Name: localization of the locus coeruleus in the mouse brain
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00
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Agradecemos a Abigael Muchenditsi para el mantenimiento de la colonia de ratón. Uso de la fuente de fotones avanzado en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, con el número de contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova y Dr. Stefan Vogt para soporte a usuarios y asistencia en la fuente avanzada de fotones. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud beca 2R01GM101502 a SL.

Estudios de los animales fue aprobado por la Johns Hopkins University Animal cuidado y número de protocolo de uso (ACUC) M017M385.
1. cerebro de corte
<ol><li>Para inmovilizar, anestesiar ratones por la aplicación del 3% de isoflurano.<ol>
<li>Remoje una bola de algodón con gotas de isoflurano y colocar en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Colocar la nariz del animal en el tubo y deje que se inhale el isoflurano. Compruebe que la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a...

<ol>
	<li>Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+of+central+norepinephrine+neuron+diversity.">Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity.</a> Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).</li><li>Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+mapping+of+the+noradrenergic+projection+from+the+locus+coeruleus.+A+model+for+studies+of+brain+neuronal+pathways.">Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways.</a> Neurology. 25, 223-233 (1975).</li><li>Olson, L., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+projections+from+the+locus+coeruleus+noradrealine+neurons:+the+cerebellar+innervation.">On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation.</a> Brain research. 28, 165-171 (1971).</li><li>Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+MCH-containing+fibers+in+the+feline+brainstem:+Relevance+for+REM+sleep+regulation.">Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation.</a> Peptides. , 50-61 (2018).</li><li>Semba, J., Toru, M., Mataga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+hour+rhythms+of+norepinephrine+and+serotonin+in+nucleus+suprachiasmaticus,+raphe+nuclei,+and+locus+coeruleus+in+the+rat.">Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat.</a> Sleep. 7, 211-218 (1984).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537, 357-362 (2016).</li><li>Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+turnover+of+norepinephrine+in+the+rat+cerebral+cortex+during+stress:+role+of+the+locus+coeruleus.">Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus.</a> Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).</li><li>Sara, S. J., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+sensory+responses+of+locus+coeruleus+neurons+in+the+behaving+rat:+implications+for+cognition.">Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition.</a> Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).</li><li>Markevich, V. A., Voronin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+reactions+of+sensomotor+cortex+neurons+to+stimulation+of+emotionally+significant+brain+structures].">Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures].</a> Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).</li><li>File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+role+of+the+locus+coeruleus+in+anxiety+and+agonistic+behaviour.">An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour.</a> Brain research. 169, 411-420 (1979).</li><li>Pamphlett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+environmental+toxicants+by+the+locus+ceruleus:+a+potential+trigger+for+neurodegenerative,+demyelinating+and+psychiatric+disorders.">Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders.</a> Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromelanin-sensitive+magnetic+resonance+imaging+features+of+the+substantia+nigra+and+locus+coeruleus+in+de+novo+Parkinson's+disease+and+its+phenotypes.">Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes.</a> European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).</li><li>Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+locus+coeruleus+catecholaminergic+neurons+in+the+chemosensory+control+of+breathing+in+a+Parkinson's+disease+model.">Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model.</a> Experimental neurology. , 172-180 (2017).</li><li>Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+loss+is+greater+in+the+locus+coeruleus+than+nucleus+basalis+and+substantia+nigra+in+Alzheimer+and+Parkinson+diseases.">Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases.</a> Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).</li><li>Chandley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+deficits+in+pontine+locus+coeruleus+astrocytes+in+men+with+major+depressive+disorder.">Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder.</a> Journal of psychiatry &amp; neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).</li><li>Bernard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+glutamate+signaling,+growth+factor,+and+glia+genes+in+the+locus+coeruleus+of+patients+with+major+depression.">Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression.</a> Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).</li><li>Gos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+locus+coeruleus+is+elevated+in+violent+suicidal+depressive+patients.">Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients.</a> European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).</li><li>Bielau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+evidence+for+impaired+nitric+oxide+signaling+of+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Brain research. 1459, 91-99 (2012).</li><li>Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+serotonin+imbalance+in+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).</li><li>Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Stress+Persistently+Alters+Locus+Coeruleus+Function+and+Anxiety-like+Behavior+in+Adolescent+Rats.">Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats.</a> Neuroscience. 373, 7-19 (2018).</li><li>Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dichotomy+in+spinal-+vs+prefrontal-projecting+locus+coeruleus+modules+splits+descending+noradrenergic+analgesia+from+ascending+aversion+and+anxiety+in+rats.">Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>McCall, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRH+Engagement+of+the+Locus+Coeruleus+Noradrenergic+System+Mediates+Stress-Induced+Anxiety.">CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety.</a> Neuron. 87, 605-620 (2015).</li><li>Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-Releasing+Factor+Mediates+Pain-Induced+Anxiety+through+the+ERK1/2+Signaling+Cascade+in+Locus+Coeruleus+Neurons.">Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons.</a> The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).</li><li>Simone, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethinyl+estradiol+and+levonorgestrel+alter+cognition+and+anxiety+in+rats+concurrent+with+a+decrease+in+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+locus+coeruleus+and+brain-derived+neurotrophic+factor+expression+in+the+hippocampus.">Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus.</a> Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons.">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nature. 13, 1526-1533 (2010).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone+administration+up-regulated+expression+of+norepinephrine+transporter+and+dopamine+beta-hydroxylase+in+rat+locus+coeruleus+and+its+terminal+regions.">Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions.</a> Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).</li><li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+regulates+rest-activity+cycles+through+the+locus+coeruleus-norepinephrine+system.">Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system.</a> Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).</li><li>Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+neurobiology+of+a+central+noradrenergic+nucleus.">The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus.</a> Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).</li><li>Ralle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+at+a+Single+Cell+Level:+intracellular+copper+trafficking+activates+compartment-specific+responses+in+hepatocytes.">Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Bonnemaison, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper,+zinc+and+calcium:+imaging+and+quantification+in+anterior+pituitary+secretory+granules.">Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules.</a> Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).</li><li>Nietzold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+X-Ray+Fluorescence+Data+Using+MAPS.">Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).</li><li>Vogt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPS:+A+set+of+software+tools+for+analysis+and+visualization+of+3D+X-ray+fluorescence+data+sets.">MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets.</a> J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+pathology+in+vulnerable+brain+regions+in+Parkinson's+disease.">Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease.</a> Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).</li><li>Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+dyshomoeostasis+in+Parkinson's+disease:+implications+for+pathogenesis+and+indications+for+novel+therapeutics.">Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics.</a> Clinical science. 130, 565-574 (2016).</li><li>James, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+preparation+methodologies+for+X-ray+fluorescence+microscopy+of+brain+tissue.">Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).</li></ol>

