Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Dessa metoder var etablerade i gruppen Virotherapy som leds av Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts vid National Center för tumörsjukdomar i Heidelberg. Vi står i skuld till honom och alla medlemmar i laboratoriet laget, särskilt Dr Tobias Speck, Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler, och Jessica Albert. Detta arbete fick stöd av den annan Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 till C.E. Engeland) och tyska National Science Foundation (DFG, bevilja C.E. Engeland sv 1119/2-1). J.P.W. Heidbuechel får ett stipendium av Helmholtz internationella forskarskolan för cancerforskning.

Obs: [O], [P], och [M] ange underavsnitt gäller: OVs i allmänhet, (de flesta) paramyxovirus, eller MV endast, respektive. [B] anger sektioner som är specifika för BTE transgener.
1 kloning av immunmodulerande-encoding transgener i mässling virusvektorer
<ol><li>
[O] design infoga sekvens.
	<ol>
<li>[O] besluta om en immunmodulerande av intresse utifrån litteraturforskning eller explorativa data såsom genetiska skärmar41 och h?...

Onkolytisk immunterapi (i.e., OVT i kombination med immunmodulering) innehar stort löfte för cancerbehandling, kräver ytterligare utveckling och optimering av onkolytisk virus kodning immunmodulerande proteiner. Det här protokollet beskriver metoder för att generera och verifiera sådana vektorer för efterföljande testning i relevanta prekliniska modeller och potentiella framtida kliniska översättning till romanen mot cancer therapeutics.
Många olika onkolytisk virus plattfo...

