Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Esses métodos foram estabelecidos no grupo Virotherapy, liderado pelo Prof Dr. Dr. Guy Ungerechts no centro nacional para doenças tumorais em Heidelberg. Estamos em dívida para com ele e todos os membros da equipe do laboratório, especialmente Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Este trabalho foi apoiado pela outra Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 ao C.E. Engelen) e Fundação de ciência nacional alemã (DFG, conceder EN 1119/2-1 ao C.E. Engelen). J.P.W. Heidbuechel recebe um estipêndio pela escola de pós-graduação Internacional de Helmholtz para pesquisa do câncer.

Nota: [O], [P] e [M] indicar aplicáveis às subseções: OVs, em geral, (a maioria) paramyxoviruses ou MV, respectivamente. [B] indica seções específicas para BTE transgenes.
1 clonagem de Transgenes imunomodulador-codificação em vetores de vírus do sarampo
<ol><li>
[O] design Insira a sequência.
	<ol>
<li>[O] decidir sobre um imunomodulador de interesse com base na pesquisa de literatura ou em dados exploratórios como telas genética<sup class="xre...

Oncolíticos imunoterapia (i. e., OVT em combinação com imunomodulação) é uma grande promessa para tratamento de câncer, exigindo ainda mais desenvolvimento e otimização de vírus Oncolíticos codificação immunomodulatory proteínas. Este protocolo descreve métodos para gerar e validar tais vetores para testes subsequentes em modelos pré-clínicos relevantes e potencial futura tradução clínica em novela terapêutica anticâncer.
Inúmeras plataformas de vírus Oncolíti...

Vírus Oncolíticos (OVs) estão sendo desenvolvidos como terapêutica anticâncer que especificamente replicar dentro e matar as células do tumor, deixando os tecidos saudáveis intactas. Tornou-se comum de entendimento que virotherapy Oncolíticos (OVT), na maioria dos casos, não depende unicamente da lise completa tumor por replicação eficiente e propagação do vírus, mas requer mecanismos adicionais de ação para o sucesso do tratamento, incluindo vascular e do estroma direcionamento e, importante, estimulação imune1,2,3,4. Enquanto muitos estudos iniciais de OV usado sem modificações de vírus, pesquisa atual lucrou com um biológico melhorado compreensão, biobancos de vírus que potencialmente contêm romance OVs e as possibilidades oferecidas pela engenharia genética para criar OV avançado plataformas de6,5,7.
Tendo em conta o recente sucesso da imunoterapia, imunomodulador transgenes são de particular interesse sobre a engenharia genética de OVs. Expressão alvo desses produtos do gene por células tumorais OV infectadas reduz toxicidade comparada a administração sistémica. Segmentação é conseguido usando vírus com oncoselectivity inerente ou modificando o tropismo viral8. Imunomodulação local aprimora os mecanismos de anti-tumor multi-facetada de OVT. Além disso, esta estratégia é instrumental em interrogar a interação entre vírus, células tumorais e o sistema imunológico do hospedeiro. Para este fim, este protocolo fornece um fluxo de trabalho aplicável e ajustável para projetar, clonar, resgatar, propagar e validar Oncolíticos vetores de paramixovírus (especificamente vírus do sarampo) codificação tais transgenes.
Modulação da resposta imune pode ser alcançada por uma grande variedade de produtos de transgene como alvo diferentes passos do câncer-imunidade ciclo9, incluindo a reforçar o reconhecimento do antígeno de tumor [por exemplo, antígenos tumor-associado (TAAs) ou indutores de complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas] ao longo de maturação de células dendríticas de apoio para apresentação de antigénios eficiente (citocinas); recrutamento e ativação de células imunes desejadas como citotóxicas e auxiliar T células [quimiocinas, participantes de célula T de bispecific (BTEs)]; segmentação supressivas células tais como pilhas de T reguladoras, células supressoras mieloide-derivado, tumor-associado de macrófagos e fibroblastos associada a câncer (anticorpos, BTEs, citocinas); e prevenção da inibição de células efetoras e exaustão (inibidores de ponto de verificação). Assim, uma infinidade de agentes biológicos está disponível. Avaliação de tais vírus codificado imunomoduladores em relação a eficácia terapêutica e as sinergias possíveis, bem como a compreensão dos respectivos mecanismos é necessária melhorar a terapia do câncer.
