 2 timer ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid.Etter inkubasjon legge til 6 milliliter DMEM med 10 prosent FBS og inkubere celler over natten. Deretter erstatte mediet med 12 milliliter fersk DMEM med 10 prosent FBS og inkubere ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid til høsting. Vær oppmerksom på cellene minst to ganger daglig.Før syncytia briste når membranavbrudd blir synlig høste viruset. For å høste den første passasjen, fjern supernatant fra platen og tilsett 600 mikroliter serumfritt medium. Bruk deretter en celleløfter til å skrape cellene og overføre til et rent rør.Umiddelbart etter at fryse viruset suspensjon i flytende nitrogen og lagre på 80 grader Celsius i minst 24 timer for å sikre grundig frysing. For å bestemme titers av virus aksjer i octuplicates per aliquot ved hjelp av 96 veggplater. Trekk først produsentcellene fra T75 cellekulturflasker inn i 50 milliliter konisk rør.Telle cellene og justere celle suspensjon til 150,000 celler per milliliter i DMEM med 10 prosent FBS. Tilsett 90 mikroliter DMEM med 10 prosent FBS per brønn av en 96 veggplate. Deretter legger du til 10 mikroliter fra en aliquot av viruslageret til alle 8 brønner i den første kolonnen på platen.Bland godt ved å pipetter opp og ned minst 10 ganger. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 10 mikroliter av hver brønn, fra den første til den andre kolonnen, og bland godt ved å pipetter opp og ned. Gjenta dette for hver kolonne for å oppnå serielle tidoblet fortynninger av viruset ved hjelp av friske pipettespisser for hvert fortynningstrinn.Kast 10 mikroliter fra hver brønn i den siste kolonnen. Legg til 100 mikroliter cellesuspensjon med 150 000 celler per milliliter til hver brønn, og sørg for at det ikke er noen celleklumper. Inkuber ved 37 grader Celsius, 5 prosent karbondioksid i 48 timer.Se etter syncytia ved hjelp av et lett mikroskop. Telle syncytia i hver brønn av kolonnen med den høyeste fortynningsfaktoren som inneholder synlig syncytia. For virus som koder en fluorescerende reporter, kan syncytia telles ved hjelp av fluorescensmikroskopi.For analyse av meslinger virus replikering kinetikk en dag før infeksjon frø 100, 000 vero celler i 1 milliliter DMEM med 10 prosent FBS per brønn på 12 veggplater med minst 2 brønner for hver tidspunkt av interesse. For å infisere cellene erstatte mediet med 300 mikroliter serumfritt medium som inneholder den respektive mengden av viruset. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid i minst 2 timer.Fjern inoculum og tilsett 1 milliliter DMEM med 10 prosent FBS og fortsett inkubasjonen. På relevante tidspunkter etter infeksjon høste viral progyny ved å direkte skrape celler inn i mediet. Overfør innhold fra hver brønn til et enkelt rør.Snap fryse i flytende nitrogen og lagre på 80 grader Celsius til titrering og deretter fortsette som beskrevet i manuskriptet. For å begynne evalueringen av BTE indusert cellemediert cytotoksisitet ved LDH-utgivelse, må du først isolere utskillede transgenprodukter uttrykt av virusinfiserte målceller og isolere immuneffektorceller som beskrevet i manuskriptet. Deretter frø målceller i en U-bunn 96 veggplate og inkludere prøver som beskrevet i manuskriptet.Tilsett tidligere isolerte immunmodulatorer ved ønskede konsentrasjoner til de respektive prøvene. Tilsett immunavhopperceller ved ønskede forholdstall og tilsett medium til et totalt volum på 100 mikroliter per brønn. Inkuber for de ønskede tidligere bestemte tidsrammene ved 37 grader Celsius og 5 prosent karbondioksid.45 minutter før prøveinnsamlingen legger til 10 mikroliter 10X Lysis-løsning i brønner som inneholder T max-prøver og tilsvarende mediumkontroller og fortsetter inkubasjonen. Sentrifuger cellene ved 250 ganger G i 4 minutter. Overfør 50 mikroliter supernatant fra hver brønn til brønner av en flat bunn 96 veggplate, og pass på at du ikke overfører cellene.Etter å ha forberedt substratløsning i henhold til produsenten, legg til 50 mikroliter til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 30 minutter eller til T max prøver blir dype røde. Etter inkubasjon tilsett 50 mikroliter stoppløsning til hver brønn.Sentrifuge i 1 minutt ved 4000 ganger G og bruk deretter en uthult nål for å fjerne luftbobler. Mål optisk absorbans ved 490 nanometer og beregn som beskrevet i manuskriptet. Etter inokulasjon med uendret og BTE koding onkolytiske meslinger virus vekst kurver av sammenlignet vektorer på vero celler vises lik.Celle levedyktighet kurver på mc38 murine kolorektal karsinom celler stabilt uttrykker menneskelig karsinobryonic antigen og MV reseptorer CD46 etter inokulasjon viser at lytisk aktivitet av transgen koding viruset henger etter i murine tumor celle linje. Flow cytometri av målantigen uttrykke celler inkubert med BTE's ved fem forskjellige fortynninger viste BTE binding av celler på en konsentrasjonsavhengig måte. I immunoblot etter magnetisk nedtrekk av BTE tilknyttede celler viste at når ikke målretting BTE ble brukt var det ingen påviselige mengder celler;mens når målretting BTE prøver ble brukt bundet celler var til stede i elution brøksjon.BTE mediert målantigenspesifikk og konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet av murine T-celler indikeres ved representativ LDH-frigjøringsanalyse og viser at i det nåværende eksempelet ble 15 prosent spesifikt celledrap oppnådd ved en relativt høy BTE-konsentrasjon på 1 mikrogram per milliliter sammenlignet med referanseceller. Mens du prøver denne prosedyren, Er det viktig å huske å regelmessig overvåke celler for å sjekke utviklingen av infeksjon. Ikke glem at rekombinante meslingvaksinestammer, selv om de dempes, kan være farlige, spesielt for immunsupprimerte individer.Unngå eksponering ved å følge de riktige biosikkerhetsprosedyrene. Personer som håndterer virus bør vaksineres før de utfører disse metodene. Etter denne prosedyren kan viralt uttrykk for ytterligere transgener oppnås for å analysere virusverter interaksjoner og terapeutiske effekter.Utviklingen av disse teknikkene har banet vei for forskere innen bioterapi for å utforske effekten av lokalt uttrykte immunmodulatorer i mange tumorrike enheter;In Vitro, In Vivo, og også i kliniske studier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-Medierte baseredigerere

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice-modell for å studere og målrette brystkreft hjerne metastatisk tumorvekst

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering av in vivo antitumoraktivitet av polyanhydrid IL-1a nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definere genfunksjoner i tumorigenese ved ex vivo ablasjon av floxede alleler i ondartede perifere nerveskjede tumorceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Opprettholde humant glioblastom cellulært mangfold ex vivo ved bruk av tredimensjonal organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Eks Vivo Organoid modell av Adenovirus-Cre medierte genslettinger i mus urotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...