Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Эти методы были установлены в группе Виротерапии, возглавляемая Проф д-р д-р Ги Ungerechts в национальном центре опухолевых болезней в Гейдельберге. Мы признательны ему и всем членам группы лаборатории, особенно спек Тобиас доктор, доктор Rūta Veinalde, Джудит Förster, Биргит Hoyler и Джессика Альберт. Эта работа была поддержана, остальное Kröner-Fresenius-Stiftung (Грант 2015_A78 до н.э. Engeland) и немецкий Национальный научный фонд (DFG, Грант EN 1119/2-1 до н.э. Engeland). J.P.W. Heidbuechel получает стипендию, Гельмгольца Международная высшая школа для исследований рака.

Примечание: [O], [P] и [М] указывают подразделов, применимые к: OVs, в целом, (большинство) Парамиксовирусы или MV только, соответственно. [B] указывает конкретные разделы для Заушных трансгенов.
1 клонирование иммуномодулятор кодирования трансгенов в векторы вирус кори...

Иммунотерапия онколитического (т.е.., ОВТ в сочетании с иммуномодуляция) имеет большие перспективы для лечения рака, требуют дальнейшего развития и оптимизации онколитического вирусов кодирования иммуномодулирующих белков. Этот протокол описывает методы для создания и проверки ?...