Vírus de RNA sentido negativo single-stranded da família Paramyxoviridae caracterizam-se por várias características favoráveis ao seu uso como Oncolíticos vetores. Estes incluem um oncotropism natural, grande capacidade genômica de transgenes (mais de 5KB)10,11, eficiente propagação incluindo formação de citoplasma e alta imunogenicidade12. Portanto, plataformas OV baseadas na cinomose vírus13, caxumba vírus14, doença de Newcastle vírus15, vírus Sendai16,17, simian virus 518e Tupaia paramixovírus19 têm sido desenvolvidos. Viva mais proeminente, vacina de vírus atenuado do sarampo cepas (MV) progrediram em desenvolvimento pré-clínico e clínico20,21. Estas estirpes de vírus têm sido utilizados há décadas para a imunização de rotina com uma segurança excelente registro22. Além disso, não há nenhum risco de mutagênese insercional devido a replicação estritamente citosólica do paramyxoviruses. Um sistema de genética reversa versátil baseado em antigenômica do cDNA que permite a inserção dos transgenes em unidades adicionais de transcrição (ADO) é disponível11,23,24. Vetores de MV codificação-iodeto de sódio symporter (MV-NIS) para geração de imagens e radioterapia ou antígeno carcinoembryonic solúvel (MV-CEA) como um marcador substituto para expressão gênica viral atualmente estão sendo avaliados em ensaios clínicos (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 e NCT00408590). Administração de segura tenha sido confirmada e foram notificados casos de eficácia anti-tumoral em anteriores estudos25,26,,27,28,29, 30 (revisado por Msaouel et al.31), abrindo caminho para o vírus do sarampo Oncolíticos adicionais que foram desenvolvidos e testados pré-clínicos. MV codificação immunomodulatory moléculas alvo diversas etapas do ciclo de câncer-imunidade têm sido mostradas para atrasar o crescimento do tumor e/ou prolongar a sobrevivência em ratos, com evidências de eficácia imune-mediada e a longo prazo memória imunológica protetora em syngeneic modelos do rato. Vector-codificado transgenes incluem colônia de Granulócito-macrófago factor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrófilos-ativando proteína34, inibidores de checkpoint imune35, Interleucina-12 (IL-12)36, TAAs37e BTEs38, que um antígeno de superfície do tumor com CD3 cross-link e, assim, induzir a atividade antitumoral por pilhas de T policlonais, independentemente do receptor de células T especificidade e estimulação co ( A Figura 1). Os resultados promissores pré-clínicos obtidos para essas construções ainda mais esforços translacional de demanda.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), um tipo vírus de herpes simples codificação GM-CSF, é o único Oncolíticos terapêutico aprovado pelo Estados Unidos, Food e Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA). O estudo de fase III levando a aprovações no final 2015 não mostrou apenas eficácia no local da injeção intra-tumoral, mas também efeitos de abscopal (ou seja, a remissão das lesões não injectada) melanoma avançado39. T-VEC entrou desde ensaios adicionais para aplicação em outras entidades do tumor (por exemplo, câncer de pele não-melanoma de, , NCT03458117; câncer de pâncreas, NCT03086642) e para avaliação de terapias de combinação, especialmente com o posto de controle imune inibidores (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 e Ribas et al.40).
Isso demonstra não apenas o potencial da imunoterapia Oncolíticos, mas também a necessidade de mais pesquisas identificar combinações superiores de OVT e imunomodulação. Projeto racional de vetores adicionais e seu desenvolvimento para testes pré-clínicos é a chave para esta empresa. Isto também vai avançar a compreensão dos mecanismos subjacentes e tem implicações para a progressão para o tratamento de câncer mais personalizado. Para este fim, esta publicação apresenta a metodologia para a modificação e o desenvolvimento do paramyxoviruses para imunoterapia específica e, mais especificamente, do vírus de sarampo Oncolíticos codificação de célula T-engajar-se anticorpos (Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Bem sucedida imunoterapia tem potencial para alcançar controle de tumor a longo prazo. Apesar dos sucessos clínicos recentes, ainda há uma necessidade urgente de terapias seguras e eficazes, adaptados para imune perfis individuais do tumor. Vírus Oncolíticos permitem a indução de respostas imunes de anti-tumor, bem como a expressão do gene tumor restrito. Este protocolo descreve a geração e ex vivo análise de imunomoduladores Oncolíticos vetores. Enfocando o vírus de sarampo vacina codificação participantes de célula T bispecific como exemplo, a metodologia geral pode ser adaptada para outras espécies de vírus e transgenes. O fluxo de trabalho apresentado inclui o projeto, clonagem, resgate e propagação de vírus recombinantes. Ensaios para analisar a cinética de replicação e atividade lítica do vetor, bem como a funcionalidade do imunomodulador isolado ex vivo são incluídos, facilitando assim a geração de novos agentes para o desenvolvimento em modelos pré-clínicos e, finalmente, Tradução clínica.

