Name: paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Bu yöntemler Virotherapy tümör hastalıkları Heidelberg için Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts Ulusal Merkezi liderliğindeki grup kuruldu. Biz onu ve laboratuvar ekibi, özellikle Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler ve Jessica Albert tüm üyeleri için borçlu bulunmaktadır. Bu eser başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından desteklenmiştir (Grant 2015_A78 CE Engeland için) ve Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG, C.E. Engeland için EN 1119/2-1 vermek). J.P.W. Heidbuechel bir maaşa Helmholtz International Graduate School tarafından kanser araştırmaları için alır.

Not: [O], [P] ve [alt bölümleri için geçerli göstermek M]: genel, (en) paramyxovirusler veya yalnızca, MV OVs sırasıyla. [B] bölümleri özel BTE transgenes için gösterir.
1 Immünomodülatör kodlama Transgenes kızamık virüsü vektörel çizimler klonlama
<ol><li>
[O] tasarım sıra ekleyin.
	<ol>
<li>[O] karar üzerinde bir Immünomodülatör edebiyat araştırma veya genetik ekranlar41 gibi keşif verileri temel ilgi ...

Oncolytic immünoterapi (i.e., immunomodulation ile birlikte OVT) kanser tedavisi, daha da geliştirilmesi ve optimizasyonu immunomodulatory protein kodlama oncolytic virüslerin talep için büyük söz sahibidir. Bu iletişim kuralı oluşturmak ve ilgili preklinik modelleri ve potansiyel gelecek klinik çeviri roman anti-kanser tedavi içine sonraki test etmek için böyle vektörel çizimler doğrulamak için yöntemler açıklanır.
Çok sayıda farklı oncolytic virüs farklı a...

Oncolytic virüs (OVs) özellikle içinde çoğaltmak ve sağlıklı dokulara olduğu gibi bırakarak tümör hücrelerini öldürmek anti-kanser tedavi olarak geliştirilmektedir. Bu, şimdi bu oncolytic virotherapy (OVT), çoğu durumda anlama yaygın hale gelmiştir yalnızca tam Tümör lizis verimli yineleme ve yayılan virüs tarafından dayanmaz ancak tedavi başarı için ek mekanizmaları eylem gerektirir dahil olmak üzere vasküler ve stromal hedefleme ve daha da önemlisi, immün stimülasyon1,2,3,4. Birçok erken OV çalışma değiştirilmemiş virüs kullanılan iken, mevcut araştırma anlama, potansiyel olarak Roman OVs ve gelişmiş OV oluşturmak için genetik mühendisliği tarafından sunulan olanakları içeren virüs biobanks geliştirilmiş bir biyolojik kazançlı platformlar5,6,7.
İmmünoterapi son başarısı göz önüne alındığında, OVs. genetik mühendisliği ile ilgili özel ilgi immunomodulatory transgenes vardır Tür gen ürünlerin OV-enfekte tümör hücreleri tarafından hedeflenen ifade için sistemik yönetim karşılaştırıldığında toksisite azaltır. Hedefleme ile doğal oncoselectivity virüs kullanarak veya viral tropism8değiştirme elde edilir. Yerel immunomodulation OVT çok yönlü anti-tümör mekanizmalarının geliştirir. Ayrıca, bu virüs, tümör hücreleri ve ana bağışıklık sistemi arasında Interplay sorguya enstrümantal bir stratejidir. Bu amaçla, bu iletişim kuralını tasarlama, clone, kurtarmak, yaymak ve oncolytic paramyxovirus (özellikle kızamık virüsü) vektörel çizimler böyle transgenes kodlama doğrulamak için bir uygulanabilir ve ayarlanabilir iş akışı sağlar.
