Name: localization of the locus coeruleus in the mouse brain
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain at JoVE.com

Vi tackar Abigael Muchenditsi för underhåll av mus kolonin. Användningen av Advanced Photon källan vid Argonne National Laboratory stöddes av US Department of Energy, Office of Science, kontor av energi grundvetenskaperna, under kontraktsnummer: DE-AC02-06CH11357. Vi tackar Olga Antipova och Dr Stefan Vogt för användarstöd och hjälp vid Advanced Photon källan. Detta arbete finansierades av National Institute of Health grant 2R01GM101502 till SL.

Studier av djur godkändes av Johns Hopkins University djur vård och användning (ACUC) protokollnummer M017M385.
1. hjärnan skivning
<ol><li>För att immobilisera, söva möss genom tillämpning av 3% isofluran.<ol>
<li>Blöt en bomullstuss med droppar av isofluran och placera den i en 15 mL mikrocentrifug rör. Placera djurets näsa i röret och gör det möjligt att inhalera isofluran. Kontrollera för djup anestesi genom bristen på svar till tå-nypa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placera dj...

<ol>
	<li>Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+of+central+norepinephrine+neuron+diversity.">Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity.</a> Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).</li><li>Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+mapping+of+the+noradrenergic+projection+from+the+locus+coeruleus.+A+model+for+studies+of+brain+neuronal+pathways.">Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways.</a> Neurology. 25, 223-233 (1975).</li><li>Olson, L., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+projections+from+the+locus+coeruleus+noradrealine+neurons:+the+cerebellar+innervation.">On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation.</a> Brain research. 28, 165-171 (1971).</li><li>Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+MCH-containing+fibers+in+the+feline+brainstem:+Relevance+for+REM+sleep+regulation.">Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation.</a> Peptides. , 50-61 (2018).</li><li>Semba, J., Toru, M., Mataga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four+hour+rhythms+of+norepinephrine+and+serotonin+in+nucleus+suprachiasmaticus,+raphe+nuclei,+and+locus+coeruleus+in+the+rat.">Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat.</a> Sleep. 7, 211-218 (1984).</li><li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory.">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537, 357-362 (2016).</li><li>Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+turnover+of+norepinephrine+in+the+rat+cerebral+cortex+during+stress:+role+of+the+locus+coeruleus.">Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus.</a> Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).</li><li>Sara, S. J., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+sensory+responses+of+locus+coeruleus+neurons+in+the+behaving+rat:+implications+for+cognition.">Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition.</a> Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).</li><li>Markevich, V. A., Voronin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+reactions+of+sensomotor+cortex+neurons+to+stimulation+of+emotionally+significant+brain+structures].">Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures].</a> Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).</li><li>File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+role+of+the+locus+coeruleus+in+anxiety+and+agonistic+behaviour.">An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour.</a> Brain research. 169, 411-420 (1979).</li><li>Pamphlett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+environmental+toxicants+by+the+locus+ceruleus:+a+potential+trigger+for+neurodegenerative,+demyelinating+and+psychiatric+disorders.">Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders.</a> Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromelanin-sensitive+magnetic+resonance+imaging+features+of+the+substantia+nigra+and+locus+coeruleus+in+de+novo+Parkinson's+disease+and+its+phenotypes.">Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes.</a> European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).</li><li>Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+locus+coeruleus+catecholaminergic+neurons+in+the+chemosensory+control+of+breathing+in+a+Parkinson's+disease+model.">Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model.</a> Experimental neurology. , 172-180 (2017).</li><li>Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+loss+is+greater+in+the+locus+coeruleus+than+nucleus+basalis+and+substantia+nigra+in+Alzheimer+and+Parkinson+diseases.">Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases.</a> Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).</li><li>Chandley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+deficits+in+pontine+locus+coeruleus+astrocytes+in+men+with+major+depressive+disorder.">Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder.</a> Journal of psychiatry &amp; neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).</li><li>Bernard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+glutamate+signaling,+growth+factor,+and+glia+genes+in+the+locus+coeruleus+of+patients+with+major+depression.">Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression.</a> Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).</li><li>Gos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+locus+coeruleus+is+elevated+in+violent+suicidal+depressive+patients.">Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients.</a> European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).</li><li>Bielau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+evidence+for+impaired+nitric+oxide+signaling+of+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Brain research. 1459, 91-99 (2012).</li><li>Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+serotonin+imbalance+in+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder.">Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).</li><li>Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Stress+Persistently+Alters+Locus+Coeruleus+Function+and+Anxiety-like+Behavior+in+Adolescent+Rats.">Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats.</a> Neuroscience. 373, 7-19 (2018).</li><li>Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dichotomy+in+spinal-+vs+prefrontal-projecting+locus+coeruleus+modules+splits+descending+noradrenergic+analgesia+from+ascending+aversion+and+anxiety+in+rats.">Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>McCall, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRH+Engagement+of+the+Locus+Coeruleus+Noradrenergic+System+Mediates+Stress-Induced+Anxiety.">CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety.</a> Neuron. 87, 605-620 (2015).</li><li>Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticotropin-Releasing+Factor+Mediates+Pain-Induced+Anxiety+through+the+ERK1/2+Signaling+Cascade+in+Locus+Coeruleus+Neurons.">Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons.</a> The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).</li><li>Simone, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethinyl+estradiol+and+levonorgestrel+alter+cognition+and+anxiety+in+rats+concurrent+with+a+decrease+in+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+locus+coeruleus+and+brain-derived+neurotrophic+factor+expression+in+the+hippocampus.">Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus.</a> Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).</li><li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons.">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nature. 13, 1526-1533 (2010).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone+administration+up-regulated+expression+of+norepinephrine+transporter+and+dopamine+beta-hydroxylase+in+rat+locus+coeruleus+and+its+terminal+regions.">Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions.</a> Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).</li><li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+regulates+rest-activity+cycles+through+the+locus+coeruleus-norepinephrine+system.">Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system.</a> Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).</li><li>Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+coeruleus:+neurobiology+of+a+central+noradrenergic+nucleus.">The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus.</a> Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).</li><li>Ralle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+at+a+Single+Cell+Level:+intracellular+copper+trafficking+activates+compartment-specific+responses+in+hepatocytes.">Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Bonnemaison, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper,+zinc+and+calcium:+imaging+and+quantification+in+anterior+pituitary+secretory+granules.">Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules.</a> Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).</li><li>Nietzold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+X-Ray+Fluorescence+Data+Using+MAPS.">Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).</li><li>Vogt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPS:+A+set+of+software+tools+for+analysis+and+visualization+of+3D+X-ray+fluorescence+data+sets.">MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets.</a> J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).</li><li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+pathology+in+vulnerable+brain+regions+in+Parkinson's+disease.">Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease.</a> Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).</li><li>Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+dyshomoeostasis+in+Parkinson's+disease:+implications+for+pathogenesis+and+indications+for+novel+therapeutics.">Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics.</a> Clinical science. 130, 565-574 (2016).</li><li>James, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+preparation+methodologies+for+X-ray+fluorescence+microscopy+of+brain+tissue.">Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).</li></ol>

Korrekt orientera preparatet är ett avgörande steg i detta protokoll. Eftersom vi använder anatomiska funktioner av dorsala ytan av hjärnan för att hitta LC (gränsen mellan lillhjärnan och sämre colliculus), är det viktigt att avsnitten anpassas ordentligt. Detta kräver vård i korrekt inställning hjärnan in i matrisen mus hjärnan slicer. Vi rekommenderar att skära ~ 500 μm mer vävnad främre och bakre LC att undvika saknas kärnan. Det vanligaste misstaget är att skära alltför få sektioner som result...