Онколитического вирусы (ОВС) разрабатываются как против рака терапии, что конкретно реплицировать в пределах и убить опухолевые клетки, оставляя нетронутыми здоровые ткани. Это сейчас стало общее понимание что онколитического Виротерапии (ОВТ), в большинстве случаев, не полагаться исключительно на распад опухоли полной эффективности репликации и распространение вируса, но требует дополнительных механизмов действий, для успеха лечения, включая сосудистой и стромальных ориентации и, главное, стимуляции иммунной1,2,3,4. Хотя многие ранние исследования ов используется неизмененное вирусов, текущие исследования выгоду от улучшения биологических, понимание, вирус биобанках, что потенциально содержат Роман OVs и возможности, предоставляемые генной инженерии для создания передовых OV платформы5,6,7.
Учитывая недавний успех иммунотерапия, иммуномодулирующих трансгенов представляют особый интерес о генной инженерии OVs. Целевые выражение такого гена продукции OV-инфицированных опухолевых клеток снижает токсичность, по сравнению с системного администрирования. Таргетинг достигается с помощью вирусов с присущие oncoselectivity или изменяя вирусный тропизм8. Местные иммуномодуляция повышает многогранный механизмы противоопухолевого ОВТ. Кроме того эта стратегия играет важную роль в опрашивания взаимодействие между вирусов, опухолевых клеток и иммунной системе хоста. С этой целью этот протокол обеспечивает применимым и регулируемый рабочий процесс проектирования, клонировать, спасение, распространять и проверить онколитического парамиксовирус (специально вирус кори) векторы кодирования такие трансгенов.
Модуляции иммунного ответа может быть достигнуто путем широкий спектр продукции трансген, ориентация различные этапы рака иммунитет цикла9, включая укрепление опухолевые антигены [например, опухольассоциированных антигенов (ТААС) или индукторов из комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул] над поддержкой дендритные клетки созревания для презентации эффективного антигена (цитокинов); Рекрутинг и такие как активация желаемого иммунные клетки цитотоксическим и вспомогательные Т-клеток [chemokines, bispecific Ингейджер Т-клеток (BTEs)]; ориентация подавляющие клетки, такие как регулирования T-клетки, клетки миелоидного производные супрессор, связанный тумором макрофагов и связанных рака фибробластов (антител, BTEs, цитокинов); и предотвращение эффекторных клеток торможение и истощения (ингибиторы контрольно-пропускного пункта). Таким образом имеется множество биологических агентов. Оценка таких вирусов кодировке иммуномодуляторов о терапевтической эффективности и возможного синергизма, а также понимания соответствующих механизмов необходимо усовершенствовать терапии рака.
Негативном смысле одноцепочечной РНК-вирусов Paramyxoviridae семьи были характерны несколько функций способствуют их использования как онколитического векторов. К ним относятся природные oncotropism, большой геномной емкости для трансгенов (более 5 КБ)10,11, эффективного распространения, включая syncytia формирования и высокую иммуногенность12. Таким образом OV платформы, основанные на плотоядных вирус13, паротита вирус14, вирус болезни Ньюкасла15, Сэндай вирус16,17, обезьяний вирус 518и Tupaia парамиксовирус19 были разработаны. Наиболее заметно живой аттенуированной вакцины от кори вирус вакцины штаммов (MV) продвинулись в доклинической и клинической разработки20,21. Эти штаммы вируса были использованы на протяжении десятилетий для плановой иммунизации с отличным безопасности записи22. Кроме того нет никакого риска для инсерционному мутагенезу благодаря строго цитозольной репликации парамиксовирусы. Универсальный обратной генетики система, основанная на анти геномной cDNA, который позволяет для вставки трансгенов в дополнительных транскрипции единиц (АТУС) является наличие11,23,24. MV векторов кодирования Симпорт йодистого натрия (MV-ННГ) для изображений и радиотерапии или растворимые