Modülasyon bağışıklık yanıtının çok çeşitli kanser-bağışıklık döngüsü9tümör antijen tanıma [Örneğin, tümör ilişkili antijenleri (TAAs) veya indükleyicileri, geliştirilmesi de dahil olmak üzere, farklı adımları hedefleme transgene ürünleri tarafından elde edilebilir MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri] dendritik hücre olgunlaşma verimli antijen sunumu (sitokinler); destekleyen üzerinde işe alma ve istenen bağışıklık hücreleri gibi etkinleştirme sitotoksik ve yardımcı T hücreleri [kemokinler, bispecific T hücre engagers (BTEs)]; hedefleme süpresif hücreleri gibi düzenleyici T hücreleri, myeloid kaynaklı bastırıcı hücreler, makrofajlar tümör ilişkili ve kanser ilişkili fibroblastlar (antikorlar, BTEs, sitokinler); ve efektör hücre inhibisyonu ve bitkinlik (denetim noktası inhibitörleri) önlenmesi. Böylece, bir bolluk biyolojik ajanlar kullanılabilir. Bu tür virüs kodlanmış immunomodulators terapötik etkinlik ve olası sinerji ile ilgili olarak hem de kendi mekanizmaları anlama değerlendirilmesi kanser tedavisi geliştirmek gereklidir.
Negatif anlamda tek iplikçikli RNA virüsleri Paramyxoviridae ailesine oncolytic vektör olarak çeşitli özellikler bunların kullanımı için elverişli karakterizedir. Bunlar doğal oncotropism, transgenes (daha--dan 5 kb)10,11, syncytia formasyonu ve yüksek immünojenisite12gibi yayılan verimli geniş genomik kapasite bulunmaktadır. Bu nedenle, Canine distemper virüs13, kabakulak virüsü14, Newcastle hastalığı virüsü15, Sendai virüs16,17, simian virüs 518ve Tupaia paramyxovirus19 temel OV platformlar geliştirilmiştir. En belirgin, canlı zayıflatılmış kızamık virüsü aşı suşları (MV) preklinik ve klinik geliştirme20,21' ilerlemiştir. Bu virüs suşları bir mükemmel Emanet kayıt22ile rutin aşılama için yıllardır kullanılmaktadır. Ayrıca, paramyxovirusler kesinlikle sitozolik çoğaltma nedeniyle insertional mutagenesis için hiçbir risk yok. Transgenes ek transkripsiyon birimleri (ATUs) içine ekleme için sağlayan Anti-genomik cDNA dayalı bir çok yönlü ters genetik sistem mevcut11,23,24' tür. Sodyum iyodür simporter (MV-NIS) viral gen ifadesinin bir surrogate marker olarak görüntüleme ve radyoterapi veya çözünür carcinoembryonic antijen (MV-CEA) için kodlama MV vektörel çizimler klinik deneylere (NCT02962167, NCT02068794, şu anda değerlendirilen NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ve NCT00408590). Güvenli yönetim doğruladı ve vaka anti-tümör etkinliğinin önceki çalışmalar25,26,27,28,29, rapor 30 (Msaouel et al.31tarafından gözden geçirilmiş), ek oncolytic kızamık virüs, geliştirilen ve preclinically test için önünü. Kanser-bağışıklık döngüsünün farklı adımları hedefleme molekülleri tümör büyüme gecikme ve/veya immün aracılı etkinlik ve uzun süreli koruyucu bağışıklık bellekte syngeneic için kanıt ile fareler, hayatta kalma uzatmak için gösterilen immunomodulatory kodlama MV fare modelleri. Transgenes vektör kodlamalı granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)32,33, H. pylori nötrofil aktive protein34, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri35dahil, İnterlökin-12 (IL-12)36, TAAs37ve BTEs38, hangi bir tümör bölünmelerini CD3 ile HCV ve bu nedenle anti-tümör faaliyet T hücre reseptör özgüllük ve Co stimülasyon (bakılmaksızın poliklonal T hücreleri tarafından neden Şekil 1). Bu yapıları talep daha fazla translasyonel çabaları için elde edilen umut verici preklinik sonuçları.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), bir tür ben GM-CSF, kodlama herpes simpleks virüsü tek oncolytic tedavi Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmış olduğunu. Onayları için geç 2015 yılında önde gelen Faz III çalışmada yalnızca gelişmiş melanom39etkinlik içi tumoral enjeksiyon, aynı zamanda abscopal etkileri (yani, remisyon sigara enjekte lezyonların) yerinde gösterilen değil. T-VEC beri ek denemeler kombinasyonu terapileri, özellikle bağışıklık denetim noktası ile değerlendirilmesi ve uygulama diğer tümör varlıklarda (örneğin, Sigara Melanom cilt kanseri, NCT03458117; pankreas kanseri, NCT03086642) için girdi inhibitörleri (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ve Ribas et al.40).