I locus coeruleus (LC) är en viktig region i hjärnstammen och en större plats av noradrenalin (NE) produktion1. LC skickar projektioner i hela hjärnan2 till cortex, hippocampus och lillhjärnan3 och reglerar stora fysiologiska processer, inklusive dygnsrytmen4,5, uppmärksamhet och minne6, betona7, kognitiva processer8och känslor9,10. Dysfunktion i LC har varit inblandad i neurologiska och neuropsykiatriska störningar11, inklusive Parkinsons sjukdom12,13,14, Alzheimers sjukdom14, depression15 ,16,17, bipolär sjukdom18,19och ångest20,21,22,23, 24. med tanke på dessa roller, analys av LC är avgörande för att studera dess funktion och dysfunktion.
Möss används för studier av fysiologiska och patofysiologiska processer. På grund av sin storlek har musen LC en genomsnittlig diameter av ~ 300 μm, vilket leder till svårigheter att hitta strukturen. Vid hjärnan snittning, kan LC lätt kan missas i antingen koronalt eller sagittal sektioner. Tillgängliga studier som beskriver identifiering av LC i djur inte erbjuder en steg för steg-protokollet att en icke-expert kan följa1,25. Således, för att erbjuda vägledning för lokalisering av LC, beskriver vi ett protokoll som vi utvecklat för att hitta denna region i mus hjärnan för flera tillämpningar (figur 1, figur 2, figur 3). Protokollet gäller noggrant kontrollerad hjärnan snittning och immunhistokemisk detektion av DBH26,27, eller alternativt TH24, båda enzymer höganrikat i LC28. När LC ligger vid immunhistokemi, kan intilliggande hjärnan skivor användas för fortsatta studier, inklusive morfologiska och metabola analyser, liksom metall imaging studier via röntgen fluorescence mikroskopi (XFM)29. Vi beskriver XFM som exempel i detta protokoll (figur 3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult mouse brain slicer matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged glass slides</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>29-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 505E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat cutting blades</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MX35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Mini, 9.5cm</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>503241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)</td>
			<td>B. Eipper</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine &#946;-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50ml</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forane (isofluorane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 1019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Micro Adson</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>501245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardset mounting media</td>
			<td>EM sciences</td>
			<td>17984-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Pascal</td>
			<td>LSM 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates, 24 wells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature compound (OCT)</td>
			<td>VWR/ tissue tech</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way disposable embedding molds</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pencil brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Tech</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Amazon</td>
			<td colspan="2">ASIN: B000CMFJZ2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Antech Diagnostcs</td>
			<td>14374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>344615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>ISBN: 978-0123694607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100 (to prepare PBSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralene thin film for XRF</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>3525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of the locus coeruleus in the mouse brain

I locus coeruleus (LC) är en stor knutpunkt av noradrenalin producerande nervceller som modulerar ett antal fysiologiska funktioner. Strukturella eller funktionella avvikelser i LC påverkar flera hjärnregioner inklusive cortex, hippocampus och lillhjärnan och kan bidra till depression, bipolär sjukdom, ångest, samt Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom. Dessa besvär är ofta förknippade med metall misbalance, men rollen av metaller i LC är endast delvis förstås. Morfologiska och funktionella studier av LC behövs för att bättre förstå människors patologier och bidrag av metaller. Möss är en allmänt använd experimentell modell, men musen LC är små (~0.3 mm diameter) och svåra att identifiera för en icke-expert. Här beskriver vi ett stegvisa immunohistokemi-baserat protokoll för att lokalisera LC i mus hjärnan. Dopamin-beta-hydroxylas (DBH) och alternativt tyrosin hydroxylas (TH), båda enzymer som starkt uttryckt i LC, används som immunhistokemiska markörer i hjärnan skivor. Sektioner i anslutning till LC-innehållande sektioner kan användas för vidare analys, inklusive histologi för morfologiska studier, metabolisk kontroll, samt för metall imaging av X-ray fluorescensmikroskopi (XFM).