раковоэмбрионального антиген (MV-Сеа) как суррогат маркера для экспрессии вирусных генов в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 и NCT00408590). Безопасное управление было подтверждено и эффективности противоопухолевой были случаи в предыдущих исследованиях25,26,27,28,29, 30 (обзор Msaouel et др.31), проложив путь для дополнительных онколитического Кори вирусов, которые были разработаны и испытаны preclinically. MV, кодирование иммуномодулирующих, молекулы, ориентация разнообразные шаги цикла рака иммунитет показали задержки роста опухоли и/или продлить выживание в мышей, с доказательствами для иммунной системы эффективности и долгосрочной защитной иммунной памяти в сингенных модели мыши. Вектор кодировке трансгенов включают гранулоцитарно макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ)32,33, активация нейтрофилов белка пилорусов 34, ингибиторы иммунной контрольно-пропускного пункта35, Интерлейкин-12 (IL-12)36, ТААС37и BTEs38, которые перекрестные ссылки опухоль поверхностного антигена с CD3 и таким образом побудить противоопухолевую активность поликлональных Т-клеток, независимо от того, Т-клеток рецепторов специфичность и Сопредседатель стимуляции ( Рисунок 1). Перспективных доклинические результаты, полученные для этих конструкций спроса дальнейшие поступательные усилия.
Talimogene laherparepvec (Т-VEC), типа я кодирования ГМ-КСФ, вирус простого герпеса является единственным онколитического терапевтический одобрен США продовольствия и медикаментов (FDA) и Европейское агентство лекарственных средств (EMA). Не исследование III фазы, ведущих к утверждения в конце 2015 года только показал эффективность на сайте интра опухолевой инъекции, но и абскопальные эффекты (то есть, ремиссии не вводили поражений) в передовые меланомы39. T-VEC вступил дополнительные испытания для применения в других опухолевых образований (например,, не Меланома кожи рак, NCT03458117; рак поджелудочной железы, NCT03086642) и для оценки комбинированной терапии, особенно с иммунной контрольно-пропускной пункт ингибиторы (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 и Рибас et др.40).
Это демонстрирует не только потенциал иммунотерапия онколитического, но и необходимость дальнейших научных исследований для выявления Улучшенный комбинации ОВТ и имуннокорекция. Рациональная конструкция дополнительных векторов и их развития для доклинических испытаний является ключом к этой деятельности. Это будет также способствовать понимание основных механизмов и имеет последствия для перехода к более персонализированные лечения рака. С этой целью эта публикация представляет методологию для модификации и развития Парамиксовирусы для целевых Рак иммунотерапия и, более конкретно, вирусы Кори онколитического, кодирование Т клеток привлечение антител (рис. 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Успешное Рак иммунотерапия имеет потенциал для достижения долгосрочного управления опухоли. Несмотря на недавние успехи клинической сохраняется настоятельная необходимость для безопасного и эффективного лечения, с учетом индивидуального тумора иммунной профилей. Онколитического вирусов позволяют индукции противоопухолевого иммунного ответа, а также экспрессии генов, опухоль ограничена. Этот протокол описывает поколения и ex vivo анализ иммуномодулирующих онколитического векторов. Сосредоточение внимания на вирусы вакцины кори кодирования bispecific Т-клеток Ингейджер качестве примера, Общая методология может быть адаптирована для других видов вирусов и трансгенов. Представлен рабочий процесс включает в себя дизайн, клонирование, спасения и распространение рекомбинантных вирусов. Анализы для анализа кинетики репликации и литические деятельность вектора, а также функциональных возможностей изолированных иммуномодулятора ex vivo включены, способствуя тем самым поколения Роман агентов для дальнейшего развития в доклинических моделях и в конечном счете Клинические перевод.