Bu sadece da OVT ve immunomodulation üstün birleşimlerini tanımlamak daha fazla araştırma ihtiyacını oncolytic immünoterapi potansiyelini gösterir. Ek vektörel çizimler ve preklinik test etmek için geliştirme rasyonel tasarım bu girişim için anahtardır. Bu da temel mekanizmaları anlayışı ilerletmek ve daha fazla kişiselleştirilmiş kanser tedavisi doğru ilerleme için sonuçları vardır. Bu amaçla, bu yayın için değişiklik ve geliştirme için hedeflenen kanserli hastalarda paramyxovirusler ve daha ayrıntılı olarak, oncolytic kızamık virüs T hücre ilgi çekici antikorlar (Şekil 2) kodlama yöntemi sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:833px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Rapid DNA Dephos &#38; Ligation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Roche Life Science, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">4898117001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">K1231</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">A9539-500G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">28704</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">NEB 10-beta Competent E. coli</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">C3019I</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">LB medium after Lennox</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">X964.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">HP62.1</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Miniprep Kit</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">27104</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Restriction enzyme HindIII-HF</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td>
			<td style="width:123px;">R3104S</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:312px;">Invitrogen, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31966-021</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:312px;">Biosera, Boussens, France</td>
			<td style="width:123px;">FB-1280/500</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">FugeneHD</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td style="width:155px;">may be replaced by transfection reagent of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">K0129</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:312px;">ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:123px;">CCL81</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td>
			<td style="width:312px;">J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:155px;">available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Granta-519</td>
			<td style="width:312px;">DSMZ, Braunschweig, Germany</td>
			<td style="width:123px;">ACC 342</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Opti-MEM (serum-free medium)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31985070</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)</td>
			<td style="width:312px;">PromoKine, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">PK-CA20-300-1000</td>
			<td style="width:155px;">includes XTT reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:312px;">Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">14190-094</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td>
			<td style="width:312px;">QIAGEN, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:123px;">31014</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">3957.3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Imidazole</td>
			<td style="width:312px;">Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I5513-25G</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&#160;kDa</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">UFC901024</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:312px;">Merck Milipore</td>
			<td style="width:123px;">71285-3</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">IgG from human serum</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">I4506</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-PE</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-092-257</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_871939</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody</td>
			<td style="width:312px;">BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">555749</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_396091</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">12158167001</td>
			<td style="width:155px;">RRID: AB_390915</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-090-485</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MS Columns</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-201</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-102</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:312px;">Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td style="width:123px;">130-042-303</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:312px;">Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td>
			<td style="width:123px;">MB-030-0050</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:244px;">CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td style="width:312px;">Promega, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:123px;">G1780</td>
			<td style="width:155px;">includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cell lifter</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Reynosa, Mexico</td>
			<td style="width:123px;">3008</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Corning, Oneonta, NY, USA</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:312px;">Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td>
			<td style="width:123px;">639160</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, U-bottom</td>
			<td style="width:312px;">TPP, Trasadingen, Switzerland</td>
			<td style="width:123px;">92097</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">96-well plates, flat bottom</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353072</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">6-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353046</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">12-well plates</td>
			<td style="width:312px;">Neolab, Heidelberg, Germany</td>
			<td style="width:123px;">353043</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:312px;">nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td>
			<td style="width:123px;">02-572-3001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">T175 cell culture flasks</td>
			<td style="width:312px;">Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td>
			<td style="width:123px;">159910</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:312px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:123px;">SLGPM33RS</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramyxoviruses for tumor-targeted immunomodulation: design and evaluation ex vivo

Başarılı kanserli hastalarda uzun süreli tümör kontrolü elde etmek için potansiyeli vardır. Son klinik başarılara rağmen bireysel tümör bağışıklık profillerine uygun güvenli ve etkili tedaviler için acil bir ihtiyaç kalır. Oncolytic virüs anti-tümör bağışıklık yanıtı hem de tümör sınırlanmış gen ekspresyonu indüksiyon etkinleştirin. Bu iletişim kuralı immunomodulatory oncolytic vektörler üretimi ve ex vivo analizini açıklar. Kızamık aşı virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama odaklanan, diğer virüs türler ve transgenes genel metodoloji adapte edilebilir. Sunulan iş akışı tasarımı, klonlama, kurtarma ve rekombinant virüslerin yayılmasını içerir. Kinetik ve Yöneyin litik aktivite yanı sıra ex vivo izole Immünomodülatör işlevselliğini çözümlemek için deneyleri dahil, böylece roman ajanlar üretimi daha da geliştirilmesi preklinik modelleri için kolaylaştırmak ve sonuçta klinik çeviri.