Orientar adecuadamente la muestra es un paso crucial en el presente Protocolo. Porque estamos usando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC (límite entre cerebelo y colículo inferior), es importante alinear correctamente las secciones. Esto requiere cuidado en fijar adecuadamente el cerebro en la matriz de máquina de cortar de cerebro de ratón. Recomendamos cortar ~ 500 μm más tejido anterior y posterior al LC para evitar la falta del núcleo. El error más común es cort...

El locus coeruleus (LC) es una región importante en el médula oblonga y un sitio importante de producción de norepinefrina (NE)1. La LC envía proyecciones a lo largo de los2 del cerebro a la corteza, el hipocampo y el cerebelo3 y regula procesos fisiológicos importantes, incluyendo el ritmo circadiano4,5, atención y memoria6, tensión de7,8de procesos cognitivos y emoción9,10. Disfunción de la LC ha sido implicada en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos11, incluyendo Parkinson enfermedad12,13,14, enfermedad de Alzheimer14, depresión15 ,16,17y18,de trastorno bipolar19ansiedad20,21,22,23, 24. teniendo en cuenta estas funciones, análisis de LC es fundamental para estudiar su función y disfunción.
Ratones son ampliamente utilizados para estudios de procesos fisiológicos y patofisiológicos. Debido a su pequeño tamaño, el ratón LC tiene un diámetro promedio de ~ 300 μm, conduciendo a la dificultad para ubicar la estructura. Durante secciones de la cerebral, la LC puede perderse fácilmente en secciones coronales o sagitales. Descripción identificación de LC en los animales los estudios disponibles no ofrecen un protocolo paso a paso que un no experto puede seguir1,25. Así, para ofrecer una orientación para la localización de la LC, se describe un protocolo que hemos desarrollado para localizar la región en el cerebro de ratón para aplicaciones varias (figura 1, figura 2, figura 3). El protocolo aplica a detección de seccionamiento e immunohistochemical cerebro cuidadosamente controladas de DAP26,27, o alternativamente TH24, ambas enzimas altamente enriquecidos en el LC28. Una vez que la LC se encuentra por immunohistochemistry, rebanadas del cerebro adyacente pueden utilizarse para otros estudios, los análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios imagenológicos metal por rayos x fluorescencia microscopía (XFM)29. Describimos XFM como ejemplo en este protocolo (figura 3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult mouse brain slicer matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged glass slides</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>29-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 505E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cutting blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MX35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Mini, 9.5cm</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>503241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)</td>
			<td>B. Eipper</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane (isofluorane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 1019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Micro Adson</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>501245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardset mounting media</td>
			<td>EM sciences</td>
			<td>17984-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Pascal</td>
			<td>LSM 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates, 24 wells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature compound (OCT)</td>
			<td>VWR/ tissue tech</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way disposable embedding molds</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Tech</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Amazon</td>
			<td colspan="2">ASIN: B000CMFJZ2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>14374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>344615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>ISBN: 978-0123694607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100 (to prepare PBSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralene thin film for XRF</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of the locus coeruleus in the mouse brain