A Figura 1 ilustra o mecanismo de ação do vírus de sarampo Oncolíticos codificação bispecific célula T participantes. Um fluxograma descrevendo o fluxo de trabalho do presente protocolo é apresentado na Figura 2. A Figura 3 mostra um exemplo de um genoma do vírus de sarampo Oncolíticos modificados. Isso fornece uma representação visual das mudanças específicas aplicada...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Este método pode ajudar a enfrentar os principais desafios no campo da imunoterapia contra o câncer, facilitando o desenvolvimento de vetores oncolíticos para imunomodulação direcionada. A principal vantagem do sistema genético reverso aplicado é sua versatilidade;portanto, vetores podem ser adaptados para abordar várias questões de pesquisa e tumores alvo com diversas assinaturas imunológicas. As etapas de propagação do vírus especialmente determinando o ponto de tempo ideal para o vírus da colheita são difíceis de aprender a partir de um protocolo de texto, pois a formação de sincronia deve ser avaliada visualmente ao longo do tempo.Para começar o projeto e clonar vetores imunomodulatórios recombinantes como descrito no manuscrito. Este protocolo descreve etapas específicas para o desenvolvimento de um vetor de vacina contra o sarampo oncolítico, codificando um engajador de células T bisespecífico. Para resgatar o vírus do sarampo do CDNA, 24 horas antes da placa de transfecção do vírus do sarampo, as células produtoras de vírus do sarampo estão uniformemente em uma placa de parede 6.Sementes 200.000 células em 2 mililitros DMEM contendo 10% de FBS por poço para atingir 65 a 75% de confluência no momento da transfecção. Misture 5 microgramas de DNA recombinante codificando o antígeno do vírus do sarampo que será usado para transfetar as células. Plasmídeos apropriados e um repórter fluorescente em um volume total de 200 microliters de DMEM.Adicione 18,6 microliters de reagente de transfecção liposômica à mistura e imediatamente aperte o tubo para misturar. Incubar esta mistura de transfecção por 25 minutos à temperatura ambiente. Para transfetar as células produtoras de MV, remova o meio da placa de 6 poços cultivada para 65 a 75% de confluência e adicione 1,8 mililitros de DMEM com 2% de FBS e 50 microgramas por mililitro Kanamycin por poço.Em seguida, adicione a mistura de transfecção dropwise a cada poço e gire cuidadosamente. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte substitua o meio por 2 mililitros de DMEM frescos por 2% de FBS e 50 microgramas por mililitro Kanamycin e repita isso quando o meio se tornar ácido reconhecido pela cor amarela.Use um microscópio para observar células diariamente para a expressão genética do repórter e a formação de sincronia. Quando uma grande sincronia composta por 20 ou mais células são visíveis ou quando as células se tornam muito densas, o vírus. 24 horas antes da colheita antecipada, cerca de 1,5 milhão de células produtoras de MV em 12 mililitros de DMEM com 10% de FBS em pratos de 10 centímetros para alcançar 65 a 75% de confluência no momento da inoculação do vírus.Para coletar o vírus progyny use um raspador de células para raspar cuidadosamente células produtoras aderentes da placa de parede 6 com células transfectadas. Transfira o meio contendo as células raspadas em um tubo de centrífuga. Centrífuga por pelo menos 2500 vezes G e 4 graus Celsius por 5 minutos para remover detritos celulares.Após a centrifugação misture o supernaente sem células com meio livre de soro a um volume final de 4 mililitros para preparar o inóculo. Remova o meio da antena de 10 centímetros com células produtoras de MV e adicione o inóculo às células. Incubar por pelo menos 2 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após a incubação adicione 6 mililitros de DMEM com 10% de FBS e incubar células durante a noite. Em seguida, substitua o meio por 12 mililitros de DMEM fresco por 10% de FBS e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até a colheita. Observe as células pelo menos duas vezes por dia.Antes da sincronia estourar quando a interrupção da membrana se torna visível, o vírus. Para colher a primeira passagem remova o supernascer da placa e adicione 600 microliters de meio livre de soro. Em seguida, use um levantador de células para raspar as células e transferir para um tubo limpo.Imediatamente depois disso congele a suspensão do vírus em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas para garantir o congelamento completo. Para determinar os titulantes dos estoques de vírus em octuplicates por alíquota usando 96 placas de parede. Primeiro puxe as células produtoras da cultura celular T75 em tubo cônico de 50 mililitros.Conte as células e ajuste a suspensão celular para 150.000 células por mililitro no DMEM com 10% de FBS. Adicione 90 microliters de DMEM com 10% de FBS por poço de uma placa de parede de 96. Em seguida, adicione 10 microliters de uma alíquota do estoque do vírus a todos os 8 poços na primeira coluna da placa.Misture bem por pipetar para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Use uma pipeta multicanal para transferir 10 microliters de cada poço, da primeira à segunda coluna, e misture bem por pipetar para cima e para baixo. Repita isso para cada coluna para obter diluições em série dez vezes do vírus usando pontas de pipeta frescas para cada etapa de diluição.Descarte 10 microliters de cada poço da última coluna. Adicione 100 microliters de suspensão celular com 150.000 células por mililitro para cada poço certificando-se de que não há aglomerados celulares. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 horas.Verifique se há sincronia usando um microscópio leve. Conte sincronia em cada poço da coluna com o maior fator de diluição contendo siníntia visível. Para vírus que codificam um repórter fluorescente, a sincronia pode ser contada usando microscopia de fluorescência.Para análise da cinética de replicação do vírus do sarampo um dia antes da infecção, 100.000 células vero em 1 mililitro de DMEM com 10% de FBS por poço em 12 placas de parede com pelo menos 2 poços para cada ponto de interesse. Para infectar as células substitua o meio por 300 microliters de meio livre de soro contendo a respectiva quantidade do vírus. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 2 horas.Remova o inóculo e adicione 1 mililitro de DMEM com 10% de FBS e continue a incubação. Em momentos relevantes, após a infecção, a colheita da proginia viral raspa diretamente as células no meio. Transfira o conteúdo de cada poço para um tubo individual.Encaixe o congelamento em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius até a titulação e, em seguida, prossiga como descrito no manuscrito. Para iniciar a avaliação da citotoxicidade mediada por células induzidas pelo BTE pela liberação do LDH, primeiro isole produtos transgenes secretados expressos por células-alvo infectadas pelo vírus e isole células-efeitos imunológicos como descrito no manuscrito. Em seguida, células-alvo de sementes em uma placa de parede u-bottom 96 e incluem amostras como descrito no manuscrito.Adicione imunomoduladores previamente isolados nas concentrações desejadas às respectivas amostras. Adicione células desertoras imunológicas nas razões desejadas e adicione o meio a um volume total de 100 microliters por poço. Incubar para os prazos previamente determinados desejados a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.45 minutos antes da coleta de amostras adicionar 10 microliters de 10X Lysis Solution a poços contendo amostras T max e os controles médios correspondentes e continuar a incubação. Centrifugar as células a 250 vezes G por 4 minutos. Transfira 50 microliters de supernascer de cada poço para poços de uma placa de parede fundo plano 96 certificando-se de não transferir as células.Depois de preparar a solução de substrato de acordo com o fabricante adicione 50 microliters a cada poço. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos ou até que as amostras de T max se transformem em vermelho profundo. Após a incubação adicione 50 microliters de solução stop a cada poço.Centrifugar por 1 minuto a 4000 vezes G e, em seguida, usar uma agulha oca para remover bolhas de ar. Meça a absorvância óptica em 490 nanômetros e calcule conforme descrito no manuscrito. Após a inoculação com vírus de sarampo não modificados e BTE codificação oncolítico, as curvas de crescimento dos vetores comparados em células vero parecem semelhantes.Curvas de viabilidade celular em células de carcinoma colorretal de 38 murinas expressando o antígeno carcinomínico humano e os receptores MV CD46 após a inoculação mostram que a atividade lírica do vírus de codificação transgene fica para trás na linha celular do tumor murine. A citometria de fluxo de células expressas de antígeno alvo incubadas com BTE's em cinco diluições diferentes mostrou ligação BTE por células de forma dependente da concentração. No imunobloto após a retirada magnética das células associadas ao BTE mostrou que, quando foram utilizadas bte's não direcionadas, não havia quantidades detectáveis de células;enquanto que ao atingir amostras de BTE eram utilizadas células ligadas estavam presentes na fração de elução.O antígeno específico e dependente de concentração de células murinas T é indicado pelo ensaio de liberação representativo do LDH e mostra que, no presente exemplo, 15% de mortes celulares específicas foram alcançadas a uma concentração de BTE relativamente alta de 1 micrograma por mililitro em comparação com as células de referência. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de monitorar regularmente as células para verificar a progressão da infecção. Não se esqueça que as cepas de vacinas contra o sarampo recombinante embora atenuadas podem ser perigosas especialmente para indivíduos imuno-suprimidos.Evite a exposição seguindo os procedimentos de bio segurança adequados. Os indivíduos que manuseam vírus devem ser vacinados antes de realizar esses métodos. Após este procedimento, a expressão viral de mais transgenes pode ser alcançada a fim de analisar as interações e efeitos terapêuticos dos hospedeiros do vírus.O desenvolvimento dessas técnicas abriu caminho para pesquisadores do campo da bioterapia explorarem os efeitos de imunomoduladores expressos localmente em inúmeras entidades tumorais;In Vitro, In Vivo, e também em ensaios clínicos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Pesquisa do câncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definindo funções genéticas em Tumorigênese por Ex vivo Ablaation of Floxed Alleles in Maligna Periférico Nerve Hemato Tumor Cells

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...