Şekil 1 oncolytic kızamık virüs bispecific T hücre engagers kodlama etki mekanizması gösterilmiştir. Bu protokol iş akışı gösteren bir akış çizelgesi Şekil 2' de sunulmuştur. Şekil 3 değiştirilmiş oncolytic kızamık virüsü genom bir örneği gösterilir. Bu kızamık virüs anti-genom ve belirli özellikleri eklenen transgenes için uygulanan belirli değiş...

Watch this Scientific Journal Video about Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo at JoVE.com

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Bu yöntem, hedefli immünomodülasyon için onkolitik vektörlerin gelişimini kolaylaştırarak kanser immünoterapisi alanındaki temel zorlukların giderilmesine yardımcı olabilir. Uygulanan ters genetik sistemin en büyük avantajı çok yönlülüğüdür;bu nedenle vektörler çeşitli araştırma sorularını ve çeşitli immün iyonlara sahip tümörleri hedef alacak şekilde uyarlanabilir. Virüs yayılma adımları özellikle virüs hasat için en uygun zaman noktası belirleyen bir metin protokolü öğrenmek zordur çünkü syncytia oluşumu zaman içinde görsel olarak değerlendirilmelidir.El yazmasında açıklandığı gibi rekombinant immünomodülatör vektörleri tasarlamaya ve klonlamaya başlamak için. Bu protokol, bir onkolitik kızamık aşısı vektörü gelişimi için belirli adımları açıklar, bir bispesifik T hücre engager kodlama. Kızamık virüslerini cDNA'dan kurtarmak için, transfeksiyon plakasından 24 saat önce kızamık virüsü üreticisi hücreleri 6 duvar plakasında eşit olarak.Tohum 200, 000 hücre 2 mililitre DMEM iyi başına yüzde 10 FBS içeren transfeksiyon sırasında yüzde 65-75 birleşme elde etmek. Hücreleri transfect için kullanılacak kızamık virüsü antigenomkodlama rekombinant DNA 5 mikrogram karıştırın. Uygun plazmidler ve toplam 200 mikrolitre DMEM hacminde floresan muhabir.Karışıma 18,6 mikrolitre lipozomal transfeksiyon reaktifi ekleyin ve hemen tüpü karıştırın. Bu transfection karışımını oda sıcaklığında 25 dakika kuluçkaya yatırın. MV üretici hücreleri transfect için 6 iyi plaka 65-75 yüzde birleşimi için yetiştirilen orta kaldırmak ve iyi başına mililitre Kanamisin başına yüzde 2 FBS ve 50 mikrogram ile DMEM 1.8 mililitre ekleyin.Sonra her iyi ve dikkatle girdap için dropwise transfection karışımı ekleyin. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ertesi gün orta 2 mililitre taze DMEM ile yüzde 2 FBS ve mililitre Kanamisin başına 50 mikrogram değiştirin ve orta sarı renk tarafından tanınan asidik olduğunda bunu tekrarlayın.Muhabir gen ekspresyonu ve senyiti oluşumu için hücreleri günlük gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. 20 veya daha fazla hücreden oluşan büyük sintia görünür olduğunda veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde virüs hasat. 24 saat önce beklenen hasat tohumu yaklaşık 1.5 milyon MV üretici hücreleri 12 mililitre DMEM ile 10 santimetre lik yemeklerde yüzde 10 FBS ile virüs aşılama sırasında yüzde 65-75 biraraya ulaşmak için.Virüs progyny toplamak için dikkatle transfected hücreleri ile 6 duvar plakasından yapışık üretici hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Kazınmış hücreleri içeren ortamı bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre enkazkaldırmak için 5 dakika için en az 2500 kez G ve 4 derece santigrat için santrifüj.Santrifüjden sonra hücresiz süpernatant ile serumsuz orta ile inokül hazırlamak için 4 mililitrelik son bir hacim de karıştırın. MV üretici hücreleri ile 10 santimetre lik çanak tan orta çıkarın ve hücrelere inoculum ekleyin. 