Förändringar i metall homeostas (t.ex. Cu, Fe, Zn och Mn) observeras ofta i neurologiska problem, inklusive ändringar i LC34,35. Således att fastställa metall nivåer i hjärnan är nödvändigt för förståelse av sjukdomsmekanismer. Avsnitten hjärnan som genereras med hjälp av beskrivna protokollet kan användas att kvantifiera nivåerna av Cu och andra metaller i LC och jämföra dem med nivåerna i regionerna utanför ...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain at JoVE.com

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

I locus coeruleus är ett litet kluster av nervceller som är inblandade i en mängd olika fysiologiska processer. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda mus hjärnan sektioner för studier av proteiner och metaller i detta nucleus.

Lokalisering i Locus coeruleus i mus hjärnan

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Dysfunktion av locus coeruleus har varit inblandad i neurologiska och neuropsykiatriska sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, depression, bipolär sjukdom och ångest. Med tanke på dessa roller, analys av locus coeruleus är avgörande för att studera dess funktion och dysfunktion. Under mus hjärnan sektionering, locus coeruleus kan lätt missas i antingen koronal eller sagittal sektioner på grund av sin ringa storlek.Således, att erbjuda vägledning för lokalisering av locus coeruleus, beskriver vi ett protokoll som vi utvecklat för att lokalisera denna region i musen hjärnan för flera tillämpningar. Börja med att placera nyisolerad hjärna av en sövd och sedan perfused mus i 4%PFA i en 50-milliliter rör. Inkubera hjärnan i 24 timmar vid fyra grader Celsius.Använd tuppar för att överföra hjärnan till en 50-milliliter koniska rör fylld med 25 milliliter av 30%sackaros lösning. Inkubera den i fyra grader Celsius i 48 till 72 timmar tills hjärnan sjunker till botten av röret. För att bädda in hjärnstammen avsnitt, placera sin skurna yta på botten av en inbäddning mögel, och lägga till optimal skärtemperatur förening att omge hjärnstammen.Frys den inbäddade hjärnan i en minus 80 grader Celsius frys i minst 12 timmar tills vidare användning. Placera formen med hjärnan i kryostaten och inkubera den i flera timmar för att justera sin temperatur till kryostaten. För att exponera OCT blocket som innehåller hjärnan, använd ett rakblad för att skära de fyra kanterna på formen hela vägen till botten, och sedan skala bort inbäddning mögel från den.Använd rakblad för att ta bort överskott av OCT från ytan av blocket, se till att inte röra hjärnan. Montera sedan OCT-blocket på cryostats chuck och exponera hjärnans snittyta mot framsidan. För att justera hjärnan, orientera snittytan parallellt med kryostatens rakblad.Korrekt orientering av exemplaret är ett avgörande steg i detta protokoll. Eftersom vi använder anatomiska funktioner i hjärnans dorsala yta för att lokalisera LC, såsom gräns mellan lillhjärnan och underlägsna colliculus, är det viktigt att sektionerna anpassas ordentligt. Detta kräver vård i korrekt inställning hjärnan i musen hjärnan utsnitt matris.Trimma hjärnan början vid medulla, skära 100-mikrometer sektioner rostrally. När lillhjärnan och hjärnstammen börjar skära som en kontinuerlig skiva i nivå med fjärde ventrikeln, börja samla skivor på 50-mikrometer tjocklek. Använd tedr i att samla varje hjärna skiva och placera den i en brunn av en 24-väl platta fylld med PBS.Den locus coeruleus kommer att vara mest märkbar i en skiva där lillhjärnan och sämre colliculus möta varandra på ca 5,52 millimeter posterior av bregma. Den första dagen, tvätta hjärnan skivor i 24-brunnen plattan tre gånger i fem minuter vardera i PBS. Tillsätt sedan 0,5%PBS med tvättmedel och permeabilisera dem vid fyra grader Celsius i 24 timmar.På följande dag, tvätta skivorna tre gånger i fem minuter vardera med 0,5%PBSD. Tillsätt sedan den primära antikroppen vid en utspädning av en till 500 i 0,5%PBSD och inkubera vid fyra grader Celsius i 18 timmar. På den tredje dagen, tvätta skivorna tre gånger i 10 minuter vardera med 0,5%PBSD, tillsätt sedan den sekundära antikroppen vid en utspädning av en till 1000 i 0,5%PBSD.Linda plattan med aluminiumfolie och inkubera i fyra grader Celsius i 16 timmar. Efter inkubationen, tvätta skivorna tre gånger i fem minuter vardera med 0,5%PBSD, och sedan i fem minuter i PBS. Täck över sektionerna med hjälp av hårdsetängt monteringsmedium utan DAPI.Täck med ett glasöverdrag och torka i 30 minuter vid rumstemperatur. Använd sedan ett konfokalmikroskop med inställningar för att upptäcka signal från lämplig fluorescensvåglängd för att avbilda hjärnskivor. Efter justering av mikroskopet till fokalplanet i hjärnskivan, använd 10 gånger förstoring för att ta en enda bild.Använd den fjärde ventrikeln som ligger under lillhjärnan och ovanför pons och hjärnstammen för att lokalisera en möjlig LC-region i hjärnskivan. Fokusera på de laterala kanterna på den fjärde ventrikeln och LC kommer att vara placerad med början från kanterna av den fjärde ventrikeln och pekar mot pons hjärnstammen regionen. Intracellulär fördelning av dopamin beta-hydroxylase, ett protein uttryckt i LC, bedömdes med hjälp av detta protokoll i syfte att studera LC morfologi och neuronal densitet.Ett annat protein som uttrycks i LC, tyrosin hydroxylas, visade också en stark grön fluorescerande signal i hjärnan skivor som innehåller LC.Förändringar i metall homeostas observeras ofta i neurologiska sjukdomar, inklusive förändringar i LC.In detta exempel, när en hjärna skiva skär genom LC mättes för fosfat, kalium, zink och koppar, endast koppar visade en specifik ökning av signalen. Vi rekommenderar att skära runt 500 micron mer vävnad främre och bakre till LC för att undvika att missa kärnan, och skära fler avsnitt än nödvändigt, särskilt om första gången utför detta protokoll. Noggrann studie av hjärnan atlas bilder före färgning är till stor hjälp.När LC är beläget av immunohistokemi, kan intilliggande hjärnskivor användas för ytterligare studier, inklusive morfologisk och metabolisk analys, samt metallbildande studier via röntgenfluorescensmikroskopi. Hjärnan avsnitt som genereras med hjälp av det beskrivna protokollet kan användas för att kvantifiera nivåerna av koppar och andra metaller i LC och jämföra dem med nivåerna i regioner utanför LC, vilket är nödvändigt för förståelse av sjukdomsmekanism. Ytterligare möjliga tillämpningar av detta protokoll inkluderar detektion av överflöd och intracellulär fördelning av dopamin beta-hydroxylas, tyrosinhydroxylas, och andra proteiner uttryckta i LC individuellt, eller i co-färgning assays, studier av LC morfologi och neuronal densitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulär Viral Injektion av neonatal mus hjärnans för långlivade och Utbredd neuronal Transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerasaktivitet i de olika regionerna i Mouse Brain: Ej Radioaktiv Telomeras Upprepa Amplification Protocol (TRAP) analys

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Villkorlig Genetisk transsynaptisk Tracing i embryonal Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion av oligomera amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live avbildning av ependymala Cilia i de laterala ventriklama i mushjärna

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Storskaliga tredimensionell avbildning av cellulära organisation i mus hjärnbarken

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantifiera heterogen fördelning av ett Synaptic Protein i mus hjärnan med hjälp av immunofluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...