Onkolytisk virus (OVs) utvecklas som mot cancer therapeutics som specifikt replikera inom och döda tumörceller medan frisk vävnad intakt. Det har nu blivit vanligt förstå att onkolytisk virotherapy (ÖVT), i de flesta fall, förlitar sig inte enbart på komplett tumör lysis genom effektiv replikering och sprider viruset, men kräver ytterligare verkningsmekanismer för behandlingframgång, inklusive vaskulära och stromal inriktning och allt immun stimulering1,2,3,4. Medan många tidiga OV studier används omodifierade virus, har aktuell forskning gynnats av en förbättrad biologisk förståelse, virus biobanker som potentiellt innehåller roman OVs, och de möjligheter som erbjuds av genteknik för att skapa avancerade OV plattformar5,6,7.
Med tanke på den senaste tidens framgången immunterapi, är immunmodulerande transgener av särskilt intresse när det gäller gentekniken av OVs. Riktade uttryck för sådana genprodukter av OV-infekterad tumörceller minskar toxicitet jämfört med systemisk administrering. Inriktning uppnås antingen genom att använda virus med inneboende oncoselectivity eller genom att ändra viral tropism8. Lokala immunmodulering förbättrar OVT mångfacetterade anti-tumor mekanismer. Denna strategi är dessutom instrumental i förhör samspelet mellan virus, tumörceller och värd immunsystemet. Därför ger detta protokoll ett tillämpligt och justerbar arbetsflöde för att designa, klona, rädda, propagera och validera onkolytisk paramyxovirus (specifikt mässlingvirus) vektorer kodning sådan transgener.
Modulering av immunsvaret kan uppnås genom ett brett utbud av transgenens produkter inriktning olika steg av cancer-immunitet cykel9, inklusive förbättra tumör antigen erkännande [t.ex. tumör-associerade antigener (TAAs) eller inducerare av stora histocompatibility komplex (MHC) klass I molekyler] över stödja dendritiska cellen mognad för effektiv antigen-presentation (cytokiner); rekrytera och aktivera önskad immunceller som cytotoxiska och helper T-celler [chemokiner, bispecific T cell engagers (bö)]; inriktning suppressiv celler regulatoriska T-celler, myeloid-derived suppressor, tumör-associerad makrofager, och cancer-associerade fibroblaster (antikroppar, bö, cytokiner); och förhindra effektor celler hämning och utmattning (checkpoint-hämmare). Således finns en uppsjö av biologiska agens. Det är nödvändigt att förbättra cancerbehandling utvärdering av sådana virus-kodade immunomodulatorer angående terapeutisk effekt och eventuella synergieffekter samt förståelse av respektive mekanismer.
Negativ bemärkelse enkelsträngat RNA-virus av familjen Paramyxoviridae kännetecknas av flera funktioner bidrar till deras användning som onkolytisk vektorer. Dessa inkluderar en naturlig oncotropism, stor genomisk kapacitet för transgener (mer än 5 kb)10,11, effektiv spridning inklusive syncytia bildning och hög immunogenicitet12. Därför OV plattformar baserade på valpsjuka virus13, påssjuka virus14, Newcastle sjukdom virus15, Sendai virus16,17, simian virus 518och Tupaia paramyxovirus19 har utvecklats. Mest framträdande, levande försvagat mässlingvirusvaccin stammar (MV) har utvecklats i preklinisk och klinisk utveckling20,21. Dessa virusstammar har använts i decennier för rutin immunisering med en utmärkt säkerhet rekord22. Dessutom finns det ingen risk för insertionsmutationer på grund av strikt cytosoliska replikering av paramyxovirus. En mångsidig omvänd genetik system baserat på anti genomisk cDNA som möjliggör införande av transgener i ytterligare transkription enheter (ATUs) är tillgängliga11,23,24. MV vektorer kodning natriumjodid symporter (MV-NIS) för imaging och strålbehandling eller