37 santigrat derece ve yüzde 5 karbondioksit en az 2 saat kuluçka.Kuluçka dan sonra bir gecede yüzde 10 FBS ve kuluçka hücreleri ile 6 mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra 12 mililitre taze DMEM ile orta yı değiştirin ve yüzde 10 FBS ve 37 santigrat derece ve hasat kadar yüzde 5 karbondioksit inkübat. Hücreleri günde en az iki kez gözlemleyin.Membran bozulması görünür hasat virüs haline geldiğinde senyiti patlamadan önce. Hasat için ilk pasaj plaka supernatant kaldırmak ve serum serbest orta 600 mikrolitre ekleyin. Sonra hücreleri kazımak ve temiz bir tüp e aktarmak için bir hücre kaldırıcı kullanın.Bundan hemen sonra sıvı nitrojen virüs süspansiyon dondurma ve en az 24 saat boyunca 80 santigrat derecede saklayın iyice donma sağlamak için. 96 duvar plakaları kullanarak aliquot başına octuplicates virüs stoklarının titrelerini belirlemek için. Önce T75 hücre kültüründeki üretici hücrelerini 50 mililitrelik konik tüpe çekin.Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunu DMEM'de mililitre başına yüzde 10 FBS ile 150,000 hücreye ayarlayın. 96 duvar plakası kuyusu başına yüzde 10 FBS ile 90 mikrolitre DMEM ekleyin. Daha sonra plakanın ilk sütunundaki 8 kuyuya virüs stokunun bir aliquot'undan 10 mikrolitre ekleyin.En az 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Her kuyunun 10 mikrolitresini birinci sütundan ikinci sütuna aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın. Her seyreltme adımı için taze pipet ipuçları kullanarak virüsün seri on kat seyreltme elde etmek için her sütun için bu tekrarlayın.Son sütunun her kuyudan 10 mikrolitre atın. Her iyi hiçbir hücre kümeleri olduğundan emin olmak için mililitre başına 150, 000 hücre ile hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. 37 derecede kuluçka, 48 saat boyunca %5 karbondioksit.Işık mikroskobu kullanarak syncytia olup yok. Görünür syncytia içeren en yüksek seyreltme faktörü ile sütunun her kuyuda sayma syncytia. Floresan muhabiri kodlayan virüsler için, syncytia floresan mikroskopisi kullanılarak sayılabilir.Kızamık virüsü çoğaltma kinetiğinin analizi için enfeksiyon tohumundan bir gün önce 100, 1 mililitre DMEM'de 000 vero hücre ile 12 duvar plakasında yüzde 10 FBS ile ilgi nin her zaman için en az 2 kuyu vardır. Hücreleri enfekte etmek için virüsün ilgili miktarda içeren serum serbest orta 300 mikrolitre ile orta değiştirin. En az 2 saat boyunca 37 santigrat derecede ve yüzde 5 karbondioksitle kuluçkaya yat.İnoculumu çıkarın ve yüzde 10 FBS ile 1 mililitre DMEM ekleyin ve kuluçkaya devam edin. Enfeksiyon hasat viral progyny sonra ilgili zaman noktalarında doğrudan orta içine hücreleri kazıyarak. İçeriği her kuyudan ayrı bir tüpe aktarın.Sıvı nitrojende tonulayın ve titrasyona kadar 80 derecede saklayın ve el yazmasında açıklandığı gibi devam edin. LDH salınımı ile BTE indüklenen hücre aracılı sitotoksisite değerlendirilmesi başlamak için, ilk virüs enfekte hedef hücreleri tarafından ifade edilen gizli transgen ürünleri izole ve makalede açıklandığı gibi bağışıklık efektörü hücreleri izole. Daha sonra u-alt 96 duvar plakası tohum hedef hücreleri ve el yazması açıklandığı gibi örnekleri içerir.Daha önce izole edilmiş immünomodülatörleri istenilen konsantrasyonlarda ilgili numunelere ekleyin. İstenilen oranlarda bağışıklık sığınmacı hücreleri ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitre toplam hacmine orta ekleyin. 