Рисунок 1 иллюстрирует механизм действия вирусов Кори онколитического кодирования Ингейджер bispecific Т-клеток. Изображением рабочего процесса этот протокол блок-схема представлена на рисунке 2. На рисунке 3 пока?...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Этот протокол описывает подробный рабочий процесс для поколения и ex vivo характеристика онколитического вирусов для выражения иммуномодуляторов, используя вирусы Кори кодирования bispecific Т-клеток Ингейджер качестве примера. Применение и адаптация для других платформ вектор и трансгенов будет ускорить разработку Роман immunovirotherapeutics для клинических перевода.

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в области иммунотерапии рака, способствуя развитию онколитических векторов для целенаправленной иммуномодуляции. Основным преимуществом применяемой обратной генетической системы является ее универсальность; поэтому векторы могут быть адаптированы для решения различных исследовательских вопросов и нацелены на опухоли с различными иммунными сигнатурами. Шаги распространения вируса, особенно определяющие оптимальную точку времени для сбора вируса, трудно извлечь из текстового протокола, потому что формирование синцитии должно быть оценено визуально с течением времени.Начать проектирование и клонировать рекомбинантные иммуномодулирующих векторов, как описано в рукописи. В этом протоколе описаны конкретные шаги по разработке онколитической вакцины против кори вектор, кодирующий бисспецифический Т-клеточный энкер. Чтобы спасти вирус кори от кДНА, за 24 часа до трансфекции пластины вируса кори производители клеток равномерно на 6-стенной пластине.Семя 200 000 клеток в 2 миллилитров DMEM, содержащих 10 процентов FBS на колодец для достижения 65 до 75 процентов слияния во время трансфекции. Смешайте 5 микрограмм рекомбинантных ДНК, кодирующих антигеном вируса кори, который будет использоваться для трансфектации клеток. Соответствующие плазмиды и флуоресцентный репортер в общем объеме 200 микролитров DMEM.Добавьте в смесь 18,6 микролитров липосомного трансфектального реагента и немедленно слейте трубку, чтобы перемешать. Инкубировать эту смесь трансфекции в течение 25 минут при комнатной температуре. Чтобы заразить клетки производителя MV удалить среду из 6 хорошо пластины выросли до 65 до 75 процентов слияния и добавить 1,8 миллилитров DMEM с 2 процентами FBS и 50 микрограмм на миллилитр Kanamycin на колодец.Затем добавьте смесь трансфекции dropwise к каждому хорошо и вихрем тщательно. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа. На следующий день заменить средний с 2 миллилитров свежего DMEM с 2 процентов FBS и 50 микрограммов на миллилитр Kanamycin и повторить это, когда среда становится кислой признается желтым цветом.Используйте микроскоп для ежедневного наблюдения за клетками для экспрессии генов репортера и формирования синцитии. Когда видна большая синцития, состоящая из 20 или более клеток, или когда клетки становятся слишком плотными, вирус становится слишком плотным. За 24 часа до ожидаемого урожая семян около 1,5 миллиона клеток производителя MV в 12 миллилитров DMEM с 10 процентов FBS на 10 сантиметров блюда для достижения 65 до 75 процентов слияния во время прививки вируса.Для сбора вируса progyny использовать клеточный скребок, чтобы тщательно соскребать адепта клетки производителя из 6 стен пластины с трансфектными клетками. Перенесите среду, содержащую царапинные клетки, в центрифугу. Центрифуга, по крайней мере 2500 раз G и 4 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы удалить клеточный мусор.После центрифугации смешать безклеточный супернатант с сывороткой свободной среды до конечного объема 4 миллилитров для подготовки инокулума. Удалите среду из 10-сантиметровой тарелки с клетками производителя MV и добавьте инокулум в клетки. Инкубация в течение по крайней мере 2 часов при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа.После инкубации добавьте 6 миллилитров DMEM с 10 процентами FBS и инкубировать клетки на ночь. Затем замените среду 12 миллилитров свежего DMEM с 10 процентами FBS и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа до сбора урожая. Наблюдайте за клетками по крайней мере два раза в день.Перед синцитией лопается, когда нарушение мембраны становится видимым урожай вируса. Для сбора первого прохода снимите супернатант с тарелки и добавьте 600 микролитров сыворотки свободной среды. Затем используйте сотовый подъемник, чтобы очистить клетки и перенести в чистую трубку.Сразу после этого заморозить вирус подвески в жидком азоте и хранить при 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 24 часов, чтобы обеспечить тщательное замораживание. Для определения титеров вирусных запасов в октупликаторах на алицит с использованием 96 настенных пластин. Сначала вытяните клетки производителя из колб культуры клеток T75 в 50 миллилитровую коническую трубку.Подсчитайте клетки и отрегулируйте подвеску клетки до 150 000 клеток на миллилитр в DMEM с 10 процентами FBS. Добавьте 90 микролитров DMEM с 10 процентами FBS на колодец 96 настенной пластины. Затем добавьте 10 микролитров из одной алициты запасов вируса во все 8 скважин в первой колонке пластины.Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз по крайней мере 10 раз. Используйте многоканальный пипетку для передачи 10 микролитров каждой из них, от первой до второй колонки, и тщательно перемешайте, трубя вверх и вниз. Повторите это для каждой колонки, чтобы получить серийные десятикратные разбавления вируса с помощью свежих пипеток советы для каждого шага разбавления.Отбросьте 10 микролитров из каждой колодец последней колонки. Добавьте 100 микролитров клеточной подвески со 150 000 клеток на миллилитр к каждому хорошо убедившись, что нет клеточных комков. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5 процентов углекислого газа в течение 48 часов.Проверьте синхронизию с помощью светового микроскопа. Подсчитайте синцитию в каждом колодеце столбца с самым высоким фактором разбавления, содержащим видимую синцитию. Для вирусов, кодирующих флуоресцентный репортер, синцития может быть подсчитана с помощью флуоресцентной микроскопии.Для анализа репликации вируса кори кинетики за день до заражения семян 100 000 веро-клеток в 1 миллилитр DMEM с 10 процентов FBS на скважину на 12 настенных пластин, по крайней мере 2 скважины для каждой точки интереса времени. Для заражения клетки заменяют среду 300 микролитров сыворотки свободной среды, содержащей соответствующее количество вируса. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию и 5 процентов углекислого газа, по крайней мере 2 часа.Удалить инокулум и добавить 1 миллилитр DMEM с 10 процентов FBS и продолжить инкубацию. В соответствующее время указывает после заражения урожай вирусных progyny путем непосредственного соскабливания клеток в среду. Перенесите содержимое из каждой колодец в индивидуальную трубку.Заморозить в жидком азоте и хранить при 80 градусах по Цельсию до титрования, а затем продолжить, как описано в рукописи. Чтобы начать оценку индуцированной БТЭ клетки опосредованой цитотоксичности путем выпуска LDH, сначала изолируют секретные трансгенные продукты, выраженные вирусом инфицированных целевых клеток и изолировать клетки иммунного эффекта, как описано в рукописи. Затем семенные клетки-мишени в настенной пластине U-bottom 96 включают образцы, описанные в рукописи.Добавьте ранее изолированные иммуномодуляторы при желаемых концентрациях в соответствующие образцы. Добавить иммунные клетки перебежчика при желаемых соотношениях и добавить средний общий объем 100 микролитров на колодец. Инкубация для желаемых ранее определенных временных рамок при 37 градусах цельсия и 5 процентах углекислого газа.За 45 минут до сбора проб добавьте 10 микролитров 10X Lysis Solution в скважины, содержащие образцы T max и соответствующие средние элементы управления и продолжайте инкубацию. Центрифуга клетки в 250 раз G в течение 4 минут. Перенесите 50 микролитров супернатанта из каждой скважины в колодцы плоской нижней 96 настенной пластины, чтобы не передавать клетки.После приготовления субстратного раствора производитель добавляет по 50 микролитров к каждой колодец. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут или до тех пор, пока T макс образцов свою очередь, темно-красный. После инкубации добавьте по 50 микролитров стоп-раствора к каждой колодец.Центрифуга в течение 1 минуты при 4000 раз G, а затем использовать выдолбленной иглой для удаления пузырьков воздуха. Измерьте оптическое поглощение на 490 нанометров и вычислите, как описано в рукописи. После прививки с неизмененными и BTE кодирования онколитических вирусов кори кривые роста по сравнению векторов на веро-клеток появляются похожи.Кривые жизнеспособности клеток на mc38 murine колоректальных клетках карциномы, стабилизирующих карциномбрионный антиген человека и рецепторы MV CD46 после прививки, показывают, что литическая активность вируса трансгенного кодирования отстает в линии опухолевых клеток мурина. Цитометрия потока целевого антигена, выражающая клетки, инкубированные BTE при пяти различных разбавлениях, показала связывание БТЕ клетками в зависимости от концентрации. В иммуноблоте после магнитного стягивания связанных с БТЕ клеток было появь, что при нецелевом использовании БТЕ не было обнаруженного количества клеток; в то время как при таргетинге образцов БТЕ использовались связанные клетки, присутствующие в фракции элюции.BTE опосредованная целевая антигенная специфическая и зависимая от концентрации цитотоксиситность т-клеток мурина показана репрезентативным анализом выпуска LDH и показывает, что в настоящем примере 15-процентное конкретное убийство клеток было достигнуто при относительно высокой концентрации БТЭ 1 микрограмм на миллилитр по сравнению с эталонными клетками. При попытке этой процедуры, важно помнить, регулярно контролировать клетки, чтобы проверить прогрессирование инфекции. Не забывайте, что рекомбинантные штаммы вакцины против кори, хотя ослабленные могут быть опасны, особенно для людей с ослабленным иммунитетом.Избегайте воздействия, следуя соответствующим процедурам биобезопасности. Лица обработки вирусов должны быть вакцинированы до выполнения этих методов. После этой процедуры вирусное выражение дальнейших трансгенов может быть достигнуто для того, чтобы проанализировать взаимодействие вирусов и терапевтические эффекты.Развитие этих методов проложило путь для исследователей в области биотерапии для изучения влияния локально выраженных иммуномодуляторов в многочисленных опухолевых образованиях;In Vitro, In Vivo, а также в клинических испытаниях.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Функциональная оценка вариантов BRCA1 с использованием базовых редакторов CRISPR-Mediated

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Модель среза мозга Ex Vivo для изучения и нацеливания на метастатический рост опухоли головного мозга рака молочной железы

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Оценка противоопухолевой активности полиангидридных наночастиц IL-1α in vivo

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Определение функций генов в опухолевом генезе путем абляции Ex vivo флоксированных аллелей в злокачественных опухолевых клетках оболочки периферических нервов

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Поддержание клеточного разнообразия глиобластомы человека Ex vivo с использованием трехмерной органоидной культуры

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...