lösliga carcinoembryonalt antigen (MV-CEA) som surrogatmarkör för viral genuttryck utvärderas för närvarande i kliniska prövningar (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 och NCT00408590). Säker administration har bekräftats och anti-tumör effekt har rapporterats i tidigare studier25,26,27,28,29, 30 (granskas av Msaouel et al.31), bana väg för ytterligare onkolytisk mässlingvirus som har utvecklats och testats prekliniskt. MV kodning immunmodulerande molekyler inriktning olika steg av cancer-immunitet cykeln har visat sig fördröja tumörens tillväxt och/eller förlänga överlevnaden hos möss, med bevis för immunmedierade effekt och långsiktiga skyddande immunologiskt minne i syngena mus-modeller. Vektor-kodade transgener inkluderar granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrofiler-aktiverande protein34, immun checkpoint-hämmare35, interleukin-12 (IL-12)36, TAAs37och BTEs38, som tvärbinda en tumör ytantigen med CD3 och därmed framkalla antitumöraktivitet av polyklonala T-celler, oavsett T-cell receptor specificitet och samtidig stimulering ( (Se figur 1). Lovande prekliniska resultaten för dessa konstruktioner efterfrågan ytterligare translationell insatser.
Talimogen laherparepvek (T-VEC), en typ jag herpes simplex-virus kodning GM-CSF, är den enda onkolytisk terapeutiska godkänd av amerikanska Food och Drug Administration (FDA) och Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA). I fas III-studie som leder till godkännanden i slutet av 2015 har inte bara visat effekt på platsen för intra-tumoral injektion, men även abscopal effekter (dvs remissioner av icke-injicerade lesioner) i avancerat melanom39. T-VEC har sedan dess trätt ytterligare prövningar för tillämpning i andra tumör enheter (t.ex., icke-melanom hudcancer, NCT03458117, pankreascancer, NCT03086642) och för utvärdering av kombinationsbehandlingar, särskilt med immun checkpoint hämmare (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 och Ribas et al.40).
Detta visar inte bara potentialen i onkolytisk immunterapi men också behovet av ytterligare forskning för att identifiera överlägsen kombinationer av OVT och immunmodulering. Rationell design ytterligare vektorer och utveckling för preklinisk testning är nyckeln till detta åtagande. Detta kommer också förväg förståelse för bakomliggande mekanismer och konsekvenser för utvecklingen mot mer personlig cancerbehandling. Därför presenterar denna skrift en metod för en modifiering och utveckling av paramyxovirus för riktade cancer immunoterapi och mer specifikt av onkolytisk mässlingvirus kodning T cell-engagerande antikroppar (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Framgångsrika cancer immunoterapi har potential att uppnå långsiktig tumör kontroll. Trots senaste kliniska framgångar återstår det ett brådskande behov av säkra och effektiva behandlingar som skräddarsys individuella tumör immun profiler. Onkolytisk virus aktiverar induktion av anti-tumor immunsvar samt tumör begränsad genuttryck. Det här protokollet beskriver den generation och ex vivo analysen av immunmodulerande onkolytisk vektorer. Fokusera på mässling vaccinvirus kodning bispecific T cell engagers som ett exempel, kan allmän metod anpassas till andra virus arter och transgener. Presenterade arbetsflödet innehåller design, kloning, räddning, och förökningen av rekombinanta virus. Analyser att analysera replikering kinetik och lytisk aktivitet av vektor samt funktionaliteten i den isolerade immunmodulerande ex vivo ingår, vilket underlättar generationen av romanen agenter för vidareutveckling i prekliniska modeller och slutligen kliniska översättning.