37 santigrat derece ve yüzde 5 karbondioksit istenilen daha önce belirlenen zaman dilimleri için kuluçka.Numune toplamadan 45 dakika önce, T max numuneleri ve ilgili orta kontrolleri içeren kuyulara 10 mikrolitre 10X Lysis Solüsyonu ekleyin ve kuluçkaya devam edin. Hücreleri 250 kez G'de 4 dakika santrifüj edin. Her kuyudan 50 mikrolitre süpernatantı düz bir alt 96 duvar plakasının kuyularına aktarın ve hücreleri aktarmayın.Üreticiye göre substrat çözeltisi hazırlandıktan sonra her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta veya T max örnekleri derin kırmızıya dönüşene kadar oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçka dan sonra her kuyuya 50 mikrolitre dur çözeltisi ekleyin.4000 kez G 1 dakika santrifüj ve sonra hava kabarcıkları kaldırmak için içi boş bir iğne kullanın. Optik emiciliği 490 nanometre olarak ölçün ve el yazmasında açıklandığı gibi hesaplayın. Değiştirilmemiş ve BTE kodlama onkolitik kızamık virüsleri vero hücreleri üzerinde karşılaştırıldığında vektörlerin büyüme eğrileri ile aşılama sonra benzer görünür.İnsan karsinoembriyonik antijeni ve MV reseptörleri CD46'yı inolasyon dan sonra ifade eden mc38 murine kolorektal karsinom hücrelerinde hücre canlılığı eğrileri, transgen kodlama virüsünün litik aktivitesinin minfir tümör hücre hattında geride kaldığını göstermektedir. Beş farklı seyreltmede BTE ile kuluçkaya yatan hedef antijen ekspreshücrelerinin akış sitometrisi, bte'nin hücreler tarafından konsantrasyona bağımlı bir şekilde bağlaştığını gösterdi. BTE ilişkili hücrelerin manyetik çekilmesinden sonra immünoblotta, BTE'leri hedeflemeyen hücreler kullanıldığında tespit edilebilir miktarda hücre bulunmadığını göstermiştir;oysa BTE örneklerini hedef alırken elüsyon fraksiyonunda bağlı hücreler mevcuttu.BTE aracılı hedef antijen spesifik ve murine T hücrelerinin konsantrasyona bağlı sitotoksisitesi temsili LDH salınım tahlili ile gösterilir ve mevcut örnekte referans hücrelere göre mililitre başına 1 mikrogram nispeten yüksek BTE konsantrasyonu nda yüzde 15 spesifik hücre öldürme elde edildiğini göstermektedir. Bu yordamı çalışırken, enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmek için hücreleri düzenli olarak izlemek için hatırlamak önemlidir. Zayıflatılmış olsa rekombinant kızamık aşısı suşları özellikle immüno-bastırılmış bireyler için tehlikeli olabilir unutmayın.Uygun biyo güvenlik prosedürlerini izleyerek maruz kalmaktan kaçının. Bu yöntemleri gerçekleştirmeden önce virüs lerle uğraşan bireyler aşılanmalıdır. Bu prosedürütaki viral ekspresyonun virüs etkileşimlerini ve terapötik etkilerini analiz etmek için daha fazla transgen ekspresyonu sağlanabilir.Bu tekniklerin geliştirilmesi biyoterapi alanında araştırmacılar için çok sayıda tümörlü varlıklarda lokal ifade immünomodülatörlerin etkilerini keşfetmek için yol açmıştır;In Vitro, In Vivo, ve ayrıca klinik çalışmalarda.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Polianhidrit IL-1α Nanopartiküllerinin In vivo Antitümör Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Defining Gene Functions in Tumorigenesis by Ex vivo Ablation of Floxed Alleles in Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

The development of new drugs that precisely target key proteins in human cancers is fundamentally altering cancer therapeutics. However, before these ...

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...