El locus coeruleus (LC) es un importante centro de norepinefrina produciendo neuronas que modulan varias funciones fisiológicas. Anormalidades estructurales o funcionales de LC afectan varias regiones del cerebro incluyendo la corteza, hipocampo y cerebelo y pueden contribuir a la depresión, trastorno bipolar, ansiedad, así como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Estos trastornos a menudo se asocian a misbalance metal, pero el papel de los metales en LC se entiende solamente parcialmente. Estudios morfológicos y funcionales de LC son necesarios para comprender mejor las patologías humanas y la contribución de metales. Los ratones son un modelo experimental utilizado, pero el ratón LC es pequeño (~0.3 mm de diámetro) y difíciles de identificar para un no experto. Aquí, describimos un protocolo de inmunohistoquímica-base paso a paso para localizar la LC en el cerebro de ratón. Dopamina-β-hidroxilasa (DBH) y alternativamente, la tirosina hidroxilasa (TH), ambas enzimas altamente expresadas en la LC, se utilizan como marcadores inmunohistoquímicos en rebanadas de cerebro. Secciones adyacentes a las secciones que contiene la LC pueden utilizarse para su posterior análisis, incluyendo histología para estudios morfológicos, pruebas metabólicas, así como la proyección de imagen de metal por microscopía de fluorescencia de rayos x (XFM).

Cambios en la homeostasis de metales (tales como Cu, Fe, Zn y Mn) a menudo se observan en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en la LC34,35. Así, determinar los niveles de metales en el cerebro es necesario para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las secciones de la cerebral generadas utilizando el protocolo descrito pueden utilizarse para cuantificar los niveles de Cu y otros metales en la LC y comparar...

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Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Locus coeruleus es un pequeño grupo de neuronas implicadas en una variedad de procesos fisiológicos. Aquí, describimos un protocolo para preparar secciones de cerebro de ratón para estudios de proteínas y metales en este núcleo.

Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Disfunción de locus coeruleus se ha implicado en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer, depresión, trastorno bipolar, y ansiedad. Dadas estas funciones, el análisis de locus coeruleus es crucial para estudiar su función y disfunción. Durante la sección del cerebro del ratón, el locus coeruleus se puede perder fácilmente en secciones coronales o sagitales debido a su pequeño tamaño.Así, para ofrecer orientación para la localización de locus coeruleus, describimos un protocolo que desarrollamos para localizar esta región en el cerebro del ratón para varias aplicaciones. Comience colocando el cerebro recién aislado de un ratón anestesiado y luego perfundido en 4%PFA en un tubo de 50 mililitros. Incuba el cerebro durante 24 horas a cuatro grados centígrados.Utilice fórceps para transferir el cerebro a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de 25 mililitros de 30% de solución de sacarosa. Incubarlo a cuatro grados centígrados durante 48 a 72 horas hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. Para incrustar la sección del tronco encefálica, coloque su superficie de corte en la parte inferior de un molde de incrustación y agregue un compuesto de temperatura de corte óptimo para rodear el tronco encefálica.Congele el cerebro incrustado en un congelador de menos 80 grados Celsius durante al menos 12 horas hasta su uso posterior. Coloque el molde con el cerebro en el criostato e inciba durante varias horas para ajustar su temperatura a la del criostato. Para exponer el bloque OCT que contiene el cerebro, utilice una cuchilla de afeitar para cortar los cuatro bordes del molde hasta la parte inferior, y luego despegue el molde incrustado de él.Usa cuchillas de afeitar para eliminar el exceso de OCT de la superficie del bloque, asegurándote de no tocar el cerebro. A continuación, monte el bloque OCT en el mandril del criostato, exponiendo la superficie de corte del cerebro hacia el frente. Para ajustar el cerebro, oriente la superficie de corte paralela a las cuchillas de afeitar del criostato.Orientar correctamente la muestra es un paso crucial en este protocolo. Debido a que estamos utilizando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC, como el límite entre el cerebelo y el colliículo inferior, es importante que las secciones se alineen correctamente. Esto requiere cuidado en establecer correctamente el cerebro en la matriz de la cortadora de cerebro del ratón.Recortar el cerebro comenzando en la médula, cortando secciones de 100 micrómetros rostralmente. Una vez que el cerebelo y el tronco encefálica comiencen a cortar como una rebanada continua a nivel del cuarto ventrículo, comience a recolectar rodajas con un grosor de 50 micrómetros. Use fórceps para recoger cada rebanada de cerebro y colóquela en un pozo de un plato de 24 pocillos lleno de PBS.El locus coeruleus será más notable en una rebanada donde el cerebelo y el colliículo inferior se encuentran unos con otros a unos 5,52 milímetros posteriores de bregma. El primer día, lave las rodajas cerebrales en la placa de 24 pozos tres veces durante cinco minutos cada una en PBS. A continuación, añadir 0.5%PBS con detergente y permeabilizarlos a cuatro grados Celsius durante 24 horas.Al día siguiente, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD. Luego agregue el anticuerpo primario a una dilución de uno a 500 en 0.5%PBSD e incubar a cuatro grados Celsius durante 18 horas. Al tercer día, lave las rodajas tres veces durante 10 minutos cada una con 0.5%PBSD, luego agregue el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 1000 en 0.5%PBSD.Envuelva la placa con papel de aluminio e incubar a cuatro grados Centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD, y luego durante cinco minutos en PBS. Cubra las secciones utilizando un medio de montaje duro sin DAPI.Cubra con una cubierta de vidrio y séquela durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un microscopio confocal con ajustes para detectar la señal de la longitud de onda de fluorescencia adecuada a las rebanadas cerebrales de imagen. Después de ajustar el microscopio al plano focal de la rebanada cerebral, utilice un aumento de 10 veces para tomar una sola imagen.Utilice el cuarto ventrículo situado debajo del cerebelo y por encima de pons y tronco encefálico para localizar una posible región LC en la rebanada cerebral. Concéntrese en los bordes laterales del cuarto ventrículo y la LC se ubicará comenzando desde los bordes del cuarto ventrículo y apuntando hacia la región del tronco cerebral. La distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, una proteína expresada en la LC, se evaluó utilizando este protocolo con el fin de estudiar la morfología LC y la densidad neuronal.Otra proteína expresada en la LC, la tirosina hidroxilasa, también mostró una fuerte señal fluorescente verde en las rebanadas cerebrales que contienen la LC.Los cambios en la homeostasis metálica se observan a menudo en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en el LC.In este ejemplo, cuando una rebanada cerebral cortada a través de la LC se midió para fosfato, potasio, zinc y cobre, sólo el cobre mostró un aumento específico de la señal. Recomendamos cortar alrededor de 500 micras más de tejido anterior y posterior a LC para evitar perder el núcleo, y cortar más secciones de las necesarias, especialmente si la primera vez realiza este protocolo. El estudio cuidadoso de las imágenes del atlas cerebral antes de la tinción es muy útil.Una vez que la LC se encuentra mediante inmunohistoquímica, las rebanadas cerebrales adyacentes se pueden utilizar para estudios adicionales, incluyendo análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios de imágenes metálicas a través de microscopía de fluorescencia de rayos X. Las secciones cerebrales generadas utilizando el protocolo descrito se pueden utilizar para cuantificar los niveles de cobre y otros metales en la LC y compararlos con los niveles en regiones fuera de la LC, que es necesario para la comprensión del mecanismo de la enfermedad. Otras posibles aplicaciones de este protocolo incluyen la detección de abundancia y distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, y otras proteínas expresadas en la LC individualmente, o en los ensayos de co-tinción, estudios de morfología LC y densidad neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Investigación

Neurociencias

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Actividad telomerasa en las diversas regiones del cerebro de ratón: La telomerasa no radiactivo Repetir Protocolo de Amplificación (TRAP) Ensayo

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...