Name: localization of the locus coeruleus in the mouse brain
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain at JoVE.com

Ringraziamo Abigael Muchenditsi per la manutenzione della Colonia del mouse. Impiego della fonte del fotone avanzate all'Argonne National Laboratory è stata sostenuta da US Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto il numero di contratto: DE-AC02-06CH11357. Ringraziamo Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt per supporto utente e assistenza presso la fonte del fotone avanzate. Questo lavoro è stato finanziato dalla 2R01GM101502 di grant del National Institute of Health a SL.

Gli studi degli animali è stato approvato dalla Johns Hopkins University Animal Care e uso (ACUC) protocollo numero M017M385.
1. cervello affettare
<ol><li>Per immobilizzare, anestetizzare topi mediante l'applicazione di 3% isoflurane.<ol>
<li>Immergere un batuffolo di cotone con le gocce di isoflurane e inserirlo in un tubo del microcentrifuge da 15 mL. Posizionare il naso dell'animale nel tubo e consentirle di inalare l'isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia la mancanza di ...

<ol>
	<li>Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+of+central+norepinephrine+neuron+diversity.">Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity.</a> Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).</li><li>Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+mapping+of+the+noradrenergic+projection+from+the+locus+coeruleus.+A+model+for+studies+of+brain+neuronal+pathways.">Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways.</a> Neurology. 25, 223-233 (1975).</li><li>Olson, L., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+projections+from+the+locus+coeruleus+noradrealine+neurons:+the+cerebellar+innervation.">On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation.</a> Brain research. 28, 165-171 (1971).</li><li>Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+MCH-containing+fibers+in+the+feline+brainstem:+Relevance+for+REM+sleep+regulation.">Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation.</a> Peptides. , 50-61 (2018).</li><li>Semba, J., Toru, M., Mataga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+hour+rhythms+of+norepinephrine+and+serotonin+in+nucleus+suprachiasmaticus,+raphe+nuclei,+and+locus+coeruleus+in+the+rat.">Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat.</a> Sleep. 7, 211-218 (1984).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537, 357-362 (2016).</li><li>Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+turnover+of+norepinephrine+in+the+rat+cerebral+cortex+during+stress:+role+of+the+locus+coeruleus.">Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus.</a> Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).</li><li>Sara, S. J., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+sensory+responses+of+locus+coeruleus+neurons+in+the+behaving+rat:+implications+for+cognition.">Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition.</a> Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).</li><li>Markevich, V. A., Voronin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+reactions+of+sensomotor+cortex+neurons+to+stimulation+of+emotionally+significant+brain+structures].">Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures].</a> Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).</li><li>File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+role+of+the+locus+coeruleus+in+anxiety+and+agonistic+behaviour.">An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour.</a> Brain research. 169, 411-420 (1979).</li><li>Pamphlett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+environmental+toxicants+by+the+locus+ceruleus:+a+potential+trigger+for+neurodegenerative,+demyelinating+and+psychiatric+disorders.">Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders.</a> Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromelanin-sensitive+magnetic+resonance+imaging+features+of+the+substantia+nigra+and+locus+coeruleus+in+de+novo+Parkinson's+disease+and+its+phenotypes.">Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes.</a> European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).</li><li>Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+locus+coeruleus+catecholaminergic+neurons+in+the+chemosensory+control+of+breathing+in+a+Parkinson's+disease+model.">Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model.</a> Experimental neurology. , 172-180 (2017).</li><li>Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+loss+is+greater+in+the+locus+coeruleus+than+nucleus+basalis+and+substantia+nigra+in+Alzheimer+and+Parkinson+diseases.">Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases.</a> Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).</li><li>Chandley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+deficits+in+pontine+locus+coeruleus+astrocytes+in+men+with+major+depressive+disorder.">Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder.</a> Journal of psychiatry &amp; neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).</li><li>Bernard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+glutamate+signaling,+growth+factor,+and+glia+genes+in+the+locus+coeruleus+of+patients+with+major+depression.">Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression.</a> Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).</li><li>Gos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+locus+coeruleus+is+elevated+in+violent+suicidal+depressive+patients.">Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients.</a> European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).</li><li>Bielau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+evidence+for+impaired+nitric+oxide+signaling+of+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Brain research. 1459, 91-99 (2012).</li><li>Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+serotonin+imbalance+in+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).</li><li>Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Stress+Persistently+Alters+Locus+Coeruleus+Function+and+Anxiety-like+Behavior+in+Adolescent+Rats.">Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats.</a> Neuroscience. 373, 7-19 (2018).</li><li>Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dichotomy+in+spinal-+vs+prefrontal-projecting+locus+coeruleus+modules+splits+descending+noradrenergic+analgesia+from+ascending+aversion+and+anxiety+in+rats.">Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>McCall, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRH+Engagement+of+the+Locus+Coeruleus+Noradrenergic+System+Mediates+Stress-Induced+Anxiety.">CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety.</a> Neuron. 87, 605-620 (2015).</li><li>Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-Releasing+Factor+Mediates+Pain-Induced+Anxiety+through+the+ERK1/2+Signaling+Cascade+in+Locus+Coeruleus+Neurons.">Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons.</a> The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).</li><li>Simone, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethinyl+estradiol+and+levonorgestrel+alter+cognition+and+anxiety+in+rats+concurrent+with+a+decrease+in+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+locus+coeruleus+and+brain-derived+neurotrophic+factor+expression+in+the+hippocampus.">Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus.</a> Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons.">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nature. 13, 1526-1533 (2010).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone+administration+up-regulated+expression+of+norepinephrine+transporter+and+dopamine+beta-hydroxylase+in+rat+locus+coeruleus+and+its+terminal+regions.">Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions.</a> Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).</li><li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+regulates+rest-activity+cycles+through+the+locus+coeruleus-norepinephrine+system.">Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system.</a> Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).</li><li>Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+neurobiology+of+a+central+noradrenergic+nucleus.">The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus.</a> Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).</li><li>Ralle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+at+a+Single+Cell+Level:+intracellular+copper+trafficking+activates+compartment-specific+responses+in+hepatocytes.">Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Bonnemaison, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper,+zinc+and+calcium:+imaging+and+quantification+in+anterior+pituitary+secretory+granules.">Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules.</a> Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).</li><li>Nietzold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+X-Ray+Fluorescence+Data+Using+MAPS.">Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).</li><li>Vogt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPS:+A+set+of+software+tools+for+analysis+and+visualization+of+3D+X-ray+fluorescence+data+sets.">MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets.</a> J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+pathology+in+vulnerable+brain+regions+in+Parkinson's+disease.">Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease.</a> Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).</li><li>Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+dyshomoeostasis+in+Parkinson's+disease:+implications+for+pathogenesis+and+indications+for+novel+therapeutics.">Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics.</a> Clinical science. 130, 565-574 (2016).</li><li>James, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+preparation+methodologies+for+X-ray+fluorescence+microscopy+of+brain+tissue.">Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).</li></ol>

Corretto orientamento del campione è un passo cruciale in questo protocollo. Perché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per individuare LC (confine tra cervelletto e collicolo inferiore), è importante che le sezioni vengano allineati correttamente. Questo richiede cura nella corretta impostazione del cervello nella matrice affettatrice del cervello del mouse. Si consiglia di tagliare ~ 500 μm più tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo. L'errore...

Locus coeruleus (LC) è una regione importante nel tronco cerebrale e un importante sito di produzione di noradrenalina (NE)1. Il LC Invia proiezioni in tutto il cervello2 la corteccia, l'ippocampo e il cervelletto3 e regola i principali processi fisiologici, tra cui ritmo circadiano4,5, attenzione e memoria6, sforzo7, processi cognitivi8e commozione9,10. Disfunzione di LC è stata implicata in patologie neurologiche e neuropsichiatriche11, compreso Parkinson malattia12,13,14, Alzheimer malattia14, depressione15 ,16,17, disturbo bipolare18,19e l'ansia20,21,22,23, 24. tenuto conto di questi ruoli, analisi di LC sono fondamentale per studiare la sua funzione e disfunzione.
Topi sono ampiamente utilizzati per lo studio di processi fisiologici e patofisiologici. A causa del loro di piccola dimensione, il mouse LC ha un diametro medio di ~ 300 μm, che porta a difficoltà a individuare la struttura. Durante il sezionamento del cervello, la LC può facilmente essere perso in sezioni coronali o sagittale. Disponibili studi che descrivono identificazione di LC in animali non offrono un protocollo passo-passo che un non-esperti possono seguire1,25. Così, per offrire una guida per la localizzazione di LC, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per individuare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Il protocollo si applica attentamente controllato cervello rilevamento di sezionamento e immunohistochemical di DBH26,27, o in alternativa TH24, entrambi gli enzimi altamente arricchiti nell' LC28. LC è individuato da immunohistochemistry, fettine di cervello adiacente possono essere utilizzati per ulteriori studi, compreso analisi morfologiche e metaboliche, come pure gli studi di formazione immagine del metallo tramite fluorescenza a raggi x microscopia (XFM)29. Descriviamo XFM come esempio in questo protocollo (Figura 3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult mouse brain slicer matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged glass slides</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>29-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 505E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cutting blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MX35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Mini, 9.5cm</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>503241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)</td>
			<td>B. Eipper</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane (isofluorane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 1019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Micro Adson</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>501245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardset mounting media</td>
			<td>EM sciences</td>
			<td>17984-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Pascal</td>
			<td>LSM 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates, 24 wells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature compound (OCT)</td>
			<td>VWR/ tissue tech</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way disposable embedding molds</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Tech</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Amazon</td>
			<td colspan="2">ASIN: B000CMFJZ2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>14374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>344615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>ISBN: 978-0123694607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100 (to prepare PBSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralene thin film for XRF</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of the locus coeruleus in the mouse brain

Locus coeruleus (LC) è un importante hub di norepinefrina producendo neuroni che modulano un numero di funzioni fisiologiche. Le anomalie strutturali o funzionali di LC parecchie regioni del cervello, compreso la corteccia, ippocampo e nel cervelletto di impatto e possono contribuire alla depressione, disturbo bipolare, ansia, così come la malattia di Parkinson e Alzheimer. Questi disturbi sono spesso associati con metallo disparità, ma il ruolo dei metalli in LC è solo parzialmente capito. Studi morfologici e funzionali di LC sono necessari per comprendere meglio le patologie umane e contributo dei metalli. I topi sono un modello sperimentale ampiamente usato, ma il mouse LC è piccolo (~0.3 mm di diametro) e difficile da individuare per un non-esperto. Qui, descriviamo un protocollo basato su immunohistochemistry passo-passo per localizzare la LC nel cervello del topo. Dopamina-β-idrossilasi (DBH) e in alternativa, tirosina idrossilasi (TH), entrambi gli enzimi altamente espressi in LC, sono usati come indicatori immunohistochemical nelle fette del cervello. Sezioni adiacenti alle sezioni contenenti LC possono essere utilizzati per ulteriori analisi, tra cui l'istologia per studi morfologici, test metabolici, così come formazione immagine di metallo da microscopia di fluorescenza di raggi x (XFM).

Cambiamenti nell'omeostasi del metallo (ad esempio Cu, Fe, Zn e Mn) sono spesso osservati in disordini neurologici, compreso i cambiamenti nel LC34,35. Così, determinazione dei livelli del metallo nel cervello è necessario per la comprensione dei meccanismi di malattia. Le sezioni di cervello generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di Cu e altri metalli a cristalli liquid...

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Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Locus coeruleus è un piccolo gruppo di neuroni coinvolti in una varietà di processi fisiologici. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di sezioni di cervello di topo per lo studio di proteine e metalli in questo nucleo.

Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

La disfunzione del locus coeruleus è stata implicata in disturbi neurologici e neuropsichiatrici, tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la depressione, il disturbo bipolare e l'ansia. Dati questi ruoli, l'analisi del locus coeruleus è fondamentale per studiarne la funzione e la disfunzione. Durante la sezione cerebrale del topo, il locus coeruleus può essere facilmente perso in sezioni coronali o sagittali a causa delle sue piccole dimensioni.Pertanto, per offrire una guida per la localizzazione del locus coeruleus, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per localizzare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni. Iniziare posizionando il cervello appena isolato di un topo anestetizzato e poi perfuso nel 4%PFA in un tubo da 50 millilitri. Incubare il cervello per 24 ore a quattro gradi Celsius.Utilizzare le forcep per trasferire il cervello in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 25 millilitri di soluzione di saccarosio al 30%. Incubarlo a quattro gradi Celsius per 48-72 ore fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo. Per incorporare la sezione del tronco encefalico, posizionare la sua superficie di taglio sul fondo di uno stampo di incorporamento e aggiungere un composto di temperatura di taglio ottimale per circondare il tronco encefalico.Congelare il cervello incorporato in un congelatore meno 80 gradi Celsius per almeno 12 ore fino a un ulteriore utilizzo. Posizionare lo stampo con il cervello nel criostato e incubarlo per diverse ore per regolare la sua temperatura a quella del criostato. Per esporre il blocco oct contenente il cervello, utilizzare una lama di rasoio per tagliare i quattro bordi dello stampo fino al fondo, quindi rimuovere lo stampo di incorporamento da esso.Utilizzare lamette da barba per rimuovere l'eccesso di OCT dalla superficie del blocco, assicurandosi di non toccare il cervello. Quindi montare il blocco OCT sul mandrino del criostato, esponendo la superficie tagliata del cervello verso la parte anteriore. Per regolare il cervello, orientare la superficie di taglio parallela alle lamette del criostato.Orientare correttamente il campione è un passo cruciale in questo protocollo. Poiché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per localizzare l'LC, come il confine tra cervelletto e collicolo inferiore, è importante che le sezioni siano allineate correttamente. Ciò richiede attenzione nell'impostare correttamente il cervello nella matrice dell'affettatrice cerebrale del mouse.Tagliare il cervello a partire dal midollo, tagliando le sezioni di 100 micrometri rostralmente. Una volta che il cervelletto e il tronco encefalico iniziano a tagliare come una fetta continua a livello del quarto ventricolo, inizia a raccogliere fette con uno spessore di 50 micrometri. Utilizzare le forcep per raccogliere ogni fetta cerebrale e posizionarla in un pozzo di una piastra di 24 po 'piena di PBS.Il locus coeruleus sarà più evidente in una fetta dove il cervelletto e il collicolo inferiore si incontrano a circa 5,52 millimetri posteriori di bregma. Il primo giorno, lavare le fette cerebrali nella piastra di 24 pozzi tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Quindi aggiungere lo 0,5%PBS con detersivo e permeabilizzarli a quattro gradi Celsius per 24 ore.Il giorno seguente, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD. Quindi aggiungere l'anticorpo primario a una diluizione da uno a 500 nello 0,5% di PBSD e incubare a quattro gradi Celsius per 18 ore. Il terzo giorno, lavare le fette tre volte per 10 minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi aggiungere l'anticorpo secondario con una diluizione da uno a 1000 nello 0,5%PBSD.Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi per cinque minuti in PBS. Coprire le sezioni utilizzando un supporto di montaggio rigido senza DAPI.Coprire con una copertura in vetro e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un microscopio confocale con impostazioni per rilevare il segnale dalla lunghezza d'onda di fluorescenza appropriata alle fette cerebrali dell'immagine. Dopo aver regolato il microscopio sul piano focale della fetta cerebrale, utilizzare 10 volte l'ingrandimento per scattare una singola immagine.Utilizzare il quarto ventricolo situato sotto il cervelletto e sopra pons e tronco encefalico per localizzare una possibile regione LC nella fetta cerebrale. Focus sui bordi laterali del quarto ventricolo e l'LC si posizionerà partendo dai bordi del quarto ventricolo e puntando verso la regione del tronco encefalico del pons. La distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, una proteina espressa nella LC, è stata valutata utilizzando questo protocollo al fine di studiare la morfologia LC e la densità neuronale.Un'altra proteina espressa nella LC, l'idrossilasi tirosina, ha anche mostrato un forte segnale fluorescente verde nelle fette cerebrali contenenti l'LC.I cambiamenti nell'omeostasi metallica sono spesso osservati nei disturbi neurologici, compresi i cambiamenti nel LC.In questo esempio, quando una fetta cerebrale tagliata attraverso l'LC è stata misurata per fosfato, potassio, zinco e rame, solo il rame ha mostrato un aumento specifico del segnale. Si consiglia di tagliare circa 500 micron in più di tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo e tagliare più sezioni del necessario, soprattutto se si esegue per la prima volta questo protocollo. Un attento studio delle immagini dell'atlante cerebrale prima della colorazione è molto utile.Una volta che l'LC si trova per immunoistochimica, le fette cerebrali adiacenti possono essere utilizzate per ulteriori studi, tra cui l'analisi morfologica e metabolica, così come studi di imaging metallico tramite microscopia a fluorescenza a raggi X. Le sezioni cerebrali generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di rame e altri metalli nella LC e confrontarli con i livelli nelle regioni al di fuori della LC, che è necessario per la comprensione del meccanismo della malattia. Ulteriori possibili applicazioni di questo protocollo includono il rilevamento dell'abbondanza e della distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, tirosina idrossilasi, e altre proteine espresse nella LC individualmente, o nei test di co-colorazione, studi sulla morfologia LC e sulla densità neuronale.

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