Figur 1 illustrerar verkningsmekanismen av onkolytisk mässlingvirus kodning bispecific T cell engagers. Ett flödesschema som skildrar arbetsflödet i detta protokoll presenteras i figur 2. Figur 3 visar ett exempel på en modifierad onkolytisk mässling virus arvsmassa. Detta ger en visuell representation av de specifika ändringar tillämpas på mässling virus anti genomet och s...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Det här protokollet beskriver en detaljerad arbetsflöde för generering och ex vivo karakterisering av onkolytisk virus för uttryck av immunomodulatorer, med mässlingvirus kodning bispecific T cell engagers som exempel. Ansökan och anpassning till andra vektor plattformar och transgener kommer att påskynda utvecklingen av nya immunovirotherapeutics för kliniska översättning.

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Denna metod kan bidra till att ta itu med viktiga utmaningar inom cancer immunterapi genom att underlätta utvecklingen av onkolyktiska vektorer för riktade immunmodulering. Den största fördelen med det tillämpade omvända genetiska systemet är dess mångsidighet;därför kan vektorer anpassas för att ta itu med olika forskningsfrågor och måltumörer med olika immunsignaturer. De virus förökning steg särskilt bestämma den optimala tidspunkten att skörda virus är svåra att lära av ett textprotokoll eftersom syncytia bildning måste bedömas visuellt över tiden.Att börja design och klona rekombinanta immunmodulerande vektorer som beskrivs i manuskriptet. Detta protokoll beskriver specifika steg för utveckling av en oncolytic mässling vaccin vektor, kodning en bispecific T-cell engager. För att rädda mässlingvirus från cDNA, 24 timmar före transfektionsplatta mässling virus producent celler jämnt på en 6 väggplatta.Seed 200, 000 celler i 2 milliliter DMEM som innehåller 10 procent FBS per brunn för att uppnå 65 till 75 procent konfluency vid tidpunkten för transfection. Blanda 5 mikrogram rekombinant DNA-kodning av mässlingvirus antigenome som kommer att användas för att transfekt cellerna. Lämpliga plasmider och en fluorescerande reporter i en total volym på 200 mikroliter av DMEM.Tillsätt 18,6 mikroliter av liposomalt transfection reagens till blandningen och omedelbart snärta röret för att blanda. Inkubera denna transfektionsmix i 25 minuter i rumstemperatur. Att transfekt MV producentcellerna ta bort mediet från 6 väl plattan odlas till 65 till 75 procent konfluency och lägga 1,8 milliliter DMEM med 2 procent FBS och 50 mikrogram per milliliter Kanamycin per brunn.Tillsätt sedan transfektionsblandningen droppvis till varje brunn och snurra försiktigt. Inkubera cellerna över natten vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid. På följande dag ersätta mediet med 2 milliliter av färsk DMEM med 2 procent FBS och 50 mikrogram per milliliter Kanamycin och upprepa detta när medium blir surt igenkänd av den gula färgen.Använd mikroskop för att observera celler dagligen för reporter genuttryck och syncytia bildning. När stora syncytia bestående av 20 eller fler celler är synliga eller när celler blir för tät skörd viruset. 24 timmar före den förväntade skörden utsäde cirka 1,5 miljoner MV producentceller i 12 milliliter av DMEM med 10 procent FBS på 10 centimeter rätter för att uppnå 65 till 75 procent konfluency vid tidpunkten för virusinokulering.För att samla in viruset progyny använda en cell skrapa för att noggrant skrapa anhängare producentceller från 6 väggplattan med transfekterade celler. Överför mediet som innehåller de skrapade cellerna till ett centrifugrör. Centrifugera i minst 2500 gånger G och 4 grader Celsius i 5 minuter för att avlägsna cellskräp.Efter centrifugeringen blanda cell-free supernatant med serum fria medium till en slutlig volym på 4 milliliter för att förbereda inokulat. Ta bort mediet från 10 centimeter skålen med MV producentceller och tillsätt inokulet till cellerna. Inkubera i minst 2 timmar vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid.Efter inkubation tillsätt 6 milliliter DMEM med 10 procent FBS och inkubera celler över natten. Byt sedan ut mediet med 12 milliliter färsk DMEM med 10 procent FBS och inkubera vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid fram till skörden. Observera cellerna minst två gånger dagligen.Innan syncytia brast när membran störningar blir synlig skörd viruset. Att skörda den första passagen ta bort supernatant från plattan och tillsätt 600 mikroliter av serum fria medium. Använd sedan en celllyftare för att skrapa cellerna och överföra till ett rent rör.Omedelbart efter att frysa viruset suspension i flytande kväve och förvara på 80 grader Celsius i minst 24 timmar för att säkerställa grundlig frysning. För att bestämma titers av virus lager i oktuplikater per alikvot med hjälp av 96 väggplattor. Dra först producentcellerna från T75 cellodlingskolvar i 50 milliliter koniska rör.Räkna cellerna och justera cellupphängningen till 150, 000 celler per milliliter i DMEM med 10 procent FBS. Tillsätt 90 mikroliter av DMEM med 10 procent FBS per brunn av en 96 väggplatta. Tillsätt sedan 10 mikroliter från en alikvot av virusstocken till alla 8 brunnarna i den första kolumnen i plattan.Blanda noggrant genom pipettering upp och ner minst 10 gånger. Använd en flerkanalig pipett för att överföra 10 mikroliter av varje brunn, från den första till den andra kolumnen, och blanda noggrant genom pipettering upp och ner. Upprepa detta för varje kolumn för att erhålla seriell tiofaldig utspädning av viruset med hjälp av färska pipettspetsar för varje spädningssteg.Kassera 10 mikroliter från varje brunn av den sista kolumnen. Tillsätt 100 mikroliter cellupphängning med 150, 000 celler per milliliter till varje brunn och se till att det inte finns några cellklump. Inkubera vid 37 grader Celsius, 5 procent koldioxid i 48 timmar.Kontrollera om det finns syncytia med hjälp av ett ljusmikroskop. Räkna syncytia i varje brunn i kolumnen med den högsta utspädningsfaktorn som innehåller synlig syncytia. För virus som kodar en fluorescerande reporter kan syncytia räknas med hjälp av fluorescensmikroskopi.För analys av mässlingvirus replikation kinetik en dag före infektionsfrö 100, 000 veroceller i 1 milliliter av DMEM med 10 procent FBS per brunn på 12 väggplattor med minst 2 brunnar för varje tidspunkt av intresse. För att infektera cellerna ersätta mediet med 300 mikroliter av serum fria medium som innehåller respektive mängd av viruset. Inkubera vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid i minst 2 timmar.Ta bort inokulat och tillsätt 1 milliliter DMEM med 10 procent FBS och fortsätt inkubationen. Vid relevanta tidpunkter efter infektion skörd viral progyny genom att direkt skrapa celler i mediet. Överför innehåll från varje brunn till ett enskilt rör.Snap frysa i flytande kväve och förvara i 80 grader Celsius tills titrering och fortsätt sedan som beskrivs i manuskriptet. För att påbörja utvärdering av BTE inducerad cell medierad cytotoxicitet genom LDH release, först isolera utsöndras transgena produkter uttryckt av virus infekterade målceller och isolera immun effektor celler som beskrivs i manuskriptet. Sedan utsäde målceller i en U-bottom 96 väggplatta och inkludera prover som beskrivs i manuskriptet.Lägg till tidigare isolerade immunmodulatorer vid önskade koncentrationer till respektive prov. Lägg immun avhoppare celler vid önskade nyckeltal och lägga medium till en total volym av 100 mikroliter per brunn. Inkubera för de önskade tidigare bestämda tidsramarna vid 37 grader Celsius och 5 procent koldioxid.45 minuter före provinsamlingen tillför 10 mikroliter 10X Lyslösning till brunnar som innehåller T max prov och motsvarande medelreglage och fortsätt inkubationen. Centrifugera cellerna vid 250 gånger G i 4 minuter. Överför 50 mikroliter av supernatant från varje brunn till brunnar av en platt botten 96 väggplatta se till att inte överföra cellerna.Efter att ha förberett substratlösning enligt tillverkaren tillsätt 50 mikroliter till varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i mörker i 30 minuter eller tills T max prover blir djupt röda. Efter inkubation tillsätt 50 mikroliter av stopplösning till varje brunn.Centrifugera i 1 minut vid 4000 gånger G och använd sedan en hålad nål för att avlägsna luftbubblor. Mät optisk absorbans vid 490 nanometer och beräkna enligt beskrivningen i manuskriptet. Efter inokulering med omodifierade och BTE kodning oncolytic mässling virus tillväxt kurvor av de jämförda vektorer på veros celler visas liknande.Cellens livskraft kurvor på mc38 murine kolorektal carcinom celler stably uttrycker mänskliga carcinoembryonic antigen och MV receptorerna CD46 efter inokulering visar att lytic verksamhet av transgen kodning virus släpar efter i murine tumör cellinje. Flow cytometry av mål antigen uttrycker celler inkuberas med BTE: s vid fem olika utspädningar visade BTE bindande av celler i en koncentration beroende sätt. I immunoblot efter magnetiska dra ner av BTE associerade celler visade att när icke inriktning BTE: s användes fanns det inga påvisbara mängder celler;medan när inriktning BTE prover användes bundna celler var närvarande i elution fraktionen.BTE medierad mål antigen specifik och koncentration beroende cytotoxicitet av murine T celler indikeras av representativa LDH frisättningsanalys och visar att i förevarande exempel 15 procent specifik cell avlivning uppnåddes vid en relativt hög BTE koncentration av 1 mikrogram per milliliter jämfört med referensceller. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att regelbundet övervaka celler för att kontrollera progression av infektion. Glöm inte att rekombinanta mässlingvaccin stammar även försvagade kan vara farliga särskilt för immun-undertryckta individer.Undvik exponering genom att följa lämpliga rutiner för biosäkerhet. Individer som hanterar virus bör vaccineras innan de utför dessa metoder. Efter detta förfarande viral uttryck av ytterligare transgener kan uppnås i syfte att analysera virus värdar interaktioner och terapeutiska effekter.Utvecklingen av dessa tekniker har banat väg för forskare inom bioterapi att utforska effekterna av lokalt uttryckta immunmodulatorer i många tumorous enheter;In Vitro, In Vivo, och även i kliniska prövningar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Funktionell bedömning av BRCA1-varianter med CRISPR-medierade basredigerare

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

En Ex Vivo Brain Slice-modell för att studera och rikta bröstcancer Hjärnans metastatiska tumörtillväxt

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Utvärdering av in vivo antitumöraktivitet av polyanhydrid IL-1α nanopartiklar

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Definiera genfunktioner i tumorigenes genom ex vivo-ablation av floxerade alleler i maligna perifera nervhöljestumörceller

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Upprätthålla humant glioblastom cellulär mångfald ex vivo med hjälp av